美国国家科学院院刊。2001年5月22日；98(11): 6144–6149.
果蝇属磷脂酰肌醇依赖性激酶-1通过磷脂酰肌醇调节细胞凋亡和生长3-激酶依赖信号通路
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Kyoung Sang Cho（京生町）
*韩国高等研究院生物科学系韩国大田305-701科学技术公司；和†国家遗传创新研究中心重新编程，首尔分子生物学和遗传学研究所韩国首尔国立大学151-742
李俊熙
*韩国高等研究院生物科学系韩国大田305-701科学技术公司；和†国家遗传创新研究中心重新编程，首尔分子生物学和遗传学研究所韩国首尔国立大学151-742
Sunhong Kim先生
*韩国高等研究院生物科学系韩国大田305-701科学技术公司；和†国家遗传创新研究中心重新编程，首尔分子生物学和遗传学研究所国立大学，韩国首尔151-742
Dohoon Kim先生
*韩国高等研究院生物科学系韩国大田305-701科学技术公司；和†国家遗传创新研究中心首尔分子生物学和遗传学研究所重新编程韩国首尔国立大学151-742
Hyongjong Koh公司
*韩国高等研究院生物科学系韩国大田305-701科学技术公司；和†国家遗传创新研究中心重新编程，首尔分子生物学和遗传学研究所韩国首尔国立大学151-742
Jihyun Lee（李继贤）
*韩国高等研究院生物科学系韩国大田305-701科学技术公司；和†国家遗传创新研究中心重新编程，首尔分子生物学和遗传学研究所韩国首尔国立大学151-742
金昌洙
*韩国高等研究院生物科学系韩国大田305-701科学技术公司；和†国家遗传创新研究中心重新编程，首尔分子生物学和遗传学研究所韩国首尔国立大学151-742
Jaeseob Kim先生
*韩国高等研究院生物科学系韩国大田305-701科学技术公司；和†国家遗传创新研究中心重新编程，首尔分子生物学和遗传学研究所韩国首尔国立大学151-742
Jongkyeong Chung先生
*韩国高等研究院生物科学系韩国大田305-701科学技术公司；和†国家基因创新研究中心重新编程，首尔分子生物学和遗传学研究所韩国首尔国立大学151-742
*韩国高等研究院生物科学系韩国大田305-701科学技术公司；和†国家基因创新研究中心重新编程，首尔分子生物学和遗传学研究所韩国首尔国立大学151-742
路易斯安那州斯克里普斯研究所彼得·沃格特编辑加利福尼亚州Jolla，2001年3月22日批准
摘要
磷脂酰肌醇依赖性激酶-1（PDK-1）是一种中枢调节剂磷酸肌醇3-激酶（PI3K）和各种细胞内丝氨酸/苏氨酸激酶，包括Akt/蛋白激酶B（PKB）、p70 S6激酶和蛋白激酶C。最近的细胞转染实验研究表明PDK-1可能参与多种细胞功能，包括细胞生长和凋亡。然而，尽管它在细胞中起着关键作用信号体内PDK-1在中的功能多细胞系统的研究很少。这里，我们有隔离的，孤立的果蝇属PDK-1型(dPDK-1型)突变体和特征体内的角色激酶。果蝇属缺乏dPDK-1型该基因表现出致死性和凋亡性胚胎期的表型。相反，过度表达dPDK-1型细胞和器官尺寸增加果蝇属依赖PI3K的方式。dPDK-1型不仅可以激活果蝇属Akt/PKB公司(数据1)，也可以用体内其哺乳动物同源基因激活Akt/PKB的功能。这个之间的功能相互作用dPDK-1型和数据1通过基因分析进一步证实果蝇属另一方面，cAMP依赖蛋白激酶被认为是dPDK-1型，未与交互dPDK-1型.英寸结论，我们的发现提供了直接证据dPDK-1型调节细胞生长和凋亡在期间果蝇属通过依赖PI3K的开发信号通路并证明我们的果蝇属系统成为解释体内PDK-1的功能和目标。
