AMP活化蛋白激酶——一种调节细胞功能各个方面的能量传感器

摘要

活细胞使用ATP和ADP的方式类似于充电电池中的化学物质。大多数细胞过程都需要能量，并通过ATP水解为ADP和磷酸盐（或不太常见的水解为AMP和焦磷酸盐）来驱动（直接或间接），从而“压扁电池”。在异养生物中，电池通过分解代谢进行充电；即有机来源的还原碳化合物的氧化，如葡萄糖。在大多数细胞（尤其是静止细胞）中，葡萄糖的氧化通常通过氧化磷酸化过程完全转化为二氧化碳。在这些条件下，大多数ATP合成发生在线粒体内膜，当通过呼吸链泵出的质子通过复合物V（ATP合成酶）中的通道流回膜时，ATP生成。有人认为，需氧细菌的内共生获得形成线粒体是真核生物发育过程中的关键事件(莱恩和马丁2010). 可用于质子转移的膜表面积（以线粒体内膜的形式）的大幅增加使产生ATP的能力大幅增加，这反过来可能使真核细胞和生物体表现出的复杂性急剧增加。当线粒体成为主要的细胞能量来源时，所需的一个额外事件是开发感知细胞质中能量状态的系统，然后将这些信息发回信号以调节线粒体功能。有趣的是，AMP-activated protein kinase（AMPK，这篇综述的主题）发挥了这一作用，在真核生物中几乎普遍存在。一个有趣的例外是楔状脑囊炎它是一种真核生物，基因组被剥离，似乎不仅失去了线粒体，还失去了AMPK(Miranda-Saavedra等人，2007年). 然而，由于它是一种专性细胞内寄生虫，宿主细胞将提供这两种缺失的功能。

实现能量感应的显而易见的方法是让蛋白质监测ATP与ADP的细胞比率。然而，由于所有真核细胞中都有非常活跃的腺苷酸激酶，它们催化腺嘌呤核苷酸的相互转化（2ADP↔ ATP+AMP），AMP:ATP比率的变化趋势与ADP:ATP比例一致，甚至更大(哈迪和霍利2001). 因此，可以监测AMP与ATP的比值，而不是（或除了）ADP与ATP，尽管这方面的一个潜在问题是AMP的浓度通常比ADP和ATP的浓度低一个或两个数量级(Hardie等人，2011年). 确实存在能够感应细胞AMP:ATP比率的代谢酶，包括（1）肌肉中的糖原磷酸化酶和6-磷酸果糖-1-激酶，它们通过增加AMP:ATP激活，打开两条分解代谢途径（即糖原分解和糖酵解），以及（2）肝脏中的果糖-1,6-二磷酸酶，通过增加AMP:ATP，关闭合成代谢途径，即糖异生而抑制。对细胞能量敏感的大多数其他过程似乎是通过AMPK系统间接调制的。正如下文进一步讨论的那样，最近已经清楚，AMPK不仅受AMP和ATP调节，还受ADP调节，同时它还通过促进新线粒体的产生和功能失调线粒体的处理，在维持细胞氧化代谢能力方面发挥关键作用。

AMPK同源基因在非哺乳动物真核生物中的作用

除寄生虫外，所有基因组序列已完成的真核生物中都存在AMPK的同源序列脑胞内原虫，如上所述。它们似乎普遍存在于由催化α亚基和调节β和γ亚基组成的异源三聚体复合物中。芽殖酵母中(酿酒酵母)，编码α和γ亚单位的基因（现在称为SNF1系列和SNF4系列)通过突变导致不能在葡萄糖以外的碳源上生长，包括蔗糖等可发酵糖和甘油或乙醇等不可发酵碳源(Ciriacy 1977年;Zimmermann等人，1977年;Carlson等人，1981年). 三个交替的β亚基（Sip1、Sip2和Gal83）后来被发现是与Snf1相互作用的蛋白质，敲除这三个亚基与敲除Snf1产生相同的表型SNF1系列或SNF4系列(施密特和麦卡特尼2000).

酵母的标准实验室生长培养基含有2%的葡萄糖，在这种非常高的葡萄糖浓度下，酵母细胞通过发酵（即糖酵解，产生乙醇）快速增殖以生成ATP。这相当于快速增殖的哺乳动物细胞中的Warburg效应（尽管后者生成乳酸而不是乙醇）。快速增殖细胞糖酵解率高的一个原因是TCA循环不再是纯粹的分解代谢途径，而是至少部分地合成代谢，为生物合成提供前体，尤其是柠檬酸盐用于脂质合成(Vander Heiden等人，2009年). 然而，随着培养基中的葡萄糖耗尽，这种情况无法持续，生长速度减慢（酵母中称为二向移位的现象），细胞又回到使用氧化磷酸化来产生ATP，就每摩尔葡萄糖产生的ATP而言，这是一个更有效的过程。有趣的是，这种转变需要一种功能性的SNF1复合物，包括向氧化代谢的转变(Hedbacker和Carlson 2008). 这表明AMPK的一个祖先功能是抑制生长并触发氧化代谢的转换，以响应对首选碳源葡萄糖的剥夺。当葡萄糖含量低时，snf1-无效突变体表现得好像他们没有意识到自己正在挨饿，继续快速生长和发酵，并迅速失去活力。这些突变体的其他表型是，如果是二倍体，则不经历假菌丝生长、减数分裂和孢子形成；如果是单倍体，也不经历侵入性生长(Honigberg和Lee 1998;卡伦和斯普拉格2000;Kuchin等人，2002年)所有这些都是对葡萄糖饥饿的正常反应。

与饥饿反应中的祖先角色一致，AMPK同源基因也需要用于线虫对营养剥夺的反应秀丽隐杆线虫幼虫暴露于饥饿或其他应激（热休克或暴露于代谢毒物叠氮化物）会导致AMP:ATP比率增加和随后寿命延长，后者需要AMPK（AAK-2）的两种催化亚基亚型之一(Apfeld等人，2004年). 生殖细胞是秀丽线虫没有经过精确定义数量的分割；生殖细胞的产生通常因饮食限制而停止，但在aak-2型突变体(纳博恩和罗伊2006). 为了应对白藜芦醇（下文将进一步讨论的AMPK激活剂）治疗和一些但不是所有的饮食限制协议，延长寿命还需要AAK-2(Greer等人，2007年;Greer和Brunet 2009).

