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.2022年3月4日；13(1):1172.
doi:10.1038/s41467-022-28831-6。

缺氧诱导的自噬需要ULK1的氧敏感甲基化

李静怡 # 1 2, 张涛（Tao Zhang） # 1 2, 陶仁 # 三, 廖晓宇 4, 郝一龙 5, Je Sun Lim（杰孙林） 6, 李宗浩 6 7, 米莉 8 9, 邵继春 1, 刘锐 10
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低氧诱导自噬需要ULK1的氧敏感甲基化

李静怡等。 国家公社. .

摘要

低氧是一种经常发生在实体组织中的生理应激。自噬是真核细胞中普遍存在的降解/循环系统，使细胞能够耐受多种应激源。然而，低氧条件下自噬启动的机制尚不清楚。在这里，我们表明精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）催化自噬起始蛋白ULK1在精氨酸170（R170me2s）处的对称二甲基化，该修饰被赖氨酸脱甲基酶5C（KDM5C）去除。尽管PRMT5介导的甲基化没有改变，但低氧水平会降低KDM5C活性并导致ULK1 R170me2s的积累。ULK1的二甲基化促进了T180的自磷酸化，这是ULK1活化的先决条件，随后导致Atg13和Beclin 1的磷酸化、自噬体的形成、线粒体清除和氧气消耗的减少。此外，ULK1 R170K突变体的表达会在缺氧条件下损害细胞增殖。本研究确定ULK1的氧敏感甲基化通过促进自噬诱导在低氧应激适应中发挥重要作用。