磷酰肌醇依赖性激酶-1（PDK-1）最初被确定为上游调节因子Akt激酶/蛋白激酶B（PKB）(1–三). 因此体内PDK-1的作用主要是根据Akt/PKB。Akt/PKB是一种生长因子调节的丝氨酸/苏氨酸包含一个pleckstrin同源结构域的激酶，PDK-1也是如此。它作用于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）下游，调节各种细胞活动，包括葡萄糖代谢、转录和蛋白质翻译(4). Akt/PKB也具有负调节作用多种方式的细胞凋亡(5–10). 发挥其作用抗凋亡作用，Akt/PKB或抑制活性促凋亡蛋白，如BAD(11,12)和胱天蛋白酶-9(13)或通过NF-κB-和叉头转录因子依赖途径(14–18). 最近转基因研究果蝇属透露了一件意想不到的事Akt/PKB的功能和PI3K信号通路：该通路发挥作用在控制细胞大小方面发挥重要作用。当途径的一个或多个组成部分，包括PI3K(19),果蝇属akt1（akt1）(数据1) (20)、和果蝇属p70 S6激酶(21)，被下调，细胞在细胞自主方式。
最近的研究还表明，PDK-1参与了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AGC超家族成员(22)，通过其激活环的磷酸化来响应肽生长因子和激素。这个家族中的许多重要激酶，包括Akt/PKB公司(1–三)，p70 S6激酶(23,24)、各种蛋白激酶Cs(25,26)，蛋白激酶C相关激酶(27)和cAMP-dependent蛋白激酶（PKA）(28)，被提议为在里面活泼地或在体外PDK-1的目标。这些结果暗示PDK-1可能在调节这些下游激酶。然而，进一步的调查是需要确定实际体内PDK-1的目标，据揭示，一些AGC家族激酶不是直接的PDK-1磷酸化体内，尽管拥有激活环处的假定PDK-1磷酸化位点被PDK-1磷酸化在体外(29,30). 此外，尽管PDK-1被视为至少其中一部分的调节器重要激酶，激酶在多细胞系统尚未定义。这些差距PDK-1的当前知识促使我们建立果蝇属本节所述PDK-1的模型系统研究。
PDK-1果蝇属同源，dPDK-1型[也已知作为果蝇属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶61（2）；称为dPDK-1型]54%与人类相同催化结构域中的对应物，在非催化羧基末端。在本研究中，我们有已确认dPDK-1型成为果蝇属的正交PDK-1并进一步描述了体内的角色激酶通过各种遗传实验。dPDK-1型能够替代哺乳动物PDK-1激活细胞中的Akt/PKB遗传上与数据1.减值dPDK-1型引起的异位凋亡和发育性如前所述，突变苍蝇在胚胎期被捕在突变体中证明数据1，这是一个众所周知的PDK-1的目标。德国PDK-1还调整了依赖PI3K的方式。这些结果提供了明确的证据dPDK-1型调节果蝇属增长和发展并展示dPDK1在里面依赖PI3K的信号通路。
材料和方法
果蝇属应变。
GAL4驱动程序[已修补(ptc公司)-GAL4、，玻璃多聚体报告器(gmr公司)-GAL4、，适合的(应用程序)-GAL4和热冲击（hs）-GAL4]和绿色荧光蛋白（GFP）平衡染色体（TM3，P（P）{实际GFP}JMR2，序列号1)是从布卢明顿果蝇属印第安纳州布卢明顿库存中心。上游激活序列（UAS）-Dp110和UAS-PI3KDN是来自Sally Leevers，英国伦敦路德维希癌症研究所(19).无人机-数据1由美国大学Morris J.Birnbaum提供宾夕法尼亚州、费城(20). UAS-PKAc和UAS-PKAr是来自John A.Kiger，Jr.，加州大学戴维斯分校(31).
