Tsc2 Is a Molecular Checkpoint Controlling Osteoblast Development and Glucose Homeostasis

Ryan C. Riddle; Julie L. Frey; Ryan E. Tomlinson; Mathieu Ferron; Yuanyuan Li; Douglas J. DiGirolamo; Marie-Claude Faugere; Mehboob A. Hussain; Gerard Karsenty; Thomas L. Clemens

doi:10.1128/MCB.00075-14

摩尔细胞生物学。2014年5月；34(10): 1850–1862.

数字对象标识：10.1128/MCB.00075-14号

预防性维修识别码：项目经理4019037

PMID：24591652

Tsc2是控制成骨细胞发育和葡萄糖平衡的分子检查点

瑞安·C·里德尔,^a、，^b条朱莉·弗雷,^一瑞恩·汤姆林森,^一马修·费隆,^c中，^d日李媛媛,^{e（电子）} 道格拉斯·迪吉罗拉莫,^一玛丽·克劳德·福格雷,^如果梅赫布布·侯赛因,^{e（电子）} 卡尔桑迪,^克和托马斯·克莱门斯^a、，^b条

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关联数据

补充资料: 补充材料

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摘要

成骨细胞中的胰岛素信号通过刺激骨钙素的生成调节全球能量平衡，骨钙素是一种促进胰岛素生成和作用的骨源性蛋白。为了确定成骨细胞中介导胰岛素对骨和能量代谢影响的信号通路，我们检测了结节性硬化症2（Tsc2）蛋白的功能，该蛋白是协调营养信号的重要靶点。这里，我们展示了Tsc2型成骨细胞中的mTOR组成性激活，Irs1不稳定，导致成骨细胞分化不良，并对胰岛素产生抵抗。年轻的Tsc2突变小鼠表现出低血糖，胰岛素和羧基化骨钙素水平升高。然而，随着年龄的增长，Tsc2突变体的代谢特征与成骨细胞中缺乏胰岛素受体的小鼠相似，包括外周肥胖、高血糖和胰腺β细胞质量下降。这些代谢异常似乎是由羧基化不足的骨钙素长期升高导致骨钙素受体下调和β细胞对这种激素脱敏所致。从Tsc2突变小鼠中去除单个mTOR等位基因后，骨骼和代谢异常基本恢复正常。总之，这些研究结果表明，Tsc2是成骨细胞中的一个关键检查点，成骨细胞需要适当的胰岛素信号，并可确保正常的骨获取和能量平衡。

简介

骨骼的形成、重塑和修复是由成骨细胞、破骨细胞和骨细胞通过一个能量消耗越来越大的过程来完成的(1). 为了协调骨的形成和重塑，骨细胞的活动受到错综复杂的局部因素和系统激素网络的调节。反过来，骨细胞分泌与其他组织沟通的因子，以确保全球能量利用的稳态调节(2,三). 例如，脂肪酸衍生激素瘦素影响食欲和能量消耗(4)并调节出生后的骨骼采集(5,6). 此外，成骨细胞和骨细胞产生并分泌激素，包括骨钙素，可增强胰岛素分泌和外周胰岛素敏感性(7).

最近的研究(8,9)已经证明成骨细胞中的胰岛素信号是正常骨获取和全身葡萄糖代谢协调所必需的。缺乏胰岛素受体的成骨细胞不能正常分化，这导致出生后骨骼获取减少。此外，成骨细胞中胰岛素信号的丢失通过增加骨钙素基因转录抑制剂FoxO1的活性抑制骨钙素的生成(10,11). 因此，向小鼠注射羧基化骨钙素不足（ucOCN）可以部分逆转成骨细胞中缺乏胰岛素受体的小鼠的代谢异常(8)，强烈建议存在成骨细胞-胰腺内分泌回路，其中ucOCN的骨生成确保前馈回路中适当的胰岛素生成。

胰岛素诱导的许多生理反应是由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通过Akt介导的(12)包括激活保守的Ser/Thr激酶mTOR，已知其调节细胞生长和营养代谢(13). Akt通过靶向由Tsc1和Tsc2组成的异二聚体复合物间接激活mTOR。Tsc2蛋白包含一个GTPase激活蛋白（GAP）结构域，该结构域对小G蛋白Rheb（脑中富含Ras同源物）具有GAP活性(14,15). Akt对Tsc2的磷酸化降低其抑制活性(16,17)并允许结合GTP的Rheb激活mTOR及其下游靶点，如核糖体S6激酶和真核生物起始因子4E-结合蛋白（eIF-4BP）。因此，Tsc复合体是靶细胞中胰岛素生成信号传导的关键控制点。

在这项研究中，我们在小鼠中使用遗传方法来检测Tsc2在成骨细胞的性能和代谢作用中的作用。我们发现，成骨细胞中Tsc2的缺失会导致组成型mTOR活性，这会导致过多成骨细胞产生的无组织骨骼的积累。年轻的Tsc2突变小鼠表现出低血糖，血清胰岛素水平升高，羧基化骨钙素水平升高，这与成骨细胞中缺乏胰岛素受体（IR）的小鼠相反。随着年龄的增长，成骨细胞中缺乏Tsc2的小鼠会出现葡萄糖不耐受，外周肥胖和其他代谢紊乱增加，这似乎是由于对血清骨钙素慢性升高的脱敏所致。我们的研究结果表明，在一个模型中，Tsc2信号复合物作为一个检查点，抑制胰岛素向mTOR的信号传导，以控制正常的成骨细胞发育和葡萄糖稳态。