缺乏AMPK同源基因的植物的表型也与饥饿反应中的祖先作用相一致。在植物中，黑暗相当于动物的一段禁食或饥饿期。在苔藓中专利立管菌，缺乏编码AMPK催化亚基同源基因的两个基因的植物如果在恒定的光照下生长，是可行的，但不能在更生理化的交替光照中生长：黑暗周期(Thelander等人，2004年). 在高等植物中拟南芥催化亚基的过度表达导致细胞在低光照下对碳水化合物饥饿的影响产生抵抗，而催化亚基下调导致植物生长发育迟缓，与基因表达的正常转换失败相关，并导致贮存淀粉的动员，发生在黑暗时期(Baena-Gonzalez等人，2007年).

哺乳动物AMPK结构与腺嘌呤核苷酸的调控

在哺乳动物中，有7个基因编码AMPK；即，两种α亚型（α1和α2），两种β亚型（β1和β2），以及三种γ亚型（γ1、γ2和γ3）。尽管可能存在一些优选组合，但所有12种异源三聚体组合都可以通过在细菌或哺乳动物细胞中共存α、β和γ亚基而形成。在缺乏结合伙伴的情况下，单个亚单位通常是不稳定的；这可能是一个有用的特征，因为当任何一个亚基过表达时，它都会作为显性突变体，通过竞争与其他两个亚基的结合来取代内源性表达的亚基(Mu等人，2001年;Hawley等人，2010年).

α亚基在N端含有一个典型的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域；对于许多蛋白激酶来说，只有当上游激酶（如下所述）在激活环内保守的苏氨酸残基（人类α1中的Thr 172）磷酸化时，这些蛋白激酶才具有显著活性(Hawley等人，1996年;Stein等人，2000年). γ亚单位包含调节性腺嘌呤核苷酸结合位点，由一个称为CBS基序的序列的四个串联重复序列组成。它们以假对称的方式组装，因此有四个腺嘌呤核苷酸可能结合的空位(Scott等人，2004年;Xiao等人，2007年,2011). 一个（位点4）似乎与AMP结合得非常紧密，因此它不会与ADP或ATP交换：这个位点的结合可能具有结构作用。哺乳动物复合体中的另外两个位点（位点1和3）竞争性地结合AMP、ADP和ATP，是细胞能量状态感知的位点。第四个（站点2）似乎总是无人使用。β亚单位包含构成真菌和哺乳动物αβγ复合体保守核心的C末端结构域，将α亚单位的C末端区域连接到γ亚单位的N末端区域(Amodeo等人，2007年;汤利和夏皮罗2007;Xiao等人，2007年). 大多数β亚单位还包含碳水化合物结合模块（CBM），非催化结构域也存在于代谢淀粉和糖原的酶（原核生物和真核生物中）中(Machovic和Janecek 2006). CBM使哺乳动物AMPK与完整细胞中的糖原结合(Hudson等人，2003年;Polekhina等人，2003年,2005;Koay等人，2007年;Bendayan等人，2009年). 尽管其中一个功能可能是定位AMPK，下游靶点也与糖原结合，例如糖原合成酶，但其生理作用仍不确定(Carling and Hardie 1989年;Jorgensen等人，2004年). 有趣的是，高等植物有独特的基因编码所谓的“βγ亚基”，其中CBM似乎在γ亚基的N末端融合。它们还包含编码N末端截断的β亚基的基因，其C末端结构域参与与α和γ亚基的相互作用，但缺乏CBM。然而，所有植物物种也表达更传统的β和γ亚单位，就像真菌和哺乳动物中的那样(Polge和Thomas 2007).

在大多数哺乳动物细胞中，主要的上游激酶磷酸化Thr 172，从而激活AMPK，是肿瘤抑制激酶LKB1和两个辅助亚单位STRAD和MO25之间的复合物(Hawley等人，2003年;Woods等人，2003年;Shaw等人，2004年). AMP的结合引起AMPK的构象变化，通过三个独立的机制促进其活化：（1）促进Thr 172磷酸化(Hawley等人，1995年;Oakhill等人，2010年)，（2）抑制Thr 172去磷酸化(Davies等人，1995年;Suter等人2006;Oakhill等人，2010年)和（3）已在Thr 172上磷酸化的AMPK变构激活(Corton等人，1995年;Suter等人，2006年). 有趣的是，最近有报道称，机制1和机制2可以由ADP和AMP的结合触发(Oakhill等人，2011年;Xiao等人2011)，尽管机制3仅在AMP中观察到。γ亚基上的位点1和3对游离ATP、ADP和AMP具有相当相似的亲和力(Xiao等人，2011年)，ATP和ADP的浓度通常远高于AMP的浓度，因此，在大多数情况下，激酶可能对ADP:ATP的波动作出反应，而不是之前认为的AMP:ATP。然而，在严重应激条件下，当AMP水平接近ADP和游离ATP水平时，AMP引起的10倍变构活化（机制3）(Suter等人，2006年)将与Thr 172磷酸化引起的200倍以上的活性相乘，从而产生2000倍以上的总活性。因此，哺乳动物激酶可以在很宽的细胞ADP:ATP和AMP:ATP比率范围内以及很宽的动态范围内作出反应。

一个有趣的问题是，当ATP总浓度通常远高于ADP和AMP的浓度时，ADP和AM如何与ATP竞争与γ亚单位的结合。一种解释可能是Mg.ATP²⁻复合物结合的亲和力比游离ATP低10倍⁴⁻(Xiao等人，2011年). 由于细胞中的大多数ATP以Mg.ATP的形式存在²⁻复合物、AMP和ADP可能只需要与自由ATP竞争⁴⁻而不是含有更丰富的Mg.ATP²⁻复杂。

AICAR（5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷）是一种腺苷类似物，在完整细胞和体内的实验研究中通常用作AMPK的药理激活剂。AICAR被腺苷转运体带入细胞(Gadalla等人，2004年)并被腺苷激酶转化为单磷酸形式ZMP。ZMP模拟了AMP对AMPK系统的所有三种作用，尽管它的活性远低于AMP(Corton等人，1995年).