果蝇属胚胎分析。
要隔离dPDK-1型(1)纯合子，GFP平衡染色体（TM3，P{实际GFP}JMR2，序列号1)使用了。因为GFP的合子表达在卵后约12小时开始产蛋时，GFP阴性胚胎被选为dPDK-1型1荧光下的纯合子25°C下蛋后14-16小时显微镜观察（16期）。对于角质层分析，胚胎用漂白剂脱绒毛并固定在60°C的甘油/乙酸（1:4）中放置1小时。然后在显微镜分析之前，在霍耶培养基中清除角质层。末端脱氧核苷酸转移介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析按说明进行(32)，使用在司徒细胞死亡检测试剂盒（罗氏分子生物化学）。对于上位实验-数据1,dPDK-1型1/TM3、Act-GFP、，序号1雌性与hs-GAL4杂交，dPDK-1型1/TM3、Act-GFP、，序号1雄性，后代被收集到尼龙筛。然后对GFP阴性胚胎进行分期（阶段10-12）和37°C热休克8分钟25°C，TUNEL分析如上所述。整体免疫染色基本上如所述进行(33). 抗血凝素（HA）抗体（罗氏分子生物化学）用于检测HA标签数据1在热休克中胚胎。
核糖核酸现场杂交。
现场杂交实验是用地高辛标记RNA探针(34)逆转录酶-PCR（RT-PCR）产品dPDK-1。对于RT-PCR这个dPDK-1型序列被用作PCR引物（5′-AACTACTGCGGCGTTTCATAATTGTGC-3′用于5′引物和3′引物为5′-ATGCTTCCTTGGCCATAGCGGCATTG-3′）。
利用GAL4系统进行异位基因表达。
检测由过表达的dPDK-1型PI3K、PI3K显性阴性（PI3KDN），或数据1，我们使用了UAS-GAL4系统。在此系统中启动子（或增强子）驱动酵母转录的表达激活剂GAL4，它反过来激活含有UAS，持有GAL4结合位点(35). 这个镀锌4基因是放置在组织特异性启动子/增强子附近，允许异位目标基因在所需组织中的表达。例如，私人投资公司-GAL4、，gmr公司-GAL4和应用程序-GAL4直接靶基因在前/后边缘的表达翼室、发育眼和背侧室机翼。此外，我们在研究中使用了hs-GAL4使靶点的热休克依赖性异位表达得以实现的驱动器全身的基因。
为模块化错误表达筛查开发的EP线果蝇属用于检测组织特异性表型(36)在我们的研究中被用来表达dPDK-1。在EP中筛选，在感兴趣的组织中表达GAL4的GAL4系交叉到一组广泛的目标线，每个目标线都带有一个单个目标P元素插入到基因组。靶元件含有一个Gal4响应增强子结束。在含有这两种元素的后代中，内源性靶元件附近的基因应在细胞中诱导表达Gal4。过度表达或错误表达导致的表型然后可以直接对与目标元素相邻的基因进行评分，或者抑制或增强先前存在的突变。
哺乳动物细胞转染与Akt/PKB磷酸转移酶化验。
COS细胞保存在补充有10%FBS的DMEM中（生命Technologies，Grand Island，NY），37°C，加湿大气含5%CO2COS中的瞬时转染用DEAE-右旋糖酐法在60%的汇合处进行细胞培养如制造商手册（Promega）中所述。对于数据1活性测试，300个成人头部被切割和收集与…分开gmr公司-GAL4、，gmr公司-GAL4；无人机-达卡1，或gmr公司-GAL4；无人机-数据1/EP（3）837。头部在缓冲液A中均化（20 mM三氯化碳，pH 7.5/0.1%非奈特P-40/1 mM EDTA/5 mMEGTA/10 mM氯化镁2/50毫米β-甘油磷酸/1 mM原钒酸钠/2 mM DTT/40μg/ml PMSF/10μg/ml亮氨酸肽）。通过以下方法澄清裂解产物在4°C下以14000 rpm离心15分钟。Akt/PKB活动按照描述进行测定(37).