材料和方法

动物模型。

约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准了所有涉及小鼠的程序。通过交叉Tsc2，成骨细胞中的Tsc2和mTOR被破坏^{flox/flox公司}小鼠(18)或mTOR^{flox/flox公司}小鼠(19)骨钙素-Cre（OC-Cre）转基因小鼠(20). Tsc2型^{flox/flox公司}在使用之前，将小鼠回交到C57BL/6背景下8代。两个mTOR的背景^{flox/flox公司}OC-Cre小鼠为C57BL/6。基因分型引物如补充材料中的表S1所示。使用基于PCR的策略和位于floxed等位基因两侧的引物对评估重组的特异性。

成像和组织形态计量学。

将雄性对照组和转基因小鼠处死于如下所示的年龄，并使用台式微断层成像系统（Skyscan 1172；Skyscan）评估骨体积。使用半自动方法（Osteoplan II；Kontron）对6周龄小鼠进行组织学分析，在处死前5天和3天注射1%（wt/vol）钙黄绿素(20). 所有骨结构分析均按照美国骨与矿物研究学会的建议完成(21,–23). 胰腺固定并染色，如前所述评估胰岛形态计量学(24). 根据标准技术，使用针对p70 S6K（Cell Signaling；2708）、Runx2（Santa Cruz；sc-10758）和Osterix（Santa Cruz；sc-133871）的抗体，以及来自Life Technologies的适当二级抗体，对骨骼组织进行免疫染色。

细胞培养研究。

通过连续消化1.8 mg/ml胶原酶从新生小鼠颅骨中分离成骨细胞。对于在体外基因缺失，含有漂浮等位基因的成骨细胞感染了编码Cre重组酶或绿色荧光蛋白（Vector Biolabs）的腺病毒(25). 所有实验均使用感染多重性（MOI）为100的感染，基因缺失通过PCR和免疫印迹证实。在用抗BrdU别藻蓝蛋白（APC）和7-氨基放线菌素D蛋白合成（Click-iT AHA蛋白合成；Life Technologies）和caspase活性（Promega）染色溴脱氧尿苷（BrdU）标记的细胞（10μM；BD Biosciences）后，通过流式细胞术评估成骨细胞增殖根据制造商的建议，使用商用套件进行评估。通过补充10%血清、10mMβ-甘油磷酸盐和50μg/ml抗坏血酸的最低必需培养基α修饰（αMEM）来诱导成骨细胞分化。根据标准技术进行碱性磷酸酶和茜素红S染色。根据标准技术培养Min6细胞。通过胶原酶消化和梯度离心分离原代β细胞(24).

基因表达研究。

使用TRIzol（Life Technologies）提取总RNA，使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）进行反向转录，并使用SYBR绿色PCR主混合物（Bio-Rad）通过实时PCR进行扩增。反应归一化为肌动蛋白水平。引物序列如补充材料中的表S1所示，并从PrimerBank获得(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html). 免疫印迹研究中使用的抗体来自细胞信号技术或Abcam。成骨细胞在隔夜缺乏血清后接受胰岛素治疗。在分化研究过程中，用培养基变化代替SP600125和雷帕霉素（Sigma-Aldrich）。使用市售试剂盒（Pierce）和Santa Cruz Biotechnology，Inc.的FoxO1抗体（H-128）进行染色质免疫沉淀（ChIP）测定(10). 使用SYBR绿色PCR主混合扩增沉淀DNA，并使用输入DNA作为模板将其归一化为反应。

代谢研究和生物测定。

血清钙使用偶氮胂钙法（Alfa Wasserman）进行评估，而血清磷使用磷钼酸盐-蓝晶石绿法（Biovision）进行测量。使用OneTouch Ultra手持式血糖监测仪（LifeScan）测量血糖，同时使用酶联免疫吸附试验（ELISA）（Alpco）测定血清胰岛素水平。对于葡萄糖耐量试验（GTTs），在隔夜禁食后腹腔注射葡萄糖（2 g/kg体重[BW]）。对于胰岛素耐受性试验（ITTs），小鼠禁食4小时，然后腹腔注射胰岛素（0.2 U/kg体重）。用ELISA法测定血清C-端肽（CTX；Immunodiagnostik）和血清骨保护素（OPG；R&D Systems）水平。先前描述的基于三重ELISA的系统用于测定血清中羧基化和羧基化不足的骨钙素浓度(26).

统计。

所有结果均表示为平均值±平均值标准误差。使用Prism（GraphPad）分析曲线下的面积。使用未配对的双尾Student’s进行统计分析t吨测验。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的。

结果

Tsc2缺陷的成骨细胞产生紊乱的骨骼。

靶细胞中的胰岛素受体激活集中在Tsc-mTOR信号复合物上，该复合物用于协调激素的许多生物反应。为了描述该途径在调节骨形成和能量代谢中的作用，我们制作了小鼠模型，其中Tsc2型选择性破坏成骨细胞。OC-Cre交配的雄性后代^TG公司/+Tsc2型^{flox/flox公司}和Tsc2^{flox/flox公司}小鼠(18)基因型OC-核心^TG公司/+ Tsc2型^{flox/flox公司}选择（以下简称ΔTsc2小鼠）进行详细分析。男Tsc2^{flox/flox公司}室友充当对照。ΔTsc2小鼠以预期的孟德尔频率出生，与对照组相比，骨组织中的Tsc2 mRNA水平降低了55%（数据未显示），等位基因特异性PCR证实，Tsc2等位基因的重组仅发生在骨骼组织（即颅骨和股骨）中(图1A). 免疫组织化学染色显示S6激酶（S6K1）的磷酸化水平增加，表明这种基因操作确实增加了mTOR活性(图1B).