虽然很明显，在真菌和植物中激活AMPK同源基因需要苏氨酸残基的磷酸化，相当于Thr 172(Estruch等人，1992年;Mackintosh等人，1992年;Wilson等人，1996年)，腺嘌呤核苷酸对它们的调节特征不太明确。尽管AMP激活已被报道用于来自黑腹果蝇(潘和哈迪2002)和秀丽线虫(Apfeld等人，2004年)，酵母(Wilson等人，1996)和植物(Mackintosh等人，1992年)激酶不被AMP变构激活（即它们缺乏上述机制3）。然而，在葡萄糖饥饿期间酵母SNF1复合物的激活确实与细胞AMP:ATP和ADP:ATP比率的大幅增加相关(Wilson等人，1996年)似乎该复合物可能由ADP和/或AMP通过机制1和/或2调节。事实上，已经表明，在无细胞测定中，植物激酶的去磷酸化和活化被AMP抑制（机制2）(Sugden等人，1999年).

尽管LKB1必须在哺乳动物细胞中表达，以增加细胞AMP:ATP和ADP:ATP比率，从而激活AMPK(Hawley等人，2003年)值得强调的是，这些效应是由于腺嘌呤核苷酸与AMPK的γ亚单位结合，LKB1复合物本身似乎具有组成活性(Sakamoto等人，2004年). 这最初看起来可能令人惊讶，但除了AMPK外，LKB1还需要用于AMPK相关激酶家族的12种激酶的活性，负责所有这些激酶中相当于Thr 172的苏氨酸残基的磷酸化(Lizzano等人，2004年). AMPK相关激酶具有多种功能，与AMPK不同，大多数似乎不被能量应激激活。因此，上游激酶作为主要的调控位点是没有意义的。

在某些细胞类型中，Thr 172也可以被Ca磷酸化²⁺/钙调素依赖性蛋白激酶CaMKKβ，提供钙²⁺-启动AMPK的激活途径(Hawley等人，2005年;Hurley等人，2005年;Woods等人，2005年). 在腺嘌呤核苷酸比率没有任何变化的情况下，这种机制可以激活，尽管钙增加²⁺可以与AMP或ADP的增加协同作用(Fogarty等人，2010年). 这种机制在神经元中似乎特别重要(Hawley等人，2005年)、内皮细胞(Stahmann等人，2006年)和T淋巴细胞(Tamas等人，2006年). 由于胞浆钙增加²⁺倾向于触发能量消耗过程，例如运动蛋白的激活或分泌，这可能是一种在ATP需求发生之前预测其需求的机制。

最后，据报道，Thr 172可以被TAK1（也称为MAP3K7或MEKK7）磷酸化(Momcilovic等人，2006年)是细胞因子受体下游的一种蛋白激酶，通常被认为是MAP激酶（JNK）和NF-kB信号级联的上游。尽管这与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）激活AMPK有关(Herrero Martin等人，2009年)目前，这种机制的生理意义尚不清楚。调节AMPK的复杂机制总结如下图1.

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图1。

通过磷酸化和腺嘌呤核苷酸调节AMPK。AMPK被三种上游激酶催化的Thr 172磷酸化激活200倍以上：（1）LKB1，它似乎具有组成活性；（2） TAK1，由细胞因子激活（由于其生理意义尚不明确，因此用问号表示）；和（3）CaMKKβ，其通过胞浆Ca的升高而被激活²⁺AMP或ADP与AMPKγ亚单位结合所引发的构象变化刺激了磷酸化，抑制了去磷酸化，这两种效应均被ATP拮抗。AMP结合还导致10倍变构活化；这种作用被ATP和ADP拮抗。去磷酸化Thr 172（PP？）的蛋白磷酸酶的特性尚不清楚。