结果
dPDK-1型在以下方面发挥重要作用果蝇属胚胎发生。
为了理解PDK-1在多细胞系统中的作用，我们有含有突变基因的分离苍蝇dPDK-1型轨迹遗传分析。在伯克利大学的帮助下果蝇属基因组计划，我们发现了三个P元件插入突变体，EP（3）837，EP（3）3553和EP（35′或内含子区域dPDK-1型基因（图。A类). 具体来说，插入的EP（3）837和EP（3由反向PCR确定，位于这个dPDK-1型转录起始位点（图。A类). 插入位置和方向P元素被定向诱导基因表达，并暗示这些突变体可用于研究dPDK-1型(36). 正如所料dPDK-1型已观察到在携带gmr公司-GAL4驱动程序，用于指导基因在显影眼（图。J型).另一个EP品系EP（3）3091在dPDK-1型（图。A类). 的插入位置EP（3）3091预测dPDK-1型是被转座子的插入所破坏。的确，EP（3）3091表现出完全致死表型。此外，我们还生成了另一个PDK-1缺陷致死系ΔdPDK5，通过不精确的切除EP（3）837中的P元素。从Southern基因组分析中，我们发现该株含有约10-kb的缺失，其中包括第一个外显子属于dPDK-1型（未显示数据）。这个突变体未能补体EP（3）3091的致死率（数据未显示），表明这两条线是的等位基因dPDK-1型突变体。因此，EP（3）3091和ΔdPDK5以下简称dPDK-1型1和dPDK-1型2，分别（图。A类).
的特征dPDK-1型突变体。(A类)中P元素的插入位置dPDK-1型突变体。三角形表示P元素。两条EP线，EP（3）837和EP（3）3553，在dPDK-1型基因，以及dPDK-1型1有第四个内含子中的P元素。dPDK-1型2是由EP（3）837中P元素的不精确切除产生的。这个删除的网站dPDK-1型2由直线，其包括激酶的第一外显子。(B类)杂合子胚胎dPDK-1型1(dPDK-1型1/TM3、Act-GFP、Ser1)第16阶段。(D类和F类)野生型胚胎第16阶段。(C类,E类、和G公司)dPDK-1型1纯合胚胎(dPDK-1型1/dPDK-1型1)第16阶段。(B类和C类)荧光灯杂合的共聚焦观点(B类)和纯合子(C类)胚胎。GFP仅在杂合子中表达胚胎(B类)中肠和唾液腺。我们可以产蛋后12小时左右首次检测GFP的表达（第15阶段），当合子基因表达开始时。(D类和E类)野生型的表型胚胎(D类)和缺少合子的胚胎dPDK-1型活动(E类). 突变胚胎角质层完全消失。(F类–H（H）)野生型第16阶段的TUNEL信号类型(F类)，胚胎缺乏合子dPDK-1型活动(G公司)、和dPDK-1型1/dPDK-1型1外表达突变胚胎数据1(H（H）). (我)全套免疫染色热冲击（hs+）或控制（hs−）hs-GAL4的分析，dPDK-1型1/无人机-数据1,dPDK-1型1胚胎是用抗HA抗体。HA-标记数据1被强烈诱导在热休克的胚胎中。（放大倍率：×100。）
的影响dPDK-1型单元大小控制。正在扫描外眼的电子显微照片(A类–F类)及其相切截面(G公司–我)代表基因型如下所示。(A类,D类、和G公司)gmr公司-镀锌4/+。(B类,E类、和H（H）)EP（3）837/+。(C类,F类、和我)gmr公司-GAL4/+；步骤（3）837/+。(J型)诱导属于dPDK-1型mRNA在眼影像盘的表达gmr公司-GAL4。样品由EP（3）837/EP（3(上部)或通用磁共振-GAL4/+；EP（3）837/+(下部). 过度表达dPDK-1型mRNA是在gmr公司-GAL4/+；EP（3）837/+作者就地如中所述的杂交材料和方法。(K（K）)飞羽表型的比较应用程序-镀锌4/+(左侧)和应用程序-GAL4/+；EP（3）3553/+(赖特).(插入)右翼的基本视图应用程序-GAL4/+；EP（3）3553/+。（放大倍数：A类–C类, ×200;D类–我, ×1,000;J型, ×100;K（K）, ×20.)
