Tor直接控制Atg1激酶复合物调节自噬^▿

重组Atg13的制备。

制备重组Atg13蛋白大肠杆菌，使用pCold TF载体（TaKaRa）。His的表达与纯化₆-如前所述，使用硝基三乙酸（NTA）-琼脂糖珠进行标记触发因子（TF）融合Atg13蛋白(31).

净化他的₆-来自含有p416的酵母细胞（BJ2168）的Atg13镀锌1[他的₆-ATG13]在YEPRaf（3升培养基）中生长，并在2%半乳糖中培养6小时以诱导ATG13表达。将培养物转化为含有酶100T（Seikagaku Kogyo）的球形体，所得球形体在裂解缓冲液（1×磷酸盐缓冲液[PBS]，2 mM Na）中被再悬浮破坏_三VO（旁白）₄，50 mM KF，15 mM Na₂H（H）₂P（P）₂哦₇，15毫米对-硝基苯磷酸盐[对NPP]、1%吐温20、20μg/ml亮氨酸肽、20μg/ml苯甲脒、10μg/ml胃蛋白酶抑制素A、40μg/ml抑肽酶、1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF））。细胞裂解物通过10000×离心10分钟进行清除克。他的₆-使用NTA琼脂糖柱浓缩Atg13蛋白，并通过抗Atg13的免疫沉淀进行纯化。所得沉淀剂经过SDS-PAGE进行质谱（MS）分析。

质谱法。

去除SDS-PAGE凝胶中的蛋白带；用10 mM EDTA、10 mM二硫苏糖醇和100 mM碳酸氢铵在50°C下培养1小时；并在室温下用10 mM EDTA、40 mM碘乙酰胺和100 mM碳酸氢铵处理30 min进行烷基化。用赖氨酰内肽酶对蛋白质进行凝胶内消化溶血性无色杆菌（Wako Pure Chemical Industries）在100 mM Tris-HCl（pH 8.9）中37°C下放置15小时。从凝胶中提取肽片段并浓缩真空中在用ZipTipC18（Millipore）浓缩和脱盐后，对30%乙腈和0.1%甲酸中的肽片段进行质谱分析。在配备纳米电喷雾电离（ESI）源的微质量Q-Tof2混合四极飞行时间质谱仪上，通过直接注入分析获得正离子质谱。以氩气为碰撞气体，通过碰撞诱导解离进行质谱/质谱（MS/MS）。

免疫沉淀和蛋白激酶分析。

TORC1的免疫沉淀和激酶分析如前所述，但有一些修改(18，30).

TORC1直接磷酸化Atg13。

为了确定TORC1是否直接磷酸化Atg13，我们进行了在体外TORC1磷酸化分析。标记的Kog1(^标志Kog1），TORC1的一个组件(7，26)，从酵母细胞裂解物中免疫沉淀，并且共沉淀Tor蛋白的激酶活性（由血凝素[HA]标记的Tor1监测[^哈Tor1]）（图。​（图2A）2安培)使用融合了重组触发因子（TF）的Atg13进行分析。的确，^哈含有Tor1的TORC1容易磷酸化的TF-Atg13（图。​（图2B）。第2页). 然而，TORC1包含^哈Tor1（Tor1）^D2294E型（一个激酶缺失突变体）对TF-Atg13仅显示出边际激酶活性，证实了Tor蛋白的内在活性。相反，与TF-Atg13相比，TORC1对TF-Atg13-8SA的磷酸化程度要低得多。在哺乳动物中，诸如S6K、4E-BP1和PRAS40等mTORC1底物具有保守的TOS基序，这是识别和结合猛禽（Kog1同源基因）所必需的(37，38). 然而，Atg13不包含明显的TOS基序，并且我们没有检测到Atg1或Atg13与^标志Kog1（数据未显示）。

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图2。

TORC1直接磷酸化Atg13在体外（A）免疫沉淀的TORC1的检测。^标志Kog1是免疫沉淀的，野生型^哈检测免疫复合物中包含的Tor1（WT）和激酶缺失D2294E突变体（KD）。使用未标记Kog1的控制实验结果显示在车道1中。α、 反。（B）体外TORC1激酶分析。与面板A一样隔离的TORC1用于在体外以4μg重组触发因子（TF）融合的Atg13（野生型[第1至3道]或Atg13-8SA[第4至6道]）或TF（第7道）为底物进行激酶分析。显示放射自显影（激酶分析）和考马斯蓝染色（CBB）的结果。（C） 使用各种Atg13结构体进行TORC1激酶分析。使用指定的TF-Atg13蛋白进行TORC1分析。TF-Atg13-4SAb和TF-Atg17-7SAb迁移速度比野生型快，可能是因为它们在大肠杆菌细胞。

