用绿色荧光蛋白融合蛋白直接观察蛋白激酶Cγ亚种在活细胞中的易位

细胞培养

COS-7和NIH3T3细胞购自日本筑波市的Riken细胞库。小鼠神经母细胞瘤×神经胶质瘤混合细胞（NG 108-15细胞）获自T.Amano博士（日本东京三菱化成生命科学研究所）。稳定表达代谢型谷氨酸受体1的CHO细胞（CHO/mGluR1细胞）(Tanabe等人，1992年)这是Nakanishi博士（日本京都京都大学医学院生物科学系）赠送的礼物。COS-7细胞在含有25 mM葡萄糖的二甲醚中培养，二甲醚用44 mM NaHCO缓冲_三并在含有5%CO的增湿大气中补充10%FBS₂37°C时。NG 108-15细胞在与COS-7细胞相同的条件下培养。NIH3T3细胞在补充有10%小牛血清而不是FBS的DME中培养。CHO/mGluR1细胞按说明培养(Tanabe等人，1992年). 所有培养基均添加青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml），所用的FBS未经热灭活。

γ-PKC–GFP融合蛋白质粒的构建

含有GFP cDNA的质粒（pGFP 10.1）由D.C.Prasher博士（纽约哥伦比亚大学）捐赠(Prasher等人，1992年). 以pGFP10.1为模板，通过PCR获得了编码GFP的cDNA片段，该片段在5′端具有HindIII位点，在3′端具有EcoRI位点。所用的正、反义引物分别为5′-TTAAGCTTTATGGTGAGAGCCAGGAG-3′和5′-CCGAATTTACTGTACAGCTCCAT-3′。从λCKRγ1的cDNA克隆中获得大鼠γ-PKC cDNA(Ono等人，1988年一 ). 用EcoRI消化后，将编码大鼠γ-PKC的插入片段亚克隆到哺乳动物细胞表达质粒pTB 701中(Ono等人，1988年一 )（指定为BS 55）（图。​（图1）。1). 以BS55为模板，PCR扩增出5′端有EcoRI位点，3′端有HindIII位点的γ-PKC cDNA片段。所用的正、反义引物分别为5′-TTGGAATTCGGCGTCTGG-3′和5′-TTAAGCTGTCGGTCTGGTCCTGGGCTGG-3′。GFP和γ-PKC的PCR产物一起亚克隆到pTB701（BS 186）的EcoRI位点（图。​（图1）。1).

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图1

γ-PKC-GFP融合蛋白及其突变体的构建。BS186是一种γ-PKC-GFP融合蛋白，其中γ-PKC（BS55）和GFP在γ-PKC-COOH末端结合。在γ-PKC的C1区，有两个富含半胱氨酸的序列与DG或佛波酯（例如TPA）相互作用。为了产生BS 238（C1突变），通过定点突变将两个富含半胱氨酸区域中的每个半胱氨酸残基替换为丝氨酸。BS 238的C1区域不再显示结合佛波酯的活性(Ono等人，1989年). γ-PKC的C2区，Ca²⁺如文中所述，为了生产BS 239（C2删除），删除了绑定域。

接下来，我们产生了一个编码突变γ-PKC-GFP的结构体，其C1区锌指样基序发生突变。我们使用pTB966，一种含有突变C1区cDNA的质粒，作为PCR模板(Ono等人，1989年). 据报道，从pTB966中提取的蛋白质对TPA没有结合活性(Ono等人，1989年). 我们还产生了一个突变体γ-PKC-GFP构建体，其C2区域被删除。为此，pTB971被用作PCR的模板(Ono等人，1989年). 来自pTB971的蛋白质不再具有钙结合活性²⁺(Ono等人，1989年). 以pTB966或pTB971为模板，用5′-TTGGAATTCGGCGTGTGCTCCTGG-3′和5′-TTGGATCTCTGCGCTGCCAG-3′的正义引物和反义引物进行PCR扩增，获得包含C1和C2区域的cDNA片段。这些PCR产物用EcoRI和BamHI酶切，然后亚克隆到BS 186中，其γ-PKC中的EcoRI/BamHI片段被删除。这些结构分别被指定为BS 238（C1突变）和BS 239（C2缺失）。所有PCR产物均通过测序进行验证。图中总结了三种γ-PKC-GFP蛋白（BS 186、BS 238和BS 239）的结构。​图11.