没有纯合子dPDK-1型1和dPDK-1型2苍蝇以幼虫的形式出现表现出胚胎期的致命性。要隔离dPDK-1型1纯合子个体，我们使用如中所述的GFP平衡器染色体材料和方法如图所示。 B类和C类，的GFP阴性胚胎被选为dPDK-1型纯合子。所有孵化的幼虫dPDK-1型1或dPDK-1型2/TM3、GFP、Ser雌性表现为GFP表达。如图所示。E类,dPDK-1型1纯合胚胎产生no腹角质层（与相同年龄表达GFP相比图中的杂合子。D类)而它们并没有发展成为幼虫期。这些结果与突变中的结果相似属于数据1(38)其哺乳动物同源物众所周知PDK-1的目标。简言之，缺少母体和合子数据1活动还导致胚胎死亡，以及有缺陷的角质层形成。
接下来，我们测试了dPDK-1型也与细胞有关生存信号通路。TUNEL分析使用dPDK-1型1纯合胚胎检查激酶参与细胞凋亡，如材料和方法如图所示。G公司,细胞凋亡活性在dPDK-1型合子功能丧失突变体。与广泛的TUNEL信号dPDK-1型1胚胎，我们几乎没有发现同龄野生型胚胎的凋亡活性（图。F类). 此外，诱导的细胞凋亡在里面dPDK-1型1突变胚胎广泛存在被数据1使用hs-GAL4-UAS系统（图。H（H）). 诱导表达数据1通过热休克在胚胎中用于图。H（H）经免疫染色分析进一步证实如中所述材料和方法（图。我). 总的来说，这些结果强烈表明PDK-1在果蝇属胚胎发育和凋亡。
dPDK-1型调节细胞生长和增殖。
如前所述，PI3K途径中的一系列成分包括数据1和果蝇属p70 S6激酶以细胞自主的方式调节细胞大小。因此，我们检查是否过度表达dPDK-1型影响单元格大小在中使用GAL4-UAS系统果蝇。dPDK-1型是在控制下过度表达gmr公司-GAL4，指示发育中眼睛的基因表达。这个异位的过度表达dPDK-1型导致小腹畸形增加尺寸（≈1.33倍于对照，对比图。F类具有D类和E类或图。我具有G公司和H（H）). 此外，我们检测了过度表达dPDK-1型在一个翼盘的特定隔间。翼盘由两部分组成隔室（背部和腹部），折叠并生成扁平机翼叶片。当我们在体外过度表达dPDK-1型在背部隔间应用程序-镀锌4驾驶员，如图所示，EP（3）837的机翼向背侧凸起如图。K（K）。这可能是增加的结果背侧室细胞的大小。的确，类似的在美国观察到这种情况-果蝇属p70 S6激酶苍蝇(21). 这些结果表明dPDK-1型调节细胞和器官大小。
dPDK-1型的下游功能果蝇属PI3K公司。
尽管事实上没有明确的证据表明PDK-1的激酶活性受到调节，该激酶已被发现起作用PI3K下游(1–三). 因此，我们检查了dPDK-1型PI3K可以在飞行线路中进行基因交互，其中dPDK-1型与PI3K或显性阴性共表达Dp110（PI3KDN）。先前的研究表明PI3K的过度表达催化亚单位Dp110增加细胞大小，而过度表达PI3KDN导致相反的表型(19). 单元格中的此更改大小导致器官和身体大小的变化。的过度表达PI3KDN位于ptc公司-GAL4[驱动程序诱导GAL4表达整个前室有一条强度最大的条纹沿着前/后室的边界延伸到后室(39)]导致距离缩短L3和L4矿脉之间（图。A类). 然而，这种表型被dPDK-1型具有PI3KDN（图。B类)，表明dPDK-1型充当PI3K在细胞和小室大小方面的重要下游效应器控件。相反，PI3K野生型的过度表达导致L3和L4静脉之间的距离增加（图。C类),和共表达dPDK-1型PI3K进一步增加了距离以协同方式（图。D类). 这些结果提供强大的体内证据表明dPDK-1型的下游功能果蝇属PI3K控制电池和隔间尺寸。
