EMT方案对胰腺癌的转移是不必要的，但会导致胰腺癌的化疗耐受

组织学和组织病理学

组织学、组织病理学评分、Masson’s三色染色（MTS）和Picrosirius Red先前有描述^19,33将福尔马林固定的组织包埋在石蜡中，并以5μm的厚度切片。使用Gomori的毛染色试剂盒（38016SS2，徕卡生物系统公司）进行MTS。使用0.1%苦苷红（Direct Red80；Sigma）对胶原进行苦苷红染色，并用Weigert苏木精复染。切片也用苏木精和伊红（H&E）染色。组织病理学测量通过对H&E染色肿瘤进行评分来评估每种组织病理学表型的相对百分比：正常（非肿瘤）、PanIN、高分化PDAC、中分化PDAC，低分化PDAC和肉瘤样癌或坏死。当肿瘤组织学缺失或质量较差时，将小鼠排除在所有分析之外，并根据基因型信息进行盲法测定。肿瘤细胞侵入周围基质的组织学评分为0到2分，0表示无侵袭，2表示高度侵袭，侵袭是指肿瘤细胞在基质中扩散，远离明确定义的上皮“巢穴”。肝、肺和脾的H&E染色组织切片观察到显微镜下的转移。使用CK19和YFP免疫组织化学法确认阳性（组织中的一个或多个病灶）。该数据已作为列联表呈现(图2E)并表示为得分组织中阳性组织的数量。“任何”转移得分是指在得分的小鼠总数中，全身任何地方发现的继发性病变阳性的小鼠数量。

免疫组织化学和免疫荧光

组织在10%福尔马林中固定过夜，脱水，并嵌入石蜡中，然后处理5μm厚的切片进行分析。按照说明进行免疫组织化学分析³³对蜗牛和扭体进行1 mM EDTA+0.05%吐温20（pH 8.0）的热介导抗原回收1小时（压力锅），对Ki67进行10 mM柠檬酸盐缓冲液，对pH 6.0进行1小时（微波）或对所有其他抗体进行10分钟。主要抗体如下：αSMA（M0851，DAKO，1:400或ab5694，Abcam，1:400），裂解caspase-3（9661，细胞信号传递，1:200），CD3（A0452，DAKO，1:200，ENT1（LS-B3385，LifeSpan Bio.，1:100），E-cadherin（3195S，细胞信号，1:400），ENT2（ab48595，Abcam，1:200），Ki67（RM-9106，Thermo Scientific，1:400，1:500），和ZEB2（NBP1-82991，Novus，1:100）。吡莫硝唑加合物（HPI Inc.，1:50）或αSMA免疫组织化学染色切片用M.O.M试剂盒（宾夕法尼亚州西格罗夫Vector Laboratories，West Grove）封闭，并由DAB根据制造商的建议开发。或者，对于免疫荧光，使用与Alexa fluor-488或-594偶联的二级抗体或与FITC偶联的酪胺信号放大（TSA、PerkinElmer）对切片进行双重标记。对8μm厚O.C.T.培养基（TissueTek）嵌入的冰冻切片进行血统追踪（YFP阳性）EMT分析。切片进行αSMA染色（ab5694，Abcam，1:400），然后进行Alexa fluor-680结合二级抗体染色。在Leica DM1000光学显微镜或Perkin Elmer 3DHistotech幻灯片扫描仪上获得亮场图像。荧光图像是在蔡司Axio成像仪上获得的。M2或Perkin Elmer Vectra多光谱成像平台。使用NIH ImageJ分析软件（αSMA、匹莫哒唑、SLUG和CD31）对图像的阳性区域百分比进行量化，使用InForm分析软件（Ki-67和CD3）对阳性细胞百分比进行定量，或对阳性或阴性的强度进行评分（CK19、YFP、ZEB1、ZEB2、SOX4和Cleaved Caspase-3），或以1-3分制（E-cadherin）或1-4（ENT1、ENT2和CNT3）。

现场杂交

现场如前所述，在冰冻肿瘤切片上进行杂交（ISH）³⁴简而言之，将10μm厚的切片与反义探针杂交，以扭转1和斯奈伊1在65°C下过夜。杂交后，清洗切片，并在室温下用AP结合的绵羊抗DIG抗体（1:2000；Roche）孵育90分钟。三次清洗后，将切片置于BM紫色（罗氏）中培养，直到看到阳性染色。地高辛标记就地核糖探针由在体外使用PCR模板的转录方法（Promega和Roche）。使用以下引物生成模板PCR产物。扭转1; 正向（5'-CGGCCAGGTACATCGACTTC-3'）和反向（5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGATTTAAAAGTGCCCCACGC-3'）斯奈伊1：正向（5'-CAACCGTGCTTGCTGAC-3'）和反向（5'-TAATACGACTCACTATAGGAGACCTTAAAATGTAAACATCTTCTCC-3'）

基因表达谱

从KPC对照组的肿瘤中分离出总RNA；扭曲^cKO公司和KPC；蜗牛^cKO公司由TRIzol（15596026，Life Technologies）制造的小鼠（每组3只），并提交给MD Anderson癌症中心的微阵列核心设施。使用小鼠Ref6基因表达珠芯片（Illumina）进行基因表达分析。R Bioconductor的Limma包³⁵用于表达阵列的分位数归一化，并分析cKO和对照样品组之间的差异表达基因（p≤0.05，折叠变化≥1.2）。基因表达微阵列数据保存在GEO（登录号{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE66981”，“term_id”：“66981“}}GSE66981标准). 获得EMT程序的细胞中上调的基因预计在Twist中下调^cKO公司和蜗牛^cKO公司肿瘤与对照肿瘤的比较。