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图1

Tsc2调节出生后的骨骼获取。（A） Oc-Core组织中Tsc2等位基因重组的PCR分析^TG公司/+Tsc2型^{flox/flox公司}（ΔTsc2）小鼠。（B） 3周龄对照组和ΔTsc2小鼠（B，骨；Mu，肌肉；骨膜，骨膜）皮质骨中磷酸-S6K的免疫组织化学染色。（C至G）对照组和ΔTsc2小鼠3、6、12和24周龄股骨远端骨小梁结构的显微CT定量分析(n个=4至6只小鼠）。（C）代表性图像。（D）骨体积/组织体积。（E）小梁数（Tb.N）/mm。（F）小梁厚度（Tb.Th）。（G）小梁间距（Tb.Sp）.*，P（P）< 0.05. （H）对照组和ΔTsc2小鼠3、6、12和24周龄股骨中段皮质骨结构的典型显微CT图像。（一） 24周龄对照组和ΔTsc2小鼠颅骨的典型显微CT图像。（J）来自3周龄对照（a）和ΔTsc2（b）小鼠的代表性苏木精-伊红染色皮质骨切片。原始放大倍数，×20。（K和L）免疫组织化学染色，检测3周龄对照组和ΔTsc2小鼠（Ma，骨髓）皮质骨中的骨性线（K）和Runx2（L）。箭头突出显示皮质骨中的染色。

ΔTsc2小鼠在出生后的骨骼获取量呈逐渐增加的趋势。当对照组的股骨小梁骨体积在12周龄时达到峰值时，ΔTsc2小鼠在24周龄时继续累积小梁骨，骨体积/组织体积（BV/TV）超过75%(图1C到toG）。G公司). 皮质骨包膜的骨体积也明显增加(图1H)和头骨的颅骨(图1I)不影响血清钙或磷酸盐水平(表1). 雌性ΔTsc2小鼠的骨小梁和皮质骨结构测量值也有所增加（数据未显示）。

表1

组织形态计量学和血清测量^{^一}

参数	小鼠的价值
参数	控制	ΔTsc2
骨骼结构
骨骼长度（mm）	13.56 ± 0.19	13.89 ± 0.27
生长板厚度（μm）	85.73 ± 4.35	85.87 ± 4.58
骨骼形成
类骨体积/骨体积（%）	2.22 ± 0.46	4.61 ± 1.53
骨样表面/骨表面（%）	12.38 ± 1.74	22.88 ± 4.84*
类骨厚度（μm）	2.26 ± 0.16	2.98 ± 0.57
成骨细胞表面/骨表面（%）	6.04 ± 1.01	16.27±3.77*
成骨细胞数量/骨周长（数量/100 mm）	618 ± 102	1,355 ± 263*
骨侵蚀
侵蚀面/骨面（%）	5.51 ± 0.96	4.06 ± 0.67
侵蚀深度（μm）	6.38 ± 0.36	6.29 ± 0.86
破骨细胞表面（%）	4.75 ± 0.83	3.67 ± 0.63
破骨细胞数量/骨周长（数量/100 mm）	203 ± 32	156 ± 27
骨骼动力学
矿物并置率（μm/天）	2.36 ± 0.32	2.91 ± 0.42
矿化面/骨面（%）	11.57 ± 1.75	20.99 ± 4.68*
骨形成率/骨表面（mm^三/厘米²/年）	11.35 ± 2.88	29.45±10.92*
矿化滞后时间（天）	1.74 ± 0.39	1.41 ± 0.23
血清学
钙（mg/dl）	9.74 ± 0.25	9.68 ± 0.09
磷（mg/dl）	10.13 ± 1.52	10.18 ± 0.33
CTX（ng/ml）	41.08 ± 1.43	32.84 ± 1.42*
OPG（微微克/毫升）	2,789 ± 132	3,749 ± 240*

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^一数值显示为平均值±标准误差。*，P（P）<0.05。

为了确定这种表型的细胞基础，对6周龄小鼠的骨小梁进行了静态和动态组织形态计量学分析(表1). 与对照组相比，突变小鼠的每骨周长成骨细胞数量（Ob.N/BPM）和每骨表面矿化表面（MS/BS）显著增加，导致骨形成率（BFR/BS）总体增加。然而，突变小鼠的类骨表面（OS/BS）增加，以及与对照小鼠相似的矿物并置率（MAR）表明，突变小鼠中单个成骨细胞的性能受损。为了支持这一观点，对皮质骨脱钙样品的组织学检查显示，在突变小鼠的骨膜表面衬有一层间充质细胞，并嵌入到骨基质中(图1J). 这些细胞的osterix和Runx2染色呈阳性，表明它们在成骨细胞系中的位置(图1K和和L我).