之间的遗传相互作用dPDK-1型和果蝇属细胞大小控制中的PI3K。微观视图翅膀表达ptc公司-GAL4/UAS-PI3KDN公司(A类),ptc公司-GAL4/UAS-PI3KDN；EP（3）3553号/+(B类),ptc公司-GAL4/UAS-PI3K型(C类)、和ptc公司-GAL4/UAS-PI3K；EP（3）3553/+(D类). 两者之间的相对距离箭头是ptc公司-GAL4/UAS-PI3KDN（58%），ptc公司-GAL4/UAS-PI3KDN；EP（3）3553/+（100%），ptc公司-GAL4/UAS-PI3K（125%），以及ptc公司-GAL4/UAS-PI3K；EP（3）3553/+（142%），分别是。PI3K信号通路活性增加导致交叉静脉的丧失(B类和D类),如报告所示(45).
dPDK-1型是一个数据1上游激酶。
确定是否dPDK-1型功能类似于其哺乳动物对应物，myc标记dPDK-1型，标记了myc人PDK-1（hPDK-1）和/或HA标记的人Akt/PKB在COS细胞中瞬时表达（图。A类). 正如预期，dPDK-1型强烈诱导人类Akt/PKB活性，达到水平与hPDK-1诱导的结果相当。相反显性阴性hPDK-1或显性阴性dPDK-1型强烈抑制表皮生长因子诱导的人类Akt/PKB。这些结果表明果蝇属PDK-1的直系同源基因可以正常发挥功能并替代其哺乳动物将生长因子诱导的激活信号传递给哺乳动物Akt/PKB。
dPDK-1激活哺乳动物和果蝇属Akt/PKB公司。(A类)哺乳动物Akt/PKB的激活果蝇属COS细胞中的PDK-1。这些细胞是瞬时转染pJ3H-人Akt/PKB（Akt）基因加野生型（WT）或激酶死亡（KD；K111I）pJ3 M-人PDK-1（hPDK-1），或pJ3H-Akt加野生型（WT）或激酶死亡（KD；K191I）pJ3米-dPDK-1型用（+）刺激静止细胞或不含（−）表皮生长因子（EGF）。细胞裂解物接受免疫复合物激酶检测以检测HA标记Akt/PKB公司(从顶部算起的第二个)或免疫印迹分析Myc标记的PDK-1(排名第三)和HA-标记Akt/PKB公司(底部). Akt/PKB活动是量化并显示为条形图(顶部).(B类)激活数据1通过dPDK-1型在…的原始组织中果蝇属.头部提取物gmr公司-GAL4/±，gmr公司-GAL4/+；无人机-HA-数据1/+，或gmr公司-GAL4/+；无人机-HA-数据1/EP（3）3553号进行免疫复合物激酶检测以确定是否有HA标记数据1(中部)、和数据1活动被量化并显示为条形图(顶部).相同的组织裂解物用于HA标记的免疫印迹分析数据1(底部).
接下来，我们检查了dPDK-1型可以激活数据1在里面果蝇。为了测试这个,dPDK-1型和HA-标记达卡1在果蝇属眼睛使用gmr公司-GAL4驱动程序和磷酸转移酶活性达卡1是从头部提取物gmr公司-GAL4、，gmr公司-GAL4；无人机-HA-数据1，或通用磁共振-GAL4；无人机-HA-数据1/EP（3）837。如图所示。B类,数据1苍蝇的活动强烈增加共压制dPDK-1型。与此一致，增加了活性，一个电泳延迟的Akt/PKB带，对应观察到高磷酸化和活化形式（图。B类，车道3，下部). 这个生化证据强烈支持数据1确实是生理学上的的目标dPDK-1型.