γ-PKC-GFP蛋白在培养细胞中的表达

通过电穿孔对COS-7细胞进行瞬时转染。编码每种类型γ-PKC-GFP或γ-PKC的质粒（～32μg）被转染到6×10⁶使用基因脉冲器的细胞（960μF，220 V；加州Hercules生物实验室）。利用Tfx脂质体转染NG-108、NIH3T3和CHO/mGluR1细胞-^TM（TM）-50 (Promega公司。（威斯康星州麦迪逊市）。转染后，细胞在30℃培养以获得GFP的最佳荧光。转染后2或3天检测γ-PKC-GFP的荧光。转染后3-5天进行实验。

NMDA受体和γ-PKC-GFP在COS-7细胞中的共表达

编码NMDARζ1和NMDARε1亚单位的小鼠cDNA，由Mishina博士（日本东京医学院东京大学药理学系）捐赠(池田等人，1992年；Meguro等人，1992年；Yamazaki等人，1992年)，亚克隆到表达质粒pTB 701中。如上所述，通过电穿孔将等量的γ-PKC-GFP、NMDARζ1和NMDARε1质粒（总计32μg）转染到COS-7细胞中。为了防止NMDA受体介导的细胞死亡，转染细胞在100μM AP-5（NMDA受体拮抗剂）的存在下培养，直到实验完成。

γ-PKC-GFP和γ-PKC的免疫印迹、激酶分析和免疫沉淀

γ-PKC-GFP（BS 186）或γ-PKC（BS 55）cDNA瞬时转染到6×10⁶电穿孔COS-7细胞。将相同数量的转染细胞分为两个直径为8cm的培养皿，在30°C下培养3d。在室温下用5μM TPA处理90min后，用PBS（−）收集细胞并离心。将细胞颗粒/培养皿重新悬浮在200μl匀浆缓冲液中（250 mM蔗糖、10 mM EGTA、2 mM EDTA、50 mM Tris/HCl、200μg/ml亮氨酸蛋白酶、1 mM PMSF，pH 7.4）。超声波处理后（UD-210 TOMY SEIKO Co.Ltd.，日本东京；输出3，负载50%，10倍，4°C），样品在19000℃下离心克在4°C下持续30分钟，收集上清液作为胞浆部分。用含有0.5%Triton-X的200μl匀浆缓冲液重新悬浮颗粒，并在如上所述的超声处理后用作颗粒部分。

为了进行免疫印迹，对每个组分的样品进行相同体积的10%SDS-PAGE，并将分离的蛋白质电泳转移到聚二氟乙烯（PVDF）过滤器上(Millipore公司。马萨诸塞州贝德福德）。通过与5%明胶孵育18小时来阻断PVDF过滤器上的非特异性结合位点。然后将PVDF过滤器与抗PKC-γ单克隆抗体（稀释1:2000）孵育(Hashimoto等人，1988年)或抗GFP多克隆抗体（稀释1:2000）（CLONTECH Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA）在25°C下保持30分钟。用含有0.03%Triton X-100的0.01 M PBS清洗后，将过滤器与山羊抗鼠IgG（用于γ-PKC抗体）或抗兔Ig G（用于GFP抗体）孵育15 min，然后与兔过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物孵育15min。三次冲洗后，用化学发光检测试剂盒（ECL；阿默沙姆（英国白金汉郡）。

如前所述，对COS-7细胞中表达的γ-PKC、γ-PKC-GFP及其突变体进行激酶分析(Kikkawa等人，1983年). 通过测量加入³²Pi从[γ]进入小牛胸腺H1组蛋白-³²P] 含有8μg/ml磷脂酰丝氨酸（PS）、0.8μg/ml二醛（DO）和0.5 mM Ca的ATP²⁺在存在0.5 mM EGTA而不是PS、DO和Ca的情况下测量基础活性²⁺.