每骨周长破骨细胞数(表1)在突变小鼠中有降低的趋势，但没有达到统计学意义。然而，作为基质降解标志物的血清CTX水平显示骨吸收轻度受损，这可能是血清OPG水平升高的结果，这些结果表明，成骨细胞中Tsc2的丢失导致由过多成骨细胞填充的硬化骨形成，并减少骨吸收。

Tsc2是正常成骨细胞分化所必需的。

为了更深入地研究Tsc2功能丧失对成骨细胞分化的影响，我们使用了初级颅骨成骨细胞培养物，其中Tsc2在感染腺核心表达载体诱导成骨细胞诱导分化之前被清除(8,25). 缺少Tsc2的成骨细胞表现出预期的mTOR激活，如S6K1磷酸化增加所示(图2A)和增强蛋白质合成(图2B). 通过BrdU掺入评估发现Tsc2缺陷成骨细胞的增殖受损(图2C)但突变细胞显示出较低水平的基础和staurosporine诱导的凋亡(图2D). 与对照组相比，ΔTsc2成骨细胞中已建立的成骨细胞分化指标（包括碱性磷酸酶和钙沉积染色）以及分化成骨细胞的遗传标记（包括Runx2、osterix和I型胶原）的表达均减少(图2E和和F）。F类). RankL水平正常，但与破骨细胞活性降低和血清OPG升高相一致体内与对照组相比，突变成骨细胞中OPG mRNA的表达增加(图2G).

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图2

Tsc2缺乏损害成骨细胞分化。（A） Tsc2原代成骨细胞中Tsc2表达的Western blot分析^{flox/flox公司}表达腺病毒的小鼠感染后Cre公司（ΔTsc2）或绿色荧光蛋白（GFP）（Con）作为对照。S6K1磷酸化被用作mTOR激活的标记。（B）对照和ΔTsc2成骨细胞中蛋白质合成的定量。结果以对照成骨细胞的百分比表示。（C）通过BrdU掺入对照组和ΔTsc2成骨细胞定量成骨细胞增殖。（D）通过caspase-3活性对对照组和经载体（NT）或8 ng/ml staurosporine处理的ΔTsc2成骨细胞的凋亡进行量化。结果以车辆处理的对照成骨细胞的百分比表示。（E至G）Tsc2缺失后成骨细胞分化检查。（E）分化14天后碱性磷酸酶（ALP）和茜素红（ARS）染色。（F）分化14天后，定量PCR（qPCR）分析Runx2、osterix（Osx）、Atf4、I型胶原（ColI）、Twist1和Twist2的表达。（G）分化14天后RankL和Opg表达的qPCR分析。（H）对照组和ΔTsc2成骨细胞中胰岛素刺激（10 nM，15分钟）Akt磷酸化和Irs1水平的Western blot分析。（一）对照组和ΔTsc2成骨细胞中Irs1表达的qPCR分析。（J）在环己酰亚胺（100μg/ml）存在下培养的对照和ΔTsc2成骨细胞中的Irs1蛋白水平。（K）对照组和ΔTsc2成骨细胞eIF-2α、Perk和Jnk磷酸化状态的Western blot分析。（五十） qPCR分析对照组和ΔTsc2成骨细胞中Chop和BiP的表达。（M）用SP600125（Jnk抑制剂；10μM）处理24小时的对照组和ΔTsc2细胞和ΔTsc2细胞中Irs1蛋白表达和胰岛素刺激的Akt磷酸化的Western blot分析（N）qPCR分析Tsc2、Runx2和osterix（Osx）对照组和经SP600125处理的ΔTsc2细胞和ΔTsco2成骨细胞分化14天后的表达。（O）在指定浓度的雷帕霉素存在下分化14天后，对对照组和ΔTsc2成骨细胞培养物进行茜素红染色。（P）在0或10 nM雷帕霉素存在下分化7天的对照成骨细胞培养物的茜素红染色。*，P（P）<0.05。

成骨细胞分化受损，Runx2转录抑制剂Twist1和Twist2表达增加(27) (图2F)这让人想起了在缺乏胰岛素受体的成骨细胞中观察到的表型(8). 事实上，Tsc2缺陷的成骨细胞中胰岛素刺激的Akt磷酸化显著降低，并且与Irs1蛋白丰度的降低有关(图2H). Irs1水平降低不是由于mRNA表达减少(图2I)而是加速蛋白质周转(图2J). 与Tsc1和Tsc2缺乏的其他模型一致(28,–30)，ΔTsc2成骨细胞表现出内质网（ER）应激反应的特征，包括eIF-2α、Perk和Jnk磷酸化的显著增加(图2K)Chop和BiP的表达(图2L). Jnk和S6K1合成抑制剂SP600125的应用(31)，以抑制该途径并阻止Irs1的降解靶向(32,33)标准化Irs-1蛋白水平(图2M)通过Akt磷酸化恢复胰岛素敏感性，并显著提高Tsc2缺陷成骨细胞的分化能力在体外(图2N). 类似地，用低剂量雷帕霉素（0.01 nM和0.1 nM）处理ΔTsc2成骨细胞培养物可以改善基质矿化(图2O)，尽管较高浓度（10nM）损害了对照成骨细胞的矿化(图2P). 总的来说，这些数据表明，Tsc2缺陷的成骨细胞中mTOR信号的高水平有害地导致Irs1的下调，导致成骨细胞对胰岛素产生抵抗，分化不良，并产生紊乱的骨骼。

成骨细胞中Tsc2的缺失会损害葡萄糖代谢。

如上所述，成骨细胞中缺乏胰岛素受体的小鼠会出现高血糖、胰岛素抵抗和外周肥胖(8,9). 在本研究中，成骨细胞中Tsc2功能的丧失导致了类似的代谢变化。与对照组相比，ΔTsc2小鼠的总体重逐渐增加，这在5周龄时首次明显(图3A). 虽然体重的增加可能部分归因于骨体积的急剧增加，但Tsc2突变体的性腺脂肪垫重量在6周龄时增加了26%，在12周龄时进一步增加(图3B). 我们怀疑，就像成骨细胞特异性胰岛素受体突变体一样，外周肥胖的增加是继发于葡萄糖代谢改变的。事实上，ΔTsc2小鼠在进食和禁食状态下都处于高血糖状态(图3C和和D），D类)这种表型伴随着血清胰岛素水平的下降(图3E).