代谢应激、药物、外源性物质和细胞因子对AMPK的调节

AMPK被代谢应激激活，代谢应激干扰ATP的分解代谢生成（例如葡萄糖缺乏、缺氧、缺血和代谢毒物治疗）或加速ATP消耗（例如肌肉收缩），从而增加细胞ADP:ATP和AMP:ATP比率(哈迪2007). 有趣的是，在AMPK激活缺陷的细胞中（例如，收缩期间LKB1敲除的肌肉细胞[Sakamoto等人，2005年]或用代谢毒物二甲双胍处理的AMPK-α1/-α2双敲除的小鼠肝细胞[Foretz等人，2010年])ADP:ATP和AMP:ATP在代谢应激下的增加要大得多，表明AMPK在野生型细胞中起着维持能量平衡的作用。AMPK也被许多药物和外源性物质激活。其中一些用于临床治疗2型糖尿病（例如二甲双胍[Zhou等人，2001年]和噻唑烷二酮类[傅兰雅等人，2002年])，一些是“营养药品”（例如，红酒中的白藜芦醇[Baur等人，2006年]和绿茶中的表没食子儿茶素没食子酸酯[Hwang等人，2007年])，还有一些是欧洲传统草药中使用的植物产品（例如，最初从中提取二甲双胍的galegine）(Mooney等人，2008年)或亚洲（例如小檗碱[Lee等人，2006年]和硬毛球蛋白[Lin等人，2010年]). 一个令人费解的特点是，如此多结构各异的外源物质如何都能激活AMPK；它们似乎不太可能全部直接与激酶复合物结合。重要的线索来自报告，其中一些化合物通过抑制呼吸链的任一复合物I（例如二甲双胍）来抑制线粒体ATP合成[El-Mir等人，2000年;Owen等人，2000年]或黄连素[Turner等人，2008年])或复合物V，ATP合成酶（例如白藜芦醇）(Gledhill等人，2007年). 上述大多数天然产物都是植物的次生代谢物，有些似乎是作为防御化合物产生的，以阻止昆虫或食草动物的放牧（例如，galegine，由厚朴（Galega officinalis）（一种对食草动物有毒的植物）或抵御病原体的感染（例如，白藜芦醇，是葡萄为应对真菌感染而产生的）(Romero-Perez等人，2001年). 线粒体抑制剂可能用作植物防御化合物，但也可能是AMPK的有效激活剂。为了验证这个想法，Hawley等人（2010）构建的表达AMPK复合物的细胞系，其具有野生型γ2亚型或R531G突变，使γ2复合物对ADP和AMP的增加不敏感。该方法证实，大多数激活AMPK的异种生物，包括二甲双胍、半乳糖碱、噻唑烷二酮类、白藜芦醇和小檗碱，都未能激活R531G突变，表明它们通过增加细胞AMP和/或ADP发挥作用(Hawley等人，2010年).

AMPK除了以细胞自主的方式调节能量平衡外，还受到许多调节全身能量平衡的激素和/或细胞因子的调节，包括瘦素、脂联素和ghrelin(Kahn等人，2005年); 大麻素类(Kola等人，2006年); 甚至甲状腺激素(Lopez等人，2010年). 其中许多药物调节下丘脑中的AMPK。两种瘦素(Minokoshi等人，2002年)和脂联素(Yamauchi等人，2002年)有报道称，肌肉细胞中的AMP水平升高，但这些激素和细胞因子调节AMPK的详细分子机制尚不清楚。

底物识别

AMPK是迄今为止研究的所有蛋白激酶中定义最明确的底物识别基序之一(图2). 这是通过各种方法阐明的，包括合成肽(Weekes等人，1993年;Dale等人，1995年)，用重组底物进行定点突变(Scott等人，2002年)，和肽库方法(Gwinn等人，2008年). AMPK磷酸化具有至少一个基本侧链（通常为R，但可以是K或H）的位点，相对于磷酸化的丝氨酸或苏氨酸残基，该位点具有四个或三个残基N末端（指定为P-4和P-3）。它还需要P-5和P+4处的疏水侧链（通常为L或M，但P-5处的I、V和F也可耐受，P+4时的I、V、F、Q或N也可耐受）。结构建模和定点突变已被用于精确定位激酶结构域上的残基（主要在大叶中），这些残基参与将这些关键侧链结合到底物上(Scott等人，2002年). 激酶结构域上的疏水囊容纳底物上的P-5和P+4疏水侧链，而酸性残基（大鼠α1中的E103/D100/E143）与P-4和P-3碱性侧链相互作用。同一研究揭示了其他积极的决定因素，虽然不是所有底物都存在，但可以改善动力学参数。其中包括P-6的一个碱性残基与激酶结构域（D215/D216/D217）上的另一个酸性斑块相互作用，以及一个从P-16到P-5的两亲性螺旋，它适合于激酶结构域大叶上的疏水槽。该螺旋每隔三或四个残基（包括P-5处的残基）就有重复的疏水侧链，这些疏水侧链排列在结合在凹槽中的螺旋表面(Scott等人，2002年). 虽然这种疏水残基模式在一些底物中很难识别（P-7以外的残基甚至不存在于糖原合成酶中，因为该位点靠近N末端），但在一个具有晶体结构的底物中的这个位置存在两亲性螺旋；即HMG-CoA还原酶(Istvan和Deisenhofer 2000). 肽库方法(Gwinn等人，2008年)揭示了一些额外的决定因素，例如对P-2疏水残基的偏见和对P+3位置极性残基（酸性或碱性）的偏好。在乙酰辅酶a羧化酶-1（ACC1）中，P+3位置是组氨酸，它似乎在激酶结构域的小叶中与天冬氨酸56相互作用(Scott等人，2002年).

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图2。

AMPK识别底物的共识位点对齐(Scott等人，2002年)一些已确定的生理底物的序列（来自人类）。在一致序列中，疏水残基用Φ表示，碱性残基用β表示。AMPK在P-5（通常是M或L，但I、V或F也允许）和P+4（通常是L，但我、M、F、V、Q或N允许）的疏水残基（粗体、蓝色；通常是R，但K或H允许）和P-4、P-3或两者的碱性残基（粗体、蓝色）的上下文中磷酸化丝氨酸残基（苏氨酸也允许）。P-6的另一个基本残基也是一个正行列式，尽管不是必需的(Scott等人，2002年). 一些底物（例如ACC1）也具有疏水性侧链，从P-5沿N末端方向以三到四个残基（粗体，红色）的规则间距排列，形成两亲螺旋。这显然不是必需的，因为肌肉糖原合成酶的序列始于P-7。注意，一个底物（PFKFB2）仍然具有βΦβ基序，但这是在P-5/P-4/P-3，而不是更常见的P-6/P-5/P-4。