为了免疫沉淀γ-PKC-GFP和γ-PKC，在直径为8 cm的培养皿中用1 ml含有1%Triton X-100的匀浆缓冲液收集转染细胞，并用移液管进行匀浆。19000离心机之后克将上清液与抗γ-PKC单克隆抗体在4°C下旋转5分钟，然后与蛋白A–Sepharose再旋转30分钟。样品在2000年离心克在4°C下保持5 min，并用PBS（−）洗涤三次颗粒。最后，如上所述，使用10μl悬浮颗粒和50μl PBS（−）进行激酶测定。

γ-PKC-GFP易位的观察

在观察之前，将γ-PKC-GFP转染细胞铺在玻璃底培养皿（MatTek Corp.，Ashland，MA）上并培养至少16 h。对于COS-7细胞和CHO/mGluR1细胞，用正常的Hepes缓冲液替换培养基，该缓冲液由135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgCl组成₂，1.8 mM氯化钙₂，5 mM Hepes，10 mM葡萄糖，pH值7.3。必要时，氯化钙₂或氯化镁₂被淘汰。对于NG-108细胞，使用的缓冲液由以下成分组成：165 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl₂，1 mM氯化钙₂，5 mM Hepes，10 mM葡萄糖，pH 7.4。

使用共焦激光扫描荧光显微镜（LSM 410型反转；德国耶拿卡尔蔡司公司）在488-nm氩气激发下，使用515-nm-长通屏障过滤器监测γ-PKC-GFP的荧光。将各种高浓度刺激物直接应用于Hepes缓冲液中，以获得适当的最终浓度，从而触发γ-PKC-GFP的转移。为了观察NMDA诱导的易位，将NMDA在含有10μM甘氨酸且不含MgCl的培养皿中施用₂.诱导K⁺在NG-108细胞中去极化，缓冲液被交换为高K⁺-包含由52 mM NaCl、100 mM KCl、1 mM MgCl组成的缓冲液₂，10 mM氯化钙₂，5 mM Hepes，10 mM葡萄糖，pH 7.4。所有实验均在室温下进行。

TPA和A23187诱导γ-PKC-GFP易位

在转染COS-7细胞的胞体周围观察到γ-PKC-GFP的强荧光，在细胞核中观察到微弱荧光（图。​（图3，三,A类和B类). 5μM TPA激活γ-PKC-GFP后，荧光明显从细胞质转移到细胞膜。用TPA治疗后10分钟开始移位，60分钟完成移位（图。​（图3三 A类). TPA处理后，荧光在质膜上停留至少90分钟，并且没有回到被测细胞的细胞质中。细胞核中的γ-PKC-GFP似乎没有移位。在37°C下进行实验时，TPA诱导的γ-PKC-GFP易位发生得更快（图。​（图3三 B类,上部记录道). 在用较低浓度的TPA（200nM）处理后10分钟，易位完成。相反，500 nM的非活性佛波酯4α-PDD未能在30分钟内诱导移位（图。​（图3三 B类,下部记录道).

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图3

福尔波酯诱导COS-7细胞中γ-PKC-GFP移位。(A类)室温下用5μM TPA改变COS-7细胞中表达的γ-PKC-GFP的荧光。在转染COS-7细胞的细胞质中观察到γ-PKC-GFP融合蛋白。5μM TPA激活PKC后，γ-PKC-GFP荧光从胞浆向细胞膜明显移位。TPA治疗后60分钟内几乎完成移位。刺激前在Nomarski干涉显微镜下拍摄了相同的照片，并显示在左上角。(B类)在37°C下，200 nM TPA和500 nM 4α-PDD在COS-7细胞中表达的γ-PKC–GFP荧光的变化。在37°C下检测时，较低浓度的TPA（200 nM）诱导γ-PKC–GFP从细胞质转移到膜(上部记录道). TPA治疗后10分钟，易位发生更快，观察到完全易位。相反，在500 nM时，4α-PDD（一种非活性佛波酯）即使在37°C时也无法诱导γ-PKC-GFP的易位。棒材，10μm。