为了进一步确认体内的角色dPDK-1型,我们研究了达卡1和dPDK-1型在里面果蝇。的过度表达数据1在中果蝇属眼睛增大了眼睛大小并产生了一只肿胀的眼睛，小眼增大（图。 B类,F类、和J型)与对照相比（图。 A类,E类、和我)，如报告所示(20). 除此之外大小发生变化，小眼畸形阵列变得不规则，眼鬃毛不断扩大，数量不断减少。什么时候？dPDK-1型与共存数据1在眼睛里，它显示了严重褶皱的形态（图。C类). 眼鬃毛更严重地扩大了所有小马的边界感光细胞消失（图。 G公司和K（K）). 这些dPDK-1/数据1表型更进一步因剂量增加而增强gmr公司-GAL4驱动器（图。
D类,H（H）、和我). 这些发现一起，清楚地展示功能和遗传相互作用之间dPDK-1型和数据1.
dPDK-1基因与果蝇属阿克特,但没有果蝇属PKA。眼睛外部的扫描电子显微照片(A类–H（H）和M（M）–P（P）)及其相切截面(我–我). 样本的基因型为(A类,E类、和我)无人机-数据1/UAS公司-数据1(B类,F类、和J型)gmr公司-GAL4/+；无人机-数据1/+(C类,G公司、和K（K）)gmr公司-GAL4/+；无人机-数据1/EP（3）837(D类,H（H）、和我)gmr公司-镀锌4/gmr公司-GAL4；无人机-数据1/EP（3）837；(M（M）)gmr公司-GAL4/+；无人机-dPKAc公司/+;(N个)gmr公司-GAL4/+；无人机-dPKAc公司/EP（3）837；(O（运行）)gmr公司-GAL4/+；无人机-dPKAr公司/+;(P（P）)gmr公司-GAL4/+；无人机-dPKAr公司/步骤（3）837。（放大倍数：A类–D类和M（M）–P（P）, ×200;E类–我, ×1,000.)
dPDK-1型不与交互果蝇属PKA公司在体内.
我们还研究了dPDK-1型和果蝇属PKA。如前所述，尽管PKA已经被提议作为PDK-1的假定基底(28)，的在里面活泼地这一点的相关性尚未明确确定。当催化亚单位果蝇属PKA公司(dPAc公司)是在发育中的眼睛过度表达果蝇属，眼睛变色，并因皱纹而肿胀（图。M（M）).眼睛的扫描电子显微镜显示所有小眼和感光细胞的边界消失。然而，与Akt/PKB不同dPDK-1型没有影响这些表型dPKAc公司（图。N个).此外果蝇属PKA公司(dPKAr公司)也没有与dPDK-1型（图。
O（运行）和P（P）). 这些结果支持PKA不是由PDK-1在果蝇属，这是高度一致的最近的结果表明PKA被磷酸化并正常激活PDK-1缺陷细胞系(30). 这些结果强烈支持我们的果蝇属系统与生理学有关用于确定实际值的工具体内PDK-1的目标。
讨论
在本研究中，我们分离并表征了果蝇属PDK-1突变体。这个dPDK-1型-缺乏的在我们的研究中，突变体显示出胚胎的致命性。如图所示。，合子功能丧失突变体dPDK-1型未能长成幼虫，没有形成合适的角质层。这个发现与之前的报告一致，其中PDK-1中断同源基因在芽变和分裂中都导致致死表型酵母(40–42). 此外秀丽隐杆线虫也会导致达斡尔幼虫期的发育停滞(43). 这些结果支持PDK-1活动对正常人至关重要的观点真核生物的发展。