在一个基板中（PFKFB2）(图2)磷酸化丝氨酸的碱性-疏水性-碱性基序N末端位于P-5、P-4和P-3，而不是通常位于P-6、P-5和P-4/P-3。因此，该基序和磷酸之间的间距可能有一定的灵活性。然而，值得注意的是，另一个位点具有与PFKFB2相似的序列基序（即内皮型一氧化氮合酶[eNOS]上的Ser 1177），而在无细胞分析中明显被AMPK磷酸化(Chen等人，1999年)，似乎不是完整单元格中的目标(Stahmann等人，2006年,2010). 也有一些蛋白质被声称是AMPK的直接底物，它们甚至更不符合这一共识，包括真核延长因子-2（eEF2）激酶(Browne等人，2004年)，p53(Jones等人，2005年)和第27页^基普1(Liang等人，2007年). 在我看来，这些仍然有可能是间接底物，被AMPK下游作用的激酶磷酸化（或被AMPK抑制的磷酸酶去磷酸化）。

新陈代谢的调节

由于AMPK在维持能量平衡方面的作用，它打开生成ATP的分解代谢途径，同时关闭消耗ATP的合成代谢途径。上调分解代谢途径的例子包括葡萄糖摄取（通过激活两个GLUT1[Barnes等人，2002年]和GLUT4[Holmes等人，1999年;Kurth Kraczek等人，1999年])糖酵解（通过6-磷酸果糖-2-激酶四种亚型中的两种亚型的磷酸化和活化，合成糖酵化激活剂果糖-2,6-二磷酸）(Marsin等人，2000年,2002)脂肪酸摄取（通过脂肪酸转运体FAT/CD36的易位）(Bonen等人，2007年)和脂肪酸氧化（通过乙酰辅酶A羧化酶ACC2亚型的磷酸化，从而降低脂肪酸进入线粒体的抑制剂丙二酰辅酶A[Merrill等人，1997年]). GLUT4在多个水平上上调，通过现有转运体转位到质膜产生快速效应（可能部分归因于AMPK对Rab-GAP蛋白TBC1D1的磷酸化）(Chen等人，2008;Pehmoller等人，2009年)以及对GLUT4基因转录的长期影响（可能部分归因于组蛋白脱乙酰酶5的磷酸化）(McGee等人，2008年). AMPK上调分解代谢的另一种方式是通过增强线粒体的生物生成，这将在下面的单独章节中讨论。

AMPK激活还通过关键代谢酶的直接磷酸化严重抑制许多合成代谢途径。因此，它通过ACC1磷酸化抑制脂肪酸合成，通过HMG-CoA还原酶磷酸化抑制类异戊二烯合成，通过甘油磷酸酰基转移酶失活抑制甘油三酯和磷脂合成（尽管尚不清楚这是否是直接底物），通过糖原合酶磷酸化阻止糖原合成，通过磷酸化RNA聚合酶I转录因子TIF-1A（RRN3）合成核糖体RNA(哈迪2007;Hoppe等人，2009年). AMPK通过一种涉及转录因子SREBP-1c磷酸化的机制，在转录水平下调脂肪酸合成酶的表达，抑制其蛋白水解过程为活性的核形式(Zhou等人，2001年;Li等人，2011年). 它还通过多种机制抑制参与糖异生的mRNA编码酶的转录，如葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。一种涉及CRTC2（环腺苷酸反应元件结合蛋白CREB的转录辅激活子）的磷酸化，导致其被排除在细胞核之外(Koo等人，2005年). 第二个涉及IIA类组蛋白脱乙酰化酶（HDAC-4、HDAC-5和HDAC-7）的磷酸化，再次导致它们被排除在细胞核之外。当存在于细胞核内时，IIA类HDAC（具有催化活性）招募活性脱乙酰酶HDAC3，HDAC3脱乙酰并激活FOXO家族中表达糖异生基因所需的转录因子(Mihaylova等人，2011年). 最后，生长细胞的主要能量消耗是蛋白质合成，蛋白质合成占增殖胸腺细胞ATP消耗总量的三分之一(巴特吉利特和布兰德1995). AMPK通过促进eEF2磷酸化抑制翻译延长（尽管如上所述，eEF2激酶可能不是直接靶点）(Horman等人，2002年;Browne等人，2004年). 此外，AMPK的一个特别重要的靶点是mTOR复合物-1（TORC1），它通过其上游调节因子TSC2的直接磷酸化而关闭(Inoki等人，2003年)和TORC1亚单位猛禽(Gwinn等人，2008年). TORC1由激活Akt和Raf–MEK–Erk通路的氨基酸和生长因子刺激，并通过4EBP1和p70 S6激酶的磷酸化促进翻译的起始和延长(Zoncu等人，2011年).

线粒体生物发生、自噬和有丝分裂的调节

如引言部分所述，原始真核细胞获取线粒体需要开发机制，从而将细胞质中的能量需求转化为线粒体功能的增加，而AMPK似乎在这方面发挥了重要作用。因此，通过反复给大鼠注射AICAR，骨骼肌AMPK慢性激活4周(Winder等人2000)或老鼠(Narkar等人，2008年)导致细胞核编码的线粒体基因上调，在小鼠研究中，提高了跑步机跑步测试中的耐力。有趣的是，第二项研究导致AICAR或“任何其他AMPK激活剂”被列入世界反兴奋剂机构的禁止名单，该机构负责监管体育运动中的药物滥用。

AMPK激活如何上调线粒体功能？线粒体生物发生的所谓“主调节器”是转录辅激活子PGC-1α，它促进由线粒体基因表达的几个因子诱导的转录，包括PPAR-α和PPAR-δ，这些因子打开脂肪酸氧化所需的基因，和核呼吸因子-1和-2（NRF-1/-2）(Lin等人，2005年). NRF-1/-2启动的一个基因是TFAM公司是线粒体DNA复制所需的线粒体基质蛋白。因此，PGC-1α促进新线粒体的生物生成以及核编码线粒体基因的表达。AMPK上调PGC-1α表达的第一个证据来自对表达AMPK显性阴性突变体的小鼠的研究，在该研究中，对β-胍基丙酸（一种导致ATP耗竭的肌酸类似物）的摄入量的反应，线粒体DNA和PGC-1 a mRNA的诱导被取消(Zong等人，2002年). 据报道，AMPK在两个位点直接磷酸化PGC-1α(Jager等人，2007年). AMPK激活PGC-1α功能的另一种机制是NAD催化的脱乙酰化⁺-依赖性脱乙酰酶SIRT1(Canto等人，2010年)尽管AMPK激活SIRT1的确切机制仍不确定。