CTC分析

从KPC采集血液（200μL）；LSL-YFP和KPC；扭曲^cKO公司;LSL-YFP（癌细胞的ROSA-LSL-YFP谱系追踪）小鼠，并与10ml ACK裂解缓冲液（A1049201，Gibco）在室温下孵育以裂解红细胞。将细胞颗粒重新悬浮在含有PBS的2%FBS中，并分析YFP的数量⁺流式细胞术检测细胞（BD-LSRPortessa X-20细胞分析仪）。数据表示为YFP的百分比⁺门控细胞中的细胞，采集时分析了100000个细胞。还分析了全血细胞颗粒的表达喀斯特^G12D系列转录本，使用定量实时PCR分析（如下所述）。

原代胰腺癌细胞培养及分析

原代PDAC细胞系的衍生如前所述³⁶新鲜肿瘤用无菌刀片切碎，用dispase II（17105041，Gibco，4 mg/ml）/胶原酶IV（17104019，Gibco-，4 mg/ml）/RPMI在37°C下消化1 h，用70μm细胞过滤器过滤，再悬浮在RPMI/20%FBS中，然后接种在I型胶原涂层板上（087747，Fisher Scientific）。细胞保存在含有20%FBS和1%青霉素、链霉素和两性霉素B（PSA）抗生素混合物的RPMI培养基中。基于YFP或E-Cadherin表达（抗E-Cadherin抗体，50-3249-82，eBioscience，1:100），FACS进一步纯化癌细胞。随后使用BD FACSAria™II分选机（MD Anderson癌症中心南校区流式细胞术核心实验室）对分选的细胞进行扩增在体外所有研究都是在培养不到30代的细胞上进行的。由于这些是原代细胞系，因此没有进一步的鉴定方法，也没有进行支原体检测。

MTT和药物敏感性分析

按照制造商的建议，使用噻唑蓝溴化四唑蓝（MTT，M2128，Sigma）在37°C下孵育2小时，进行MTT测定以检测细胞增殖和活力。在药物治疗研究中，每个KPC、KPC的细胞系；蜗牛^cKO公司和KPC；扭曲^cKO公司用20μM吉西他滨（G-4177，LC实验室）或100μM厄洛替尼（5083S，NEB）治疗小鼠48小时。用MTT法检测来自KPC和KPC的细胞系的相对细胞活力；蜗牛^cKO公司和KPC；扭曲^cKO公司老鼠。N值定义为单个细胞系的生物复制。控制条件包括1%二甲基亚砜载体用于厄洛替尼。将相对吸光度标准化，并将吸光度或药物存活率的控制（时间0小时或溶媒治疗）分别任意设置为1%或100%。

定量实时PCR分析（qPCR）

按照指示使用PicoPure提取试剂盒（KIT0214，Arcturus）在ACK裂解后从全血细胞颗粒中提取RNA，或使用TRIzol（15596026，Life Technologies）从培养的原发性胰腺癌细胞中提取RNA。cDNA是使用TaqMan逆转录试剂（N8080234，Applied Biosystems）或高容量cDNA逆转录试剂盒（4368814，AppliedBiosystes）合成的。底漆喀斯特^G12D系列重组包括：喀斯特^G12D系列前进（5'ACTTTGGTGGTGGTGCGAGC 3'），喀斯特^G12D系列反向（5'TAGGGTCATACTCACCCACAA 3'）。1/ΔCt值表示喀斯特^G12D系列在指定的实验组中表达，对ΔCt进行统计分析。EMT相关基因的引物序列列于补充表1GAPDH被用作内部控制。数据显示为相对褶皱变化，并对ΔCt进行了统计分析。

肿瘤球试验

如前所述进行肿瘤球检测³³将200万培养的原代肿瘤细胞接种在一个低粘附性的100毫米培养皿（FB0875713，Fisherbrand）中，其中含有1%的胎牛血清、Dulbecco改良的Eagle's培养基和青霉素/链霉素/两性霉素。细胞孵育7天，并以100倍放大率对形成的球体进行计数。对三个、两个和三个细胞系进行KPC对照分析；扭曲^cKO公司和KPC；蜗牛^cKO公司分别对每个细胞系的五个视野进行量化。

MRI分析

如前所述，使用7T小动物MR系统进行MRI成像³⁷为了测量肿瘤体积，根据标准化强度在每个切片上盲绘可疑区域。通过添加划定的感兴趣区域（单位：mm）来计算体积²×1 mm切片距离。根据机构规定，没有一只小鼠的肿瘤负担超过1.5厘米直径。所有患有可测量肿瘤的小鼠均被纳入研究（参见扩展表3). 对小鼠进行两次成像，一次是在登记开始时（第0天），第二次是在20天后（第19天）。在终点（第21天）对幸存的动物实施安乐死，以进行组织学表征。

感谢Donna Lundy、Sujuan Yang、Zhenna Xiao、Rafael Deliz-Aguirre、Toru Miyake和Sara Lovisa的技术支持，感谢MD Anderson癌症中心南校区流式细胞术核心实验室的Karen M.Ramirez和Ryan Jewell的FACS分类和分析（Grant，NCI#P30CA16672）。以及Edward Chang扫描组织病理学标本的幻灯片。本研究主要由德克萨斯州癌症预防研究所和MD安德森癌症中心转移研究中心支持。R.K.实验室的研究也得到了NIH拨款P30CA016672、CA125550、CA155370、CA151925和CA163191的支持。V.S.L.实验室的研究得到了NIH/NCI CCSG新教师奖P30CA016672和UT MDACC Khalifa Bin Zayed Al-Nahya基金会的支持。