在后生动物的发育过程中，凋亡是一个重要的过程调节组织内稳态。特别是Akt/PKB被牵连通过多种机制对抗这一关键过程，包括促凋亡蛋白的磷酸化和失活，如作为BAD和caspase-9(11–13). 在果蝇属,数据1-缺陷突变体表现出异位诱导胚胎发生过程中的细胞凋亡与缺陷角质层形成(38). 有趣的是数据1突变体为p35半胱天冬酶抑制剂的异位表达拯救了这一疾病，表明半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶参与数据1-介导的细胞凋亡。在本研究中dPDK-1型-缺陷胚胎显示全身广泛的细胞凋亡（图。G公司)，类似于数据1突变体(38). 在此外，正常的非凋亡表型被过度表达数据1在中dPDK-1型突变体。这个这一发现表明PDK-1在细胞凋亡中的作用与生物体的发育，也强烈表明PDK-1的作用Akt/PKB上游在细胞凋亡调控中的作用果蝇属开发，如图。H（H）.与这种可能性相一致，dPDK-1型促进了数据1在里面培养细胞或在原始组织中。此外，dPDK-1型增强数据1眼睛形态发生过程中的表型，包括感光细胞变性和鬃毛增大。
我们的结果也有力地支持了这一点dPDK-1型调节细胞大小。的过度表达dPDK-1型不仅增加了细胞和隔室大小，也抑制了细胞和隔室的缩小PI3KDN的表型。这些结果与之前的结果高度一致结果显示其他PI3K信号分子，如Akt/PKB和p70 S6激酶，参与细胞或器官大小控制。因此，我们可以得出这样的结论dPDK-1型功能介于果蝇属PI3K和数据1传递细胞外信号细胞生长促进信号。
虽然它在两个领域都有牢固的基础在体外和体内Akt/PKB系统(1–三)，p70 S6激酶(23,24)和蛋白激酶C(25,26)是PDK-1的下游目标，最近的在体外研究表明，其他三种AGC家族激酶(28)、RSK(44)，和蛋白激酶C相关激酶(27)受PDK-1监管。然而，进一步的调查是需要确定这些是否真实体内哺乳动物细胞系实验证明PDK-1的靶点这三种激酶的活性不受缺少PDK-1(29,30). 有趣的是，我们的结果表明果蝇属PKA不受dPDK-1型在中体内多细胞系统，与dPDK-1型在里面果蝇属对没有影响PKA过度表达表型。实际上在体外和体内PDK-1的活性没有出乎意料，因为激酶的活性高度依赖于本地化及其上游监管机构的活动在里面活泼地，未计入在体外实验。因此果蝇属我们开发的系统似乎是确定在里面活泼地PDK-1拟议目标的有效性，可用于未来检验RSK和蛋白激酶C相关的有效性激酶作为PDK-1靶点。
总之，我们提供了PDK-1控制的基因证据通过Akt和PI3K依赖性细胞凋亡和细胞生长方式。此外，我们还演示了一种强大的方法阐明体内PDK-1在多细胞系统。
致谢
我们感谢John A.Kiger博士赠送的试剂，小莫里斯·J·伯恩鲍姆博士和萨利·利弗斯博士。这项研究是由基础研究基金2000–2-20900–005-5号拨款支持韩国科学与工程基金会项目科技部分子医学项目。
缩写
| PDK-1型 | 磷脂酰肌醇依赖性激酶-1 |
| PI3K系列 | 磷酸肌醇3-激酶 |
| 巴基斯坦中央银行 | 蛋白激酶B |
| dPDK-1型 | 果蝇属磷脂酰肌醇依赖性激酶-1 |
| 数据1 | 果蝇属akt1（akt1） |
| PKA公司 | cAMP依赖性蛋白激酶 |
| GFP公司 | 绿色荧光蛋白 |
| 无人机 | 上游激活序列 |
| 隧道 | 末端脱氧核苷酸转移介导的dUTP缺口末端标记 |
| 哈 | 血凝素 |
| PI3KDN公司 | PI3K显性阴性 |
工具书类
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