因此，AMPK激活通过上调PGC-1α促进线粒体的生物发生和核编码线粒体基因的表达。此外，线粒体现在似乎在处理功能失调的线粒体方面发挥着重要作用。线粒体是活性氧产生的主要细胞场所，因此特别容易受到氧化损伤。处理受损的线粒体并回收其内容物以供再次使用，对于保持整体细胞ATP生成能力与生成新线粒体同样重要。

自噬是指细胞质成分（包括线粒体，当这个过程被称为有丝分裂时）的再循环，这些细胞质成分要么功能失调，要么过剩，因为它们被自噬液泡吞噬，然后与溶酶体融合。自噬在细胞饥饿期间变得尤为重要，它是一种回收氨基酸以合成关键蛋白质的手段，也可能是回收细胞成分以用作分解代谢燃料的手段。自噬所涉及的复杂级联事件最初是由芽殖酵母中的遗传方法定义的，但类似的途径现在在哺乳动物中已经得到了很好的理解(王和莱文2010). 自噬被TORC1关闭，最初认为AMPK可能通过抑制TORC1的能力来促进自噬，如前一节所述。然而，现在很明显，AMPK对自噬有更直接的输入，这种输入可能出现在真核生物进化的早期阶段，因为SNF1复合物似乎可以促进芽殖酵母的自噬(Wang等人，2001年). 在自噬级联的顶部并启动该过程的是蛋白激酶ULK1/ULK2（酵母中Atg1的同源序列）。已经发现ULK1和ULK2与AMPK形成相当稳定的络合物(Behrends等人，2010年)AMPK在多个位点磷酸化ULK1（尽管两组鉴定了不同的位点）(Egan等人，2011年;Kim等人2011). 在ULK1或AMPK缺陷的分离小鼠肝细胞中，线粒体明显积聚，表明有丝分裂缺陷。在内源性ULK1被激酶激活突变体或四个丝氨酸残基（被鉴定为AMPK位点）突变为丙氨酸的突变体取代的细胞中，大量形态异常、膜电位降低的线粒体在饥饿时积累(Egan等人，2011年). 在饥饿的压力下存活下来的细胞更少，强调了有丝分裂在细胞功能中的重要作用。

细胞生长和增殖的调节

如前所述，细胞快速生长需要蛋白质、核糖体RNA和脂质的积极合成，所有这些都被AMPK激活所关闭（TORC1失活是导致蛋白质合成抑制的关键事件）。脂肪酸合成是增殖细胞中一个特别活跃的过程(Metallo等人，2009年)AMPK通过一种涉及ACC1磷酸化和失活的双重机制将其关闭(Davies等人，1992年)ACC1、脂肪酸合成酶和其他产脂基因的表达下调(Foretz等人，1998年;Leclerc等人，1998年). 增殖细胞中脂质的高合成率有助于解释众所周知的“Warburg效应”，其中大部分细胞ATP是由糖酵解而非氧化磷酸化生成的。从TCA循环中大量提取柠檬酸盐用于脂质合成意味着该循环不再被用作纯粹的分解代谢途径。值得注意的是，在增殖细胞中，作为柠檬酸盐离开TCA循环的流量可能大于从丙酮酸盐进入TCA循环中的流量，而谷氨酰胺通过逆转部分TCA循环而进入柠檬酸盐的额外流量(图3;Metallo等人，2009年). TCA循环的合成代谢使用需要ATP生产的替代路线；即糖酵解。

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图3。

在含有25 mM葡萄糖和4 mM谷氨酰胺的培养基中生长的肺腺癌细胞系A549的代谢通量分析揭示了快速增殖细胞的代谢（注意A549细胞不表达LKB1，因此AMPK活性很低）(Metallo等人，2009年). 数字是指每毫克蛋白质的估算通量，单位为纳米/分钟。请注意，TCA循环进入脂肪酸合成的流量（可能是合成新膜磷脂所必需的）大于从丙酮酸进入TCA循环的流量。这种不足由谷氨酰胺的补偿性流量弥补，从α-酮戊二酸（αKG）到柠檬酸的流量与TCA循环的通常方向相反。还要注意葡萄糖摄取、糖酵解和乳酸生成的流量非常大。目前已知受AMPK激活下调的过程以红色显示，而已知受AMPK上调的过程以绿色显示。一般来说，AMPK关闭合成代谢（ATP消耗）过程，打开分解代谢（ATP生成）过程。

发生在细胞周期S期的DNA复制过程和发生在M期的有丝分裂过程在能量方面都很昂贵，如果细胞能量状态受到损害，人们可能会期望AMPK激活会阻止细胞周期的进程。事实上，在培养的肿瘤细胞中，AMPK的激活被发现会导致G1–S期细胞周期停滞，这涉及p53和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21的上调和/或稳定^晶片1/Cip1和第27页^基普1(Imamura等人，2001年;Jones等人，2005年;Liang等人，2007年). 这些效应被认为是由p53在Ser 15（p21）的AMPK直接磷酸化触发的^Waf1/Cip1是p53的转录靶点）(Jones等人，2005年)和第27页^基普1在Thr 198(Liang等人，2007年). 然而，这两个位点都不适合公认的AMPK识别基序；p53位点在P-5和P+4具有疏水性残基，但缺少预期的基本残基，而p27位点不常见，因为Thr 198是蛋白质中的最后一个残基。虽然没有理由怀疑完整细胞中AMPK激活导致这些位点磷酸化的发现，但还需要进一步的工作来确认它们是AMPK的直接靶点。