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图3

ΔTsc2小鼠增加了外周肥胖并改变了葡萄糖代谢。（A）对照组和ΔTsc2小鼠的体重(n个=8至11）。（B） 6周龄和12周龄时的性腺脂肪垫质量(n个=4至6只小鼠）。（C） 6周龄和12周龄时随机喂食葡萄糖的测量(n个=5至8只小鼠）。（D） 6周龄和12周龄时空腹血糖的测量(n个=5至8只小鼠）。（E） 6周龄和12周龄时的血清胰岛素水平(n个=4至6只小鼠）。（F） 6周后隔夜禁食后的葡萄糖耐量试验(n个=5至8只小鼠）。（G） 6周禁食4小时后的胰岛素耐受测试(n个=5或6只小鼠）。（H） 6周龄时GTT和ITT曲线下面积分析。（一） 12周禁食一晚后进行葡萄糖耐量测试(n个=5至8只小鼠）。（J） 12周禁食4小时后进行胰岛素耐受性测试(n个=5或6只小鼠）。（K） 12周龄时GTT和ITT曲线下面积分析。（五十） 12周大时禁食过夜后的葡萄糖刺激胰岛素分泌试验(n个=4或5只小鼠）。对照组和ΔTsc2小鼠胰腺β细胞的（M到O）组织形态计量学分析(n个＝5只小鼠）。（M）胰岛素和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色的胰岛的代表性图像。（N） β细胞面积（组织面积百分比）。（O） β细胞质量。（P）qPCR分析英寸1和2英寸胰腺中的表达(n个=4只小鼠）。（Q） qPCR分析Pparg公司和Ucp1单位白色脂肪（WAT）和棕色脂肪（BAT）组织中的表达(n个=5只小鼠）。（R） qPCR分析第1包,预测值k4、和格克在肝脏中的表达(n个=5只小鼠）。*，P（P）<0.05。

这种表型似乎是由于葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损所致，因为突变小鼠表现出葡萄糖耐受性降低(图3F和和H）H（H）)随着年龄的增长（12周），情况进一步恶化[图3I和和K]），K（K）])而ITT评估的外周胰岛素作用在年轻小鼠（6周）中增强[图3G])然后恢复正常（12周[图3J]). 根据这个想法，与对照组相比，ΔTsc2小鼠表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌减弱(图3L)β细胞面积减少(图3M和和N），N个)，β细胞质量(图3O)和胰腺表达英寸1和检查2(图3P). 此外，白脂肪中胰岛素信号的标记物(Pparg公司)，棕色脂肪(Ucp1单位)，突变小鼠的肝脏发生了改变(图3Q和和R）。R（右）). 最值得注意的是第1包，一个参与糖异生的胰岛素靶基因(34)与对照组相比，ΔTsc2小鼠肝脏中的预测值k4和格克，参与糖酵解的胰岛素靶点(35,36)，已减少(图3R). 因此，成骨细胞中Tsc2的缺失导致外周肥胖增加，并与葡萄糖不耐受和胰岛素生成减少相关。

Tsc2调节骨钙素的生成。

因为成骨细胞中的胰岛素信号可以提高骨源性激素骨钙素的生成和生物利用度(8,9)，我们最初认为，Tsc2突变体中明显的代谢缺陷是血清ucOCN减少的结果。然而，Tsc2突变小鼠的血清骨钙素水平实际上增加了(图4A). 此外，未羧化OCN水平增加了4.5倍(图4B)而与对照组相比，ΔTsc2小鼠Glu13缺乏羧基化的骨钙素水平增加了10倍以上(图4C). Glu13-OCN与血清总骨钙素的比率增加（数据未显示），破骨细胞骨吸收减少(表1)提示Tsc2功能丧失对羧基化骨钙素生成的直接影响。与血清骨钙素的增加相一致，Tsc2缺陷的成骨细胞的骨钙素mRNA水平显著升高(图4D)，尽管骨钙素基因的表达对胰岛素不再有反应。

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图4

Tsc2消融后，骨钙素的生成显著增加。（A） 12周龄对照组和ΔTsc2小鼠的血清总骨钙素(n个=5至7只小鼠）。（B） 12周龄时未羧化骨钙素水平(n个=5至7只小鼠）。（C） 12周龄时羧化不足（Glu13）骨钙素水平(n个=5至7只小鼠）。（D） qPCR分析对照组和用胰岛素（INS）或载体（NT）处理6小时的ΔTsc2成骨细胞分化0或4天后的骨钙素mRNA水平。（F）分化4天后对照组和ΔTsc2成骨细胞FoxO1磷酸化状态的Western blot分析。（G）分化4天后，从对照和ΔTsc2成骨细胞分离的细胞核（Nuc）和细胞质（Cyto）提取物中FoxO1丰度的蛋白质印迹分析。比率是从两个独立的实验中得出的。（H）分化4天后对照组和ΔTsc2成骨细胞FoxO1与骨钙素基因结合的染色质免疫沉淀定量分析(n个=3或4）。未检测到N.D.。*，P（P）<0.05。