在80μM，A23187时，Ca²⁺离子载体也产生γ-PKC-GFP易位，其时间进程与TPA诱导的易位有显著差异。加利福尼亚州²⁺离子载体诱导的易位快速且可逆（图。​（图44 A类). 刺激后仅30秒，γ-PKC-GFP的荧光发生短暂移位。第一阶段的易位很快被逆转。刺激后90秒，γ-PKC-GFP重新定位到细胞质。刺激后20分钟和45分钟观察到易位的第二和第三阶段，最后在A23187治疗后60分钟，γ-PKC–GFP在质膜上以斑片状小点的形式积聚（图。​（图44 A类,上部和中部记录道). 在图的下部轨迹中。​图44 A类图中显示了不同时间点细胞同一条线上的GFP强度分布。在30 s和45 min时，随着细胞边缘强度的增加，检测到γ-PKC-GFP向细胞膜的移位。在0和5 min时，获得了非常相似的GFP强度曲线，并且两个不同时间点之间的荧光衰减可以忽略不计。

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图4

钙²⁺离子载体诱导COS-7细胞中γ-PKC-GFP易位。(A类)80μM A23187、Ca对COS-7细胞表达的γ-PKC-GFP荧光的影响²⁺电离层。A23187还将γ-PKC-GFP的荧光从胞浆转移到膜；然而，易位的时间进程与TPA诱导的时间进程有显著差异。钙²⁺离子载体诱导的易位快速且可逆(上部和中部记录道). 在较低的迹线中，显示了穿过细胞的同一条线上的GFP强度剖面。（测量线位于左上角的箭头之间。）易位表示为30秒和45分钟时细胞边缘荧光的增加。比较GFP强度的分布，在0和5分钟时获得了非常相似的分布，荧光的衰减可以忽略不计。(B类)A23187的γ-PKC-GFP易位并不总是可逆的。左细胞显示单向易位，而右细胞显示可逆易位，如A类单向易位比可逆易位更常见。γ-PKC-GFP最终在质膜和邻近细胞质中以斑片状小点的形式积聚。棒材，10μm。

A23187的γ-PKC-GFP易位并不总是可逆的（图。​（图44 B类,左侧单元格). 单向易位（图。​（图44 B类,左侧单元格)比可逆易位更常见（图。​（图44 B类,右单元格). 然而，γ-PKC-GFP总是以斑块状的小点聚集在质膜上（图。​（图44 B类). 低浓度（10μM）的A23187也表现出类似的效果（数据未显示）。

Thapsigargin对γ-PKC-GFP易位的影响

检查钙的影响²⁺从细胞内钙释放²⁺我们研究了抑制内质网Ca的thapsigargin对γ-PKC-GFP易位的影响²⁺-ATP酶和增加胞浆Ca浓度²⁺，关于γ-PKC-GFP易位。应用5μM thapsigargin可诱导荧光快速移位，该移位在刺激后1分钟内开始（图。​（图5）。5). 最后，如A23187诱导的移位所示，荧光在质膜上以斑片状小点的形式积聚。γ-PKC–GFP在核周也有积累。

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图5

Thapsigargin诱导γ-PKC-GFP易位。5μM thapsigargin，内质网钙的抑制剂²⁺-ATP酶，也诱导γ-PKC–GFP的快速易位。γ-PKC-GFP的荧光像A23187诱导的易位一样，以斑点状聚集。棒材，10μm。