AMPK抑制细胞生长和增殖的能力与AMPK而不是LKB1下游的其他AMPK相关激酶之一负责LKB1的抑癌作用的想法一致。与此相一致的是，在失去上游激酶的肿瘤细胞（例如G361黑色素瘤细胞系）中LKB1的重新表达导致了与AMPK激活相关的细胞周期阻滞(福格蒂和哈迪2009). 这似乎不是由于AMPK相关激酶的激活，因为同样的作用是通过使用钙激活内源性CaMKKβ产生的²⁺离子载体或截短Ca的表达²⁺-CaMKKβ的独立突变体（S Fogarty和DG Hardie，预备）。Fogarty等人（2010年）之前已经表明，虽然CaMKKβ磷酸化并激活AMPK，但它不激活任何AMPK相关激酶。

电池极性的调节

在胚胎发育过程中，缺乏LKB1或AMPK的胚胎在上皮细胞极性方面表现出类似的缺陷D.黑腹果蝇也表现出有丝分裂缺陷，许多细胞变成多倍体(马丁和圣约翰斯顿2003;Lee等人，2007年). LKB1似乎是在没有饥饿的情况下建立上皮细胞极性所必需的，而LKB1和AMPK都是在饥饿条件下维持细胞极性的必要条件(Mirouse等人，2007年). 中的缺陷lkb1号机组-激活的AMPK突变体（含有天冬氨酸代替苏氨酸，相当于Thr 172）的过表达可以部分挽救无效突变体(Lee等人，2007年;Mirouse等人，2007年). 虽然AMPK-缺失小鼠胚胎不会像果蝇属并且在细胞极性方面似乎没有类似的缺陷，然而有证据表明LKB1–AMPK通路参与了哺乳动物上皮细胞极性的维持。已经在肠上皮癌（LS174T）细胞（其缺乏LKB1并且没有表现出细胞极性）中通过通过四环素诱导型启动子重新表达LKB1及其调节亚基STRAD进行了实验。当使用四环素激活LKB1诱导STRAD表达时，肌动蛋白细胞骨架的快速重塑和顶端刷状边界膜的形成是明显的，即使在没有细胞：细胞接触的情况下也是如此(Baas等人，2004年). 值得注意的是，当使用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖激活AMPK时，在LS174T细胞中观察到非常相似的反应(Lee等人，2007年). 最后，在Madin Darby犬肾（MDCK）上皮细胞中，钙离子的清除可以在细胞间形成紧密连接的极化单层²⁺介质中钙的重新添加会导致极性和紧密连接的丧失²⁺在激活AMPK的同时恢复两者。AMPK激活剂AICAR可促进极性和紧密连接的恢复，而显性阴性AMPK突变体的表达可阻断极性和紧密连接的恢复，表明AMPK是必需的(Zhang等人，2006年;Zheng和Cantley 2007).

由于细胞极性的建立和维持是一个需要能量的过程，所以它应该由AMPK促进似乎是违反直觉的，AMPK是一种被能量缺乏激活的激酶。可能，上皮屏障的维持对多细胞生物的生存至关重要，即使在能量紧张的时期也必须保持，因此AMPK有助于转移可能留在这一关键任务中的有限量ATP。另一个更具推测性的建议是，由于AMPK是单细胞真核生物中碳营养素的传感器，原始多细胞真核细胞可能利用这种营养素的传感来区分生物体内外，从而建立具有正确方向的极化上皮屏障。

AMPK在癌症和病毒感染中的作用

发现LKB1是激活AMP应对代谢应激所需的主要上游激酶(Hawley等人，2003年;Woods等人，2003年)首次引入AMPK与癌症之间的联系。LKB1最初被确定为导致遗传性癌症易感性即Peutz-Jeghers综合征的肿瘤抑制因子(Hemminki等人，1998年;Jenne等人，1998年). 患有Peutz-Jeghers综合征的人LKB1基因的功能丧失突变是杂合的(STK11型). 他们的主要临床问题是良性肠息肉的频繁形成，这种息肉似乎是由单倍体不足引起的，尽管它们在其他部位发生恶性肿瘤的风险也大大增加，这可能是由于第二个拷贝的突变导致的STK11型或杂合性缺失。正如对抑癌药的期望一样STK11型该基因在自发性癌症中也经常发生突变，包括约30%的非小细胞肺癌(Sanchez-Cespedes等人，2002年;Ji等人，2007年)20%的宫颈癌，包括导致HeLa细胞系的Henrietta Lacks患者的宫颈癌(Wingo等人，2009年).

AMPK的激活能否解释LKB1的抑癌作用？尽管目前还没有正式的遗传证据证明这一点，但事实似乎确实如此，因为已知LKB1下游有14种蛋白激酶（AMPK的α1和α2亚型，以及12种AMPK相关激酶），AMPK是已知唯一导致生物合成和细胞生长抑制以及细胞周期阻滞的蛋白激酶。当发现LKB1和AMPK之间的联系时，就研究了激活AMPK的药物二甲双胍是否可以预防癌症的发展。研究发现，接受二甲双胍治疗的糖尿病患者的癌症发病率显著低于接受其他治疗的患者(Evans等人，2005年). 尽管这一结果是通过回顾性分析获得的，并且不是一项对照试验，但该发现在其他几个糖尿病人群中也得到了再现，目前正在进行前瞻性试验。目前，有两种方法可以解释这些结果：（1）二甲双胍抑制肝脏的葡萄糖生成（可能部分通过激活AMPK）。随之而来的血糖和胰岛素（也许还有IGF1）的降低改变了早期肿瘤的营养和激素环境，从而间接地对抗肿瘤的发生。（2） 二甲双胍在早期肿瘤中直接激活AMPK，发挥细胞抑制作用。这两个假设并不一定相互排斥，但尚无法与人类的结果区分开来。然而，使用三种不同的AMPK激活剂治疗易患肿瘤的小鼠模型，即二甲双胍、二甲双胍（二甲双胍的一种更有效的姊妹药物）或a-769662（由Abbot开发的一种AMPK直接激活剂）(Cool等人，2006年)-显著延缓肿瘤发展(Huang等人，2008年). 这些实验中使用的小鼠没有糖尿病或胰岛素抵抗，因此药物似乎不太可能通过对肝脏的间接作用发挥作用。此外，由于二甲双胍/二甲双胍和A-769662通过不同的机制激活AMPK(Hawley等人，2010年)，似乎不太可能观察到肿瘤发生的延迟(Huang等人，2008年)是“非目标”的AMPK独立效应。