接下来，我们检查了上述Ser残基是否被TORC1磷酸化在体外将Atg13-8SA中替换的8个Ser残基分为5组（第1组，S348；第2组，S437 S438；第3组，S496；第4组，S535 S541；第5组，S646 S649），丙氨酸替换还原为丝氨酸。Atg13-4SAa（S437A、S438A、S646A和S649A）被TORC1强烈磷酸化在体外支持我们的预测，S348、S496、S535和S541可能是TORC1的目标（图。​（图2C）。2摄氏度). 此外，Atg13-4SAb（S348A、S496A、S535A和S541A）在在体外验证了我们的MS/MS分析，但磷酸化程度低于Atg13-4SAa。因此，TORC1直接磷酸化Atg13，所鉴定的Ser残基是TORC1结合和修饰的候选位点。

Atg13-8SA的表达直接诱导自噬。

Atg13-8SA突变体没有磷酸化，我们假设它在表达时可能作为Atg13的去磷酸化形式体内在TORC1抑制和随后的Atg13去磷酸化后，发生与Atg1激活相关的特定步骤(15，19，20)：Atg1-Atg13复合物形成，它与自噬特异性蛋白（Atg17、Atg29和Atg31）的三元复合物结合，并且Atg1激酶被激活(16，17，19-21). 因此，我们测试了Atg13-8SA是否在没有TORC1抑制的生长细胞中诱导这些事件。HA-标签Atg1(^哈从Atg13表达细胞中免疫沉淀Atg1）并进行分析。如图所示。​图3A，3A级Atg13-8SA表达后，Atg1与Atg13和Atg17的关联以及Atg1激酶活性显著增强。迁移速度更快的Atg13^重量与Atg1共沉淀（图。​（图3A，3A级，车道2），可能是因为它以磷酸化形式的混合物存在（图。​（图3A，3A级，车道8）(19). 然而，这种低程度的磷酸化可能不足以稳定复合物中的Atg17。在Atg13-8SA诱导之前，Atg1活性略有增加，这可能是由于无法诱导Atg1激活的检测不到水平的Atg13-8SA的表达（图。​（图3A，3A级，车道4）。

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图3。

Atg13-8SA促进Atg1复合物形成、Atg1激活和PAS组织。（A） Atg1复合物的形成。含有所示p416的细胞（YYK412）镀锌1[ATG13公司]将生长在SCRaf中的质粒在SCRafGal中培养2h以诱导Atg13蛋白。Atg13和Atg17与in共免疫沉淀^哈免疫印迹法检测Atg1。以髓磷脂碱性蛋白（MBP）为底物检测Atg1激酶的催化活性。星号表示抗-HA腹水识别的总细胞裂解物中的非特异性带。α、 反。（B） Atg蛋白的PAS组装。电池（TMK625，第11天将生长在SCRaf中的Δ）转移到SCRafGal中1 h以诱导Atg13。通过荧光显微镜观察GFP-Atg17和mCherry-Atg8。

Atg蛋白向PAS的招募需要Atg17，这表明Atg17在PAS组织中起着核心作用(43). PAS的组织第11天Δ细胞受到营养条件的严格调节，因为Atg17蛋白仅在自噬诱导条件下在PAS处组装(20，40). 因此，Atg13-8SA表达中Atg17的定位第11天荧光显微镜检查Δ细胞。而GFP标记的Atg17则均匀分布于ATG13公司^重量单元，它定位于PASATG13公司-8SA公司-表达细胞（图。​（图3B）。3B公司). 年，标记为mCherry的Atg8也被招募到PASATG13公司-8SA公司细胞。总之，这些结果表明，Atg13的去磷酸化足以介导Atg1复合物的形成和激活以及Atg蛋白在PAS的组装。

我们感谢A.Nakashima、M.Ohneda、H.Yamamoto和M.Nishimura提供酵母菌株和材料；H.Nakatogawa、K.Okamoto和Ohsumi实验室成员进行讨论；以及国家基础生物研究所分析仪器中心提供技术援助。

这项工作得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部科学研究补助金的部分支持。

我们声明没有利益冲突。