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数字

图1
图1。低氧诱导自噬需要ULK1 R170me2s。
一,c（c）–如果,小时用所示抗体进行免疫印迹。一LN229、Huh7和HOK细胞与1%氧气孵育。b条用LC3–GFP表达的LN229细胞与1%氧气孵育12 h.分析LC3–GFP点。比例尺，15 微米。数据代表平均值 ± SD来自三个独立实验。P（P）-值来自双面t吨-测试。c（c）WT和ULK1−/−MEF与1%氧气孵育12 小时。d日LN229、Huh7和HOK细胞与1%氧气孵育。e（电子）将LN229细胞与指示浓度的氧气孵育12 小时。如果将具有WT SFB-ULK1或SFB-ULK1 R170K重组表达的内源性ULK1-depleted LN229、Huh7和HOK细胞与1%氧气孵育12小时 h.进行链霉亲和素下拉。ULK1 shRNA靶向非编码区。外源性；内源性内源性。克用LC3–GFP质粒转染带有SFB标记的WT ULK1或SFB-ULK1 R170K重组表达的内源性ULK1-depleted LN229细胞。48 转染后h，细胞与1%氧气孵育12小时 h.分析LC3–GFP点。比例尺，10 微米。ULK1 shRNA靶向非编码区。数据代表平均值 ± SD来自三个独立实验。P（P）-值来自双面t吨-测试。小时,j指示细胞与1%氧气孵育12 h.进行免疫印迹(小时)。透射电镜分析超微结构(j)。装箱区扩大了。绿色箭头表示自噬体样液泡，红色箭头表示双层膜结构。原始图像的比例尺，2 微米；放大图像的比例尺，400 纳米。数据代表平均值 ± SD来自三个独立实验。P（P）-值来自双面t吨-测试。我用LC3–GFP质粒转染具有ULK1 R170K敲除蛋白表达的WT LN229细胞和LN229电池。48 转染后h，细胞与1%氧气孵育12小时 h.分析LC3–GFP点。数据代表平均值 ± SD来自三个独立实验。P（P）-值来自双面t吨-测试。比例尺，10 微米。源数据作为源数据文件提供。
图2
图2。ULK1 R170由PRMT5对称二甲基化，由KDM5C脱甲基。
一–小时用所示抗体进行免疫印迹。一将表达或不表达PRMT5 shRNA的LN229细胞与1%氧气孵育12 小时。b条LN229、Huh7或HOK细胞与1%氧气孵育12 h.使用抗PRMT5抗体进行免疫沉淀。c（c）将纯化的WT His-ULK1或His-ULK1 R170K蛋白与纯化的WT-Flag-PRMT5或Flag-PRMT5 R368A蛋白混合用于体外甲基化检测。d日用或不用200 用于12的mM IOX1 h、 然后在1%氧气下孵育12 小时。e（电子）LN229、Huh7或HOK细胞在常氧条件下培养。使用抗ULK1抗体进行免疫沉淀。如果将表达或不表达KDM5C shRNA的LN229和HOK细胞与1%氧气孵育12小时 小时。克表达His-ULK1的LN229在1%氧气下孵育12小时 h.拉下His-ULK1蛋白，将沉淀与纯化的WT-Flag-KDM5C或Flag-KDM5CH514A突变蛋白混合，以在常氧条件下进行体外脱甲基试验。小时表达His-ULK1的LN229在1%氧气下孵育12小时 h.将His-ULK1蛋白拉下，清洗并与纯化的WT-Flag-KDM5C蛋白混合，以便在指示的氧气浓度下进行体外脱甲基分析。我将纯化的Flag-KDM5C蛋白与ULK1 R170me2s肽混合，在存在指示浓度氧气的情况下进行体外脱甲基分析。数据代表平均值 ± SD来自三个独立实验。源数据作为源数据文件提供。
图3
图3。R170me2s通过促进ULK1 T180自身磷酸化来激活ULK1。
b条–e（电子）,小时–k个用所示抗体进行免疫印迹。一指示细胞在1%氧气下培养12 h.沉淀Flag-ULK1蛋白，并分析ULK1激酶活性。数据代表平均值 ± SD来自三个独立实验。P（P）-值来自双面t吨-测试。Bonferroni校正用于多假设校正。b条指示LN229细胞在1%氧气下孵育12 h.外源性；内源性内源性。c（c）将纯化的ULK1蛋白固定在小球上，并与纯化的His-PRMT5蛋白混合用于体外甲基化检测。清洗固定化的ULK1蛋白，并与纯化的GST-Atg13或His-Beclin 1蛋白混合，以进行体外激酶分析。d日表达Flag-ULK1的LN229细胞在1%氧气下孵育12小时 h.将Flag-ULK1蛋白拉下，洗涤并与纯化的WT His-KDM5C或His-KDM5C H514A蛋白混合，以在常氧条件下进行体外脱甲基分析。清洗ULK1沉淀物，并与纯化的GST-Atg13或His-Beclin 1蛋白混合，以进行体外激酶分析。e（电子）指示细胞在1%氧气下培养12 h.测定沉淀中VPS34的活性。数据代表平均值 ± SD来自三个独立实验。P（P）-值来自双面t吨-测试。如果指示细胞在1%氧气下培养12 h.分析EGFP-FYVE点状物的形成。比例尺，6 微米。数据代表平均值 ± SD来自三个独立实验。P（P）-值来自双面t吨-测试。克人类ULK1结构（PDB代码：4WNP）显示激活环域（黄色）。R170和T180的周围区域被装箱并放大。对于R170和T180的侧链，氮、氧和碳原子分别显示为紫色、红色和绿色。小时LN229细胞在1%氧气下培养。我指示细胞在1%氧气下培养12 小时。j,k个净化WT标志-ULK1(j)或/和标志-ULK1 R170K(k个)蛋白质接受His-PRMT5蛋白介导的体外甲基化试验和体外自磷酸化试验。源数据作为源数据文件提供。
图4
图4。ULK1 R170me2s在缺氧条件下促进线粒体周转和肿瘤生长。
c（c）–e（电子）数据归一化为WT未治疗组。一,b条指示细胞在1%氧气下培养12 h.免疫荧光染色。装箱区域（比例尺，10 µm）被放大（比例尺，4 微米）(一)。对超微结构进行了分析。真空（比例尺，1.5 µm）标记星号放大（比例尺，500 纳米）(b条)。数据代表平均值 ± SD来自三个独立实验。P（P）-值来自双面t吨-测试。c（c）指示细胞在1%氧气下培养24小时 h.测量线粒体DNA（mtDNA）水平。数据代表平均值 ± SD来自三个独立实验。P（P）-值来自双面t吨-测试。d日用1%氧气刺激指示细胞18 h、 在常氧条件下立即测量细胞OCR。数据代表平均值 ± SD来自三个独立实验。P（P）-值来自双面t吨-测试。e（电子）,如果指示细胞在1%氧气下培养48小时 h.BrdU掺入分析(e（电子）)和台盼蓝排除试验(如果)已执行。数据代表平均值 ± SD来自三个独立实验。P（P）-值来自双面t吨-测试。克老鼠(n个==============================================================8） 将显示的LN229细胞颅内注射，并在环境大气或11%氧气压力下保存，然后处死以检查肿瘤生长情况（左面板）。图中显示了具有代表性的H&E染色冠状脑切片（右图）。数据代表平均值 ± 标准偏差。P（P）-数值来自双边t检验。Bonferroni校正用于多假设校正。小时小鼠肿瘤的免疫化学染色。比例尺，75 微米。我人类GBM组织的免疫化学染色。比例尺，100 微米。N、 坏死区域。j人GBM样本免疫化学染色的定量(n个==============================================================40).k个患者总生存时间的Kaplan–Meier图(n个==============================================================60）具有不同的ULK1 R170me2s水平。P（P）-值来自双边对数秩检验。我低氧下ULK1动态甲基化和自噬诱导模型。源数据作为源数据文件提供。
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