接下来我们研究了骨钙素水平升高的机制。因为Runx2 mRNA水平(图2F)被抑制，并且这两种mRNA(图2F)和蛋白质(图4E)ΔTsc2成骨细胞中Atf4水平正常，我们将注意力集中在FoxO1，一种骨钙素表达的转录抑制因子(10). 突变成骨细胞FoxO1磷酸化水平增加(图4F)核丰度减少33%(图4G)这个转录因子。ChIP分析显示突变细胞中骨钙素启动子上两个共识结合位点FoxO1的占有率降低(图4H)表明Tsc-mTOR和FoxO1活性与骨钙素生成之间存在分子联系。

为了探索ucOCN水平和代谢参数之间明显差异的可能解释，我们检测了年轻小鼠的葡萄糖代谢。令人惊讶的是，1周龄的突变小鼠表现出葡萄糖处理能力改善的迹象，包括血糖水平降低(图5A)，血清胰岛素升高(图5B)，并增加了英寸1和2英寸在胰腺中(图5C). 此外，血清中未羧酸化骨钙素的水平增加了21%(图5D和和E）。E类). 这表明长期接触高水平的这种激素可能导致胰腺β细胞抵抗骨钙素的进一步刺激。

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图5

骨钙素过度生产导致脱敏。（A）随机喂食对照组和1周龄ΔTsc2小鼠的血糖测量(n个=8至14只小鼠）。（B） 1周龄时的血清胰岛素水平(n个=8至14只小鼠）。（C） qPCR分析英寸1和2英寸1周龄对照和ΔTsc2小鼠胰腺中的表达(n个＝3至5只小鼠）。（D） 1周龄对照组和ΔTsc2小鼠的血清总骨钙素(n个=8或9只小鼠）。（E） 1周龄时未羧化骨钙素水平(n个=8或9只小鼠）。（F）分化14天后，与对照组或ΔTsc2成骨细胞条件培养48小时的培养基中的骨钙素水平。（G） Western blot分析在含有对照或ΔTsc2成骨细胞的培养基中培养24小时的Min6细胞中Gpcr6a丰度（h和I）英寸1和2英寸在含有对照或ΔTsc2成骨细胞的条件培养基中培养6小时后，用骨钙素（0至100 ng/ml）处理Min6细胞的mRNA水平。（J） Western blot分析从6周龄对照组和ΔTsc2小鼠中提取的初级β细胞中Gpcr6a的丰度。（K） Gpcr6a Western blot分析的密度分析(n个=2或3只小鼠）。*，P（P）<0.05。

为了验证这一想法，我们在含有ΔTsc2或对照成骨细胞的条件培养基中培养Min6β细胞。与突变成骨细胞骨钙素表达增加一致(图4D)与野生型成骨细胞条件培养基相比，含有ΔTsc2成骨细胞的条件培养基中的骨钙素浓度高2.8倍(图5F). 在由突变细胞调节的培养基中培养的Min6细胞显示Gpcr6a丰度减少37%，Gpcr6是一种假定的骨钙素受体(37,38)与对照成骨细胞条件培养基中培养的成骨细胞相比(图5G). 此外，当外源性低羧基化骨钙素的添加增加时英寸1和2英寸在对照培养基中培养的β细胞中的mRNA表达，在ΔTsc2条件培养基中未观察到细胞反应(图5H和和I）。我). 最后，为了确定Gpcr6a表达的下调是否也发生了体内，我们从6周龄对照组和ΔTsc2小鼠的胰腺中收集胰岛。与观察到的效果类似在体外，从突变小鼠制备的提取物中，Gpcr6a的丰度降低了60%以上(图5J和和K）。K（K）). 总的来说，这些结果与长期接触高水平OCN的概念是一致的在体外和体内通过G蛋白偶联受体下调使β细胞脱敏。因此，这种机制可能至少部分解释了Tsc2突变小鼠胰腺反应性和胰岛素分泌的丧失。

去除一个mTOR等位基因可使ΔTsc2小鼠的骨和代谢异常正常化。

上述Tsc2功能丧失模型的结果表明，Tsc2通过调节mTOR对骨和能量代谢产生影响。为了在这些表型中更牢固地建立Tsc2和mTOR之间的联系，我们创建了复合突变小鼠，其中mTOR的一个等位基因在ΔTsc2小鼠中被破坏。正如预期的那样，这种手法使骨小梁结构部分正常化(图6A). 同样，体重的测量(图6B)和葡萄糖代谢，包括随机喂食和饥饿小鼠的葡萄糖水平(图6C)，和葡萄糖耐量(图6D)在复合突变体中，几乎无法与野生型同卵双胞胎区分开来。单个mTOR等位基因的破坏对骨体积没有影响(图6A)或葡萄糖代谢（数据未显示），但成骨细胞中mTOR纯合缺失(图6E)出生后骨获得受损体内(图6G到到I）我)和成骨细胞分化在体外(图6J和和K），K（K）)，不影响体重(图6F). 这些数据支持这样的观点，即Tsc2位于成骨细胞中mTOR通路的上游，并通过成骨细胞参与胰岛素介导的骨获取调节和胰岛素反应。