钙的作用²⁺γ-PKC-GFP转运的螯合剂

阐明钙²⁺离子载体诱导的移位依赖于细胞内钙的增加²⁺浓度（[Ca²⁺]_我)，我们检查了钙的影响²⁺螯合剂对A23187诱导的易位作用。钙²⁺钙预处理完全阻断了离子载体诱导的移位²⁺螯合剂、2.5 mM EGTA和15μM BAPTA-AM（图。​（图6，6,上部记录道). 此外，钙处理逆转了A23187诱导的易位²⁺螯合剂刺激A23187后。γ-PKC–GFP的荧光部分返回细胞质（图。​（图6，6,下部记录道). 钙处理前后TPA诱导的移位均未受到抑制²⁺螯合剂（数据未显示）。

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图6

钙的作用²⁺螯合剂对A23187诱导的γ-PKC-GFP易位的影响。2.5 mM EGTA和15μM BAPTA-AM预处理完全阻断A23187（50μM）诱导的γ-PKC-GFP易位(上部记录道). 用2.5 mM EGTA和15μM BAPTA-AM处理，即使在A23187诱导的易位发生后，γ-PKC–GFP也会从膜重新翻译到胞质溶胶(下部记录道). 棒材，10μm。

转基因γ-PKC-GFP的免疫染色

已知PKC在调节域和催化域之间被蛋白酶（如钙蛋白酶）消化(Kishimoto等人，1983年)表明转位γ-PKC-GFP的荧光不能准确地揭示γ-PKC的定位。因此，我们使用单克隆抗γ-PKC抗体对转染细胞进行免疫染色，该抗体在转位完成后识别γ-PKC的调节域。如图所示。​图7，7，即使在TPA-或A23187诱导的易位完成后，γ-PKC-样Cy5荧光仍与GFP荧光共定位。这些结果表明，GFP的荧光显示了γ-PKC自身的定位。

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图7

γ-PKC-GFP荧光与γ-PKC-样免疫反应性的比较。用抗γ-PKC抗体对γ-PKC-GFP转染的COS-7细胞进行免疫染色，结果表明，即使在TPA-或A23187诱导的移位完成后，GFP荧光和γ-PKC-样免疫反应也有非常相似的定位。棒，10μm。

突变γ-PKC-GFP融合蛋白的易位

为了检测γ-PKC的C1和C2区域在γ-PKC-GFP易位中的意义，我们构建了突变的γ-PKC-GFP、BS 238（C1突变）和BS 239（C2缺失），如上所述（图。​（图1）。1). BS 238是结合TPA的C1区域的突变；因此，预计TPA不会激活它。事实上，TPA并没有诱导BS 238（C1突变）的易位，而A23187却诱导了（图。​（图88 A类). 加利福尼亚州²⁺与野生型γ-PKC-GFP（BS 186）相比，BS238的离子载体诱导易位不足（图。​（图88 A类和4A类). BS 239（C2缺失）是结合钙离子的C2区域的缺失突变。与BS 238相反，BS 239被TPA转运，但没有被A23187转运（图。​（图88 B类).

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图8

COS-7细胞中表达的突变γ-PKC-GFPs（BS 238和BS 239）的易位。(A类)BS 238（C1突变γ-PKC–GFP）的易位。5μM的TPA没有诱导BS238的易位，而50μM的A23187则诱导了BS238易位。与BS186（对照γ-PKC-GFP）相比，A23187诱导的BS238易位不足。(B类)BS 239的易位（C2缺失γ-PKC–GFP）。与BS 238相反，BS 239被5μM TPA易位，但没有被50μM A23187易位。棒材，10μm。

我们还检测了BS238和BS239的激酶特性。BS238的激酶活性依赖于钙²⁺（对照组的157.8±9.1%；在EGTA存在下测量对照激酶活性），但TPA未激活（对照组94.5±5.6%）。相反，BS239的激酶活性既不被钙激活²⁺（对照的100.4±5.6%）或TPA（对照的81.2±7.2%）。然而，经1μM staurosporine处理后，BS239的激酶活性降低至对照的27.2%±0.4%，而BS238的活性受到staurosoprine的轻度抑制（对照的70.9±14.5%）。