因此，尽管有证据表明AMPK可能对肿瘤的发展提供保护，就像任何真正的肿瘤抑制剂一样，在已确诊的肿瘤中，可能存在AMPK功能丧失的选择。事实上，在一项乳腺癌研究中，使用针对AMPK上Thr 172和ACC1上Ser 80（一个公认的AMPK靶点）的磷酸特异性抗体进行免疫组化，结果表明，在350例患者中，90%的患者AMPK活化呈下调状态（在肿瘤中，与正常上皮细胞相比）。乳腺癌中这种下调的机制尚不明确，但一个简单的解释是LKB1的缺失，这将阻止AMPK在代谢应激反应中的激活(Hawley等人，2003年). 如前所述，LKB1基因缺失在很大比例的肺癌和宫颈癌中发生。皮肤癌细胞中AMPK下调的另一种机制已被提出(Zheng等人，2009年). 原癌基因B-Raf（V600E，导致结构性激活）的单点突变发生在多达一半的恶性黑色素瘤中。在携带这种突变的黑色素瘤细胞系中，发现LKB1在B-Raf下游的激酶作用下在两个C末端被磷酸化，这可能干扰LKB1磷酸化和激活AMPK的能力(Zheng等人，2009年).

先前的研究结果表明，Akt（蛋白激酶B）在Ser 485对AMPKα1亚单位的磷酸化（相当于α2上的Ser 491）抑制了Thr 172随后的磷酸化以及LKB1随后的活化(Horman等人，2006年). 由于磷脂酰肌醇（PI）3-激酶（产生PI-3,4,5-三磷酸_三]，Akt的激活信号）或脂质磷酸酶PTEN（其分解PIP_三). 在Akt过度激活的肿瘤中，Ser 485的磷酸化会下调AMPK。有趣的是，这种机制已被证明在感染丙型肝炎病毒（HCV）的人肝癌细胞中起作用(Mankouri等人，2010年). 肿瘤发生和病毒感染有某些相似之处：在这两种情况下，异常基因（第一种情况下癌基因激活或抑癌基因丢失，第二种情况下病毒基因组插入）接管了正常的细胞功能，并将细胞从静止状态切换到有活性生物合成的状态。丙型肝炎病毒的RNA基因组编码由单个多聚蛋白裂解而成的10种病毒蛋白，该病毒也有一个脂质包膜。因此，病毒在肝细胞中的复制将需要快速的蛋白质和脂质合成，并增加ATP转换，预计这将激活AMPK（进而降低调节蛋白质和脂质的合成）。然而，当研究HCV感染细胞时，发现与未感染对照组相比，Thr 172处AMPK的磷酸化降低。众所周知，其中一种病毒蛋白（NS5A）结合并激活PI 3-激酶，从而开启Akt途径(Street等人，2004年). 病毒感染细胞中Akt的激活与Akt位点Ser 485的AMPK-α1磷酸化有关(Mankouri等人，2010年). 为了证实这是病毒对Thr 172磷酸化下调的原因，使用编码野生型α1、潜在的拟磷酸S485D突变体或非磷酸化S485A突变体的DNA瞬时转染宿主细胞。只有在表达S485A突变体的细胞中，病毒才能复制失败，这表明AMPK-α1上Ser 485的磷酸化对病毒复制是必要的。有趣的是，还发现用二甲双胍处理细胞可以克服这种下调AMPK的机制(Mankouri等人，2010年). 这不仅表明二甲双胍可能是一种治疗慢性丙型肝炎病毒感染的新方法，也给人们带来了希望，二甲双胍》可以用于逆转Akt过度激活的肿瘤中AMPK的下调。这些结果的另一个有趣的特点是，已知人类慢性HCV感染的两种并发症是肝脂肪变性（脂肪肝）和肝细胞癌。这两种情况都可能发生在AMPK下调的细胞中，因为AMPK关闭脂肪酸和甘油三酯的合成，而如上所述，AMPK的下调可能是肿瘤快速生长的先决条件。

结论和观点

AMPK是几乎所有真核生物细胞能量的关键传感器。它似乎在真核生物进化的早期就出现了，其祖先的角色可能是对首选碳源的饥饿反应。虽然哺乳动物AMPK的经典变构活化仅由AMP引起，但最近研究表明，ADP和AMP通过增强Thr 172的磷酸化来促进活化，可能通过促进磷酸化和抑制去磷酸化来实现。哺乳动物AMPK受细胞ADP:ATP和AMP:ATP比值增加的调节，这一复杂机制意味着它可以在很大范围内以动态、分级的方式对能量缺乏作出反应。尽管AMPK最为人所知的是其对新陈代谢的影响，但现在很清楚，AMPK调节细胞功能的几乎所有方面，包括自噬和线粒体稳态的维持、细胞极性以及细胞生长和增殖。肿瘤细胞和病毒似乎都已发展出下调AMPK的机制，从而摆脱其对生长和生物合成的抑制影响。

致谢

脚注

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