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图6

mTOR的调节使ΔTsc2突变体的骨和葡萄糖代谢正常化。（A）对照组和12周龄mTOR和Tsc2复合突变小鼠股骨远端骨小梁结构的典型显微CT图像。（B）对照组体重和ΔTsc2；mTOR公司¹12周龄小鼠（8至11只）。（C） 12周龄（5至11只小鼠）随机喂食和禁食时的血糖。（D） 12周禁食一晚后进行葡萄糖耐量试验(n个=7至11只小鼠）。（E） Oc-Core组织中mTOR等位基因重组的PCR分析^TG公司/+mTOR公司^{flox/flox公司}（ΔmTOR）小鼠。（F）对照组和ΔmTOR小鼠的体重(n个=7至14只小鼠）。（G至I）12周龄对照小鼠和ΔmTOR小鼠股骨远端骨小梁结构的定量显微CT分析(n个=4或5只小鼠）。（G）代表性图像。（H）骨体积/组织体积。（一）小梁数/mm。（J）从mTOR分离的原代成骨细胞中mTOR表达的Western blot分析^{flox/flox公司}表达腺病毒的小鼠感染后Cre公司（ΔmTOR）或GFP（Con）作为对照。（K）分化14天后Runx2、osterix（Osx）和I型胶原（ColI）的qPCR分析。*，P（P）<0.05。

讨论

在这项研究中，我们在小鼠中使用遗传方法来确定胰岛素受体下游调节成骨细胞发育和代谢功能的关键信号通路。由于Tsc2作为整合生长和养分利用重要信号的中央控制点，我们将重点放在Tsc2上(39,–41). 此外，我们推断，与瞄准更复杂的多亚单位mTOR复合体相比，操作Tsc2可以提供一种更简单的方法(42). 利用这一策略，我们首次揭示了Tsc-mTOR信号在成骨细胞中的作用体内(图7). 特别是，我们提供的证据表明，Tsc2用于调节胰岛素产生的信号，以控制成骨细胞的发育，同时调节激素骨钙素的产生。

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图7

ΔTsc2小鼠骨骼和代谢表型的拟议模型。成骨细胞中Tsc2的基因消融导致未经检查的mTOR信号传导，从而增加成骨细胞存活率和蛋白质合成。蛋白质合成增加导致内质网应激反应，降低Irs1蛋白水平，降低成骨细胞对胰岛素的敏感性，并损害成骨细胞分化。同时，mTOR信号转导使转录因子FoxO1失活，后者通常抑制骨钙素的生成。骨钙素的显著增加导致胰腺β细胞对激素脱敏。

如上所述，Tsc2是一种GAP蛋白，通过小GTPase Rheb抑制mTOR的活性(14,15). 因此，从表面上看，ΔTsc2小鼠成骨细胞数量的增加似乎是可以预测的，因为mTOR正常发挥的增殖和存活作用被释放。事实上，在其他旨在组成性激活PI3K/Akt信号的小鼠模型的骨骼中也观察到成骨细胞数量增加(43). 此外，Tsc2可抑制胰岛素激活的细胞内信号网络的一个臂。胰岛素信号缺陷的人类和动物模型经常表现出骨骼形成和修复的异常(44,–46)包括成骨细胞数量不足(8). 因此，我们的数据表明，胰岛素利用Tsc-mTOR信号促进成骨细胞增殖和存活，ΔTsc2小鼠骨体积的急剧增加可以被视为成骨细胞中缺乏胰岛素受体的小鼠未能达到峰值骨量的对应物(8).

尽管ΔTsc2小鼠的成骨细胞数量和成骨率增加，但单个成骨细胞的功能受损。在突变小鼠中，矿物质并置率与对照小鼠相当，类骨测量值增加，这表明突变成骨细胞适当矿化骨的能力整体受损。虽然我们不能排除由于Cre介导的基因缺失的出现而导致表型的潜在差异体内以及我们基于腺芯的方法在体外，我们的在体外分化试验还显示成骨细胞分化的遗传标记表达受损，矿化减少。这些发现以及观察到的成骨细胞凋亡减少在体外可能有助于解释突变小鼠中未成熟成骨细胞的积聚。

此外，未成熟成骨细胞的存在，尤其是皮质骨室中的成骨细胞，可能有助于解释人类结节性硬化症的骨骼表现。虽然患者的诊断依据是面部皮脂腺腺瘤、精神缺陷和抽搐的临床三联征，但骨骼异常是常见的发现(47). 虽然通常是良性的，但包括颅骨、骨盆和长骨中常见的硬化性骨改变；骨膜新骨形成；和囊肿样病变(48,49). 此外，结节性硬化和纤维异常增生的病变有着惊人的相似性，纤维异常增生是另一种与未成熟成骨细胞积聚相关的疾病(50,51).

我们的研究表明，导致Tsc2缺陷成骨细胞无法完全分化的机制，至少部分是由于mTOR过度激活和胰岛素信号受损，而胰岛素信号受损是通过参与先前描述的其他细胞类型的负反馈回路间接发生的(28,–30). 在这一过程中，无限制的mTOR信号启动了一系列事件，包括蛋白质合成增加和内质网应激反应的发展，同时PERK、eIF-2α和Jnk磷酸化增加。Jnk活性的增加反过来通过抑制Irs1的磷酸化和靶向蛋白酶体降解蛋白影响胰岛素信号(33,52). 在ΔTsc2成骨细胞中也出现了类似的现象，这可能解释了ΔTcc2小鼠中未成熟成骨细胞的积聚，尤其是通过SP600125或雷帕霉素治疗对该途径的药物抑制能够恢复胰岛素敏感性并挽救Tsc2缺陷成骨细胞分化缺陷。这些数据以及ΔmTOR小鼠中明显的骨量减少表明，Tsc2是成骨细胞获得完全成熟表型所必需的合成代谢信号的关键调节器。