K（K）⁺去极化诱导转染NG108-15细胞γ-PKC-GFP转位

在生理条件下进一步检测γ-PKC-GFP蛋白的易位。研究电压门控钙离子的去极化和后续激活²⁺通道诱导γ-PKC易位，我们在NG108-15细胞中表达γ-PKC–GFP融合蛋白，这些细胞具有电压门控Ca²⁺通道(阿特拉斯和阿德勒，1981年). 细胞外K后⁺从5 mM升高到100 mM，γ-PKC–GFP的荧光迅速从胞浆转移到膜（图。​（图9）。9). 易位完成后，如A23187或thapsigargin诱导的易位所示，斑片状点状荧光积聚在细胞膜和胞浆中（图。​（图9）。9). 可逆易位，如图所示。​图3三 B类，也发生在其他测试细胞中（数据未显示）。K（K）⁺10μM尼卡地平或10μMω-芋螺毒素GVIA、L型和N型钙的阻滞剂可消除去极化诱导的易位²⁺通道，但不通过2μM河豚毒素⁺通道阻断器（未显示数据）。这些发现表明，钙离子触发了易位²⁺通过某种类型的电压门控Ca流入²⁺通道在NG 108-15细胞中表达。

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图9

K（K）⁺去极化诱导NG108-15细胞表达的γ-PKC-GFP易位。用高K替换外部溶液⁺-包含一个快速诱导的γ-PKC–GFP易位。γ-PKC-GFP的荧光在质膜和邻近细胞质上以斑片状斑点的形式积聚，如Ca²⁺离子载体诱导的易位。棒材，10μm。

NMDA受体介导的γ-PKC-GFP转位

通过受体介导的刺激进一步检测γ-PKC-GFP的易位。在共表达NMDA受体通道（ζ1和ε1亚单位）的COS-7细胞中，用1 mM NMDA加10μM甘氨酸处理可诱导γ-PKC-GFP轻微但显著的移位（图。​（图10）。10). 同时应用500μM AP-5（NMDA受体拮抗剂）阻断NMDA诱导的易位（图。​（图10）。10).

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图10

NMDA诱导COS-7细胞中与NMDA受体共存的γ-PKC-GFP易位。通过电穿孔将NMDARζ1和NMDARε1亚单位与γ-PKC-GFP共转染到COS-7细胞中。在不含镁的情况下，将1mM的NMDA用于细胞²⁺以及10μM甘氨酸的存在。NMDA诱导γ-PKC-GFP轻微但显著的易位。同时应用100μM AP-5和1 mM NMDA阻断NMDA诱导的γ-PKC-GFP易位。棒材，10μm。

mGluR1介导的γ-PKC-GFP转位

我们将γ-PKC-GFP转染到稳定表达mGluR1的CHO细胞中，以研究G蛋白偶联受体介导的γ-PKC易位。1 mM激活mGluR1受体反式-ACPD，一种mGluR1的激动剂，诱导γ-PKC-GFP的快速易位，并在20分钟内重新易位到细胞质（图。​（图11）。11). 同时应用mGluR1拮抗剂2.5 mM RS-MCPG，完全阻断了mGluR2介导的γ-PKC-GFP易位（图。​（图11）。11).

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图11

mGluR1介导的γ-PKC-GFP易位。如文中所述，通过脂质体感染将γ-PKC-GFP转染到稳定表达mGluR1的CHO细胞中。(上部记录道)1 mM的应用反式-ACPD可快速诱导γ-PKC-GFP从胞浆向细胞膜移位。荧光在20分钟内从细胞膜重新定位到细胞液(下部记录道)500μM MCPG与1 mM同时使用反式-ACPD完全阻断mGluR1介导的γ-PKC–GFP易位。棒材，10μm。

我们感谢Kikawa Ushio博士进行了许多有益的讨论。

这项工作得到了日本教育、科学、体育和文化部、山口代谢紊乱研究基金会和加藤纪念生物科学基金会的资助。