ΔTsc2小鼠的代谢紊乱与先前在成骨细胞中缺乏胰岛素受体的小鼠中观察到的代谢紊乱的相似性(8,9)强烈建议将共同因素作为致病因素。最明显的候选者是骨钙素，骨钙素是一种骨源性激素，其功能是在成骨细胞和其他代谢活性组织之间传递代谢信息。骨钙素缺乏小鼠在葡萄糖代谢方面表现出严重损伤，这一事实支持了这种生理作用的证据(7)，并且每天输注或注射骨钙素可以改善高脂肪饮食对葡萄糖代谢的有害影响(53,54). 低羧化骨钙素与骨羟基磷灰石结合不良，脱离局部骨基质或通过破骨细胞吸收释放，并作为循环激素增加β细胞的胰岛素生成和其他靶组织的胰岛素敏感性(7). 最近的研究表明，这种激素还可以通过作用于睾丸的Leydig细胞来影响男性生育能力(38)，但睾丸大小在我们的研究中没有受到影响，我们也没有观察到Tsc2功能丧失对生育能力的影响（数据未显示）。

与其他激素一样，骨钙素似乎在有效浓度范围内对葡萄糖代谢产生影响。例如，在分离的胰岛中，细菌来源的非羧酸骨钙素（0.3 ng/ml）增加胰岛素基因表达，而将剂量增加到30 ng/ml则无反应。通过渗透泵输注骨钙素后，观察到同样狭窄的有效治疗范围(53). 在本研究中，对照组小鼠血清（Glu13）中羧基化不足的骨钙素水平约为20 ng/ml，而ΔTsc2组小鼠则高出10倍。

基于这些药理学特征和骨钙素生物学的现有知识，我们强烈怀疑ΔTsc2小鼠中出现的代谢缺陷是由于长期接触骨钙素导致靶组织脱敏所致。这一结论得到了一些实验证据的支持。首先，1周龄的ΔTsc2小鼠表现出了改善血糖处理的参数，包括降低血糖水平和增加血清胰岛素，以及骨钙素的适度增加。其次，增加靶组织（如肌肉和脂肪）中胰岛素敏感性标记物所需的骨钙素浓度似乎大于增加胰腺中胰岛素表达所需的浓度(53). 在我们的研究中，较年轻的ΔTsc2小鼠（6周）的胰岛素敏感性增加，然后随着年龄增长（12周）而恢复正常，我们怀疑这代表了这些组织脱敏的滞后。第三，将Min6β细胞暴露于含有ΔTsc2成骨细胞的条件培养基中，该培养基中骨钙素的浓度比含有对照成骨细胞条件培养基的浓度高近3倍，导致Gpcr6a（一种假定的骨钙素受体）的下调(37,38)并使其抵抗骨钙素的进一步刺激。最后，从ΔTsc2小鼠分离出的β细胞中Gpcr6a的丰度相对于对照同窝小鼠降低。

在转录水平上，骨钙素启动子活性阻遏物FoxO1的活性降低(10,11)，可能解释了骨钙素表达增加的原因，因为在ΔTsc2成骨细胞中FoxO1的核定位和骨钙素启动子结合减少。考虑到有报道称FoxO存在于某些缺乏Tsc2的组织的细胞核中，这一发现有些出乎意料(29,55)Tsc2缺陷的成骨细胞对胰岛素无反应，Akt活性降低。mTOR可能靶向SGK，已知其活性类似于Akt，包括磷酸化FoxO的能力(56,57)，负责此效果。然而，mTOR活性增加与FoxO1磷酸化之间的确切机制联系尚不清楚，目前正在研究中。

目前还不清楚Tsc-mTOR信号如何影响骨钙素γ-羧基化。有人提出，破骨细胞性骨吸收过程中，骨钙素脱羧并从骨基质中释放出来(9)但ΔTsc2小鼠破骨细胞活性降低。另一种可能性是，与Tsc2缺乏相关的内质网应激干扰了骨钙素羧化所必需的维生素K依赖性γ-羧化酶的活性。此外，骨钙素表达的增加可能只是导致成骨细胞产生更多的羧化不足的骨钙素。事实上，我们以前的工作表明，在颅骨成骨细胞培养中可以测量到ucOCN的显著水平(8). 尽管如此，该模型中骨钙素生成的显著增加可能有助于进一步剖析调节骨钙素生物利用度的因素。

总之，这些研究确定Tsc2是一种关键的胰岛素应答靶蛋白，它调节控制成骨细胞分化和葡萄糖代谢的信号。此外，我们的结果表明，胰腺β细胞中骨钙素的生物作用通过其G蛋白偶联受体的经典下调而得到缓和。最后，这些发现进一步支持了将成骨细胞功能与能量稳态联系起来的新兴模型。

补充材料

补充材料：

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致谢

我们感谢M.Gambello和C.Lynch提供Tsc2^{flox/flox公司}和mTOR^{flox/flox公司}小鼠。

退伍军人管理局的功绩审查奖（T.L.C.）和职业发展奖（R.C.R.）以及NIH（M.a.H。，电话081472;; 注册资本回报率。，DK099134号)巴尔的摩糖尿病研究和培训中心（M.A.H。，丹麦079637). T.L.C.还获得了退伍军人管理局颁发的研究职业科学家奖。

脚注

提前出版2014年3月3日

本文的补充材料可以在http://dx.doi.org/10.1128/MCB.00075-14.

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文章来自分子和细胞生物学由以下人员提供泰勒和弗朗西斯