Glycogen synthase kinase 3beta and extracellular signal-regulated kinase inactivate heat shock transcription factor 1 by facilitating the disappearance of transcriptionally active granules after heat shock

doi:10.1128/MCB.18.11.6624

.1998年11月；18(11):6624-33.

doi:10.1128/MCB.18.11.6624。

糖原合成酶激酶3beta和细胞外信号调节激酶通过促进热休克后转录活性颗粒的消失使热休克转录因子1失活

B他¹, 孟Y H, N F米维奇

附属公司

PMID： 9774677
预防性维修识别码：项目编号：109247
内政部： 10.1128/MCB18.11.6624

糖原合成酶激酶3beta和细胞外信号调节激酶通过促进热休克后转录活性颗粒的消失使热休克转录因子1失活

B他等。分子细胞生物学. 1998年11月.

.1998年11月；18(11):6624-33.

doi:10.1128/MCB.18.11.6624。

作者

B他¹, 孟Y H, N F米维奇

附属

¹美国乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院放射科分子医学和遗传学研究所，邮编30912。

PMID： 9774677
预防性维修识别码：项目编号：109247
内政部： 10.1128/MCB18.11.6624

摘要

热休克转录因子1（HSF-1）激活真核生物中热休克基因的转录。在正常生理生长条件下，HSF-1是单体。其转录活性受到构成性磷酸化的抑制。激活后，HSF-1形成三聚体，获得DNA结合活性，增加转录活性，并在细胞核中出现点状颗粒。在本研究中，使用溴尿苷掺入和共焦激光显微镜，我们证明新合成的前mRNA在热休克后与HSF-1点状颗粒共定位，表明这些颗粒是转录位点。我们进一步证明糖原合成酶激酶3beta（GSK-3beta）和细胞外信号调节激酶丝裂原活化蛋白激酶（ERK-MAPK）参与HSF-1转录活性的下调。热休克后短暂增加GSK-3beta的表达促进HSF-1点状颗粒的消失并降低hsp-70转录。我们还证明ERK是GSK-3β的启动激酶。综上所述，这些结果表明，GSK-3beta和ERK-MAPK通过从转录位点分散HSF-1，促进热休克后活化的HSF-1失活。

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数字

图1
HSF-1点状颗粒是转录位点。按照材料和方法中的描述，进行原位运行转录和免疫荧光联合检测。将细胞在45°C下加热30 min，并在37°C下恢复2、4或8 h。执行涉及BrUTP掺入的Run-on转录。然后将细胞固定、染色并用共焦显微镜检查。（A） HSF-1是用抗HSF-1抗体和德克萨斯红结合二级抗体检测到的（在左面板中显示为粒状结构）。用FITC-偶联的抗BrdU抗体检测含BrU的新生转录物（中间显示为绿色荧光斑）。右侧面板显示重叠的左侧和中间面板。黄色染色的图像区域显示HSF-1和新合成的前mRNA的共定位。尺寸（以微米为单位）显示在面板的角落。（B）对细胞进行如图A所示的处理，但以更高的放大倍数显示。左侧面板显示具有4小时（顶部）或8小时（底部）恢复时间的单元格。右侧面板是在与左侧面板相同的时间点通过单个细胞的垂直截面，显示了共定位以及累积的新生转录物。

图2
瞬时转染GSK-3β的HeLa细胞HSF-1的间接免疫荧光分析。（A）转染GSK-3β的细胞的代表性免疫荧光照片（放大倍数，×1000）。用5μg HA–GSK-3β瞬时转染HeLa细胞。转染后48 h，细胞未经处理（对照）或在45°C下热休克30 min，并在37°C下恢复0、4、8或24 h。用鼠抗HA单克隆一级抗体和FITC-结合二级抗体检测到GSK-3β过度表达。用兔抗HSF-1多克隆抗体和德克萨斯红结合二级抗体检测内源性HSF-1。左边的箭头表示GSK-3β过度表达的细胞，右边的箭头表示HSF-1染色的细胞。（B）定量GSK-3β过度表达对HSF-1染色模式的影响。条形图表示HSF-1从点状颗粒（即具有弥散染色模式的细胞）中恢复的细胞百分比。每个时间点统计100多个未转染或GSK-3β转染细胞。（C）凝胶流动性变化分析。HeLa细胞未经处理（通道C）或在45°C下加热30分钟，然后在37°C下孵育0、2、6、8、10或24小时，并按照材料和方法中所述的凝胶迁移率变化分析进行分析。（D）通过磷光成像仪分析对面板C的数据进行定量。

图3
用HA-ERK、HA-MNK或Flag标记的P38瞬时转染的HeLa细胞中HSF-1的间接免疫荧光分析。（A）用5μg HA-ERK1、HA-MNK1或Flag标记的P38 cDNA瞬时转染HeLa细胞。转染后48 h，细胞在45°C下热休克30 min，并在37°C下恢复4 h。用鼠抗HA单克隆初级抗体检测到HA-ERK1和HA-MNK1的过度表达。使用针对Flag表位的单克隆抗体检测到Flag标记的P38的过度表达。用FITC-结合二级抗体检测HA和Flag表位。用兔抗HSF-1多克隆抗体和德克萨斯红结合二级抗体检测内源性HSF-1。左边的箭头表示蛋白激酶过度表达的细胞，右边的箭头表示HSF-1染色的细胞。放大倍数，×1000。（B）定量各种蛋白激酶过度表达对HSF-1染色模式的影响。条形图表示细胞从HSF-1点状颗粒中恢复的百分比。每个时间点统计100多个转染或未转染细胞。

图4
GSK-3β的过度表达导致HSF-1转录活性降低。用编码c-Ha-Ras和hsp70-荧光素酶（70-luc）的构建物瞬时转染HeLa细胞，或与Ha–GSK-3β（+GSK-3 beta）、Ha-ERK（+ERK）或Ha–GSK-3β和Ha-ERK共同转染（+GSK-3 beta+ERK）。转染后24小时，细胞用0.5%FCS血清饥饿24小时。细胞未经处理或在45°C下加热30分钟，然后在37°C下恢复6小时，以积累hsp70荧光素酶。测定荧光素酶活性。数据显示为每次治疗时未加热对照组的倍数增加。

图5
ERK1是GSK-3β的启动激酶。（A）瞬时转染GSK-3β并用PD98059预处理的细胞的间接免疫荧光分析（放大倍率，×1000）。用HA–GSK-3βcDNA瞬时转染细胞。转染后48小时，用30μM PD98059处理30分钟，用PBS冲洗，在45°C下加热30分钟，并在37°C下恢复4小时。如文中所述，检测到过度表达的GSK-3β和内源性HSF-1。左边的箭头表示GSK-3β过度表达的细胞，右边的箭头表示HSF-1染色的细胞。（B）免疫复合物激酶分析。ERK1或JNK1从在45°C下加热30分钟的HeLa细胞中免疫沉淀。免疫沉淀激酶与HSF-1肽在30°C下在25μM未标记ATP存在下单独孵育20分钟。然后使用ERK1或JNK或非磷酸化对照物预磷酸化的HSF-1肽作为底物与纯化的GSK-3β（100 mU）和[γ-³²P] ATP。将反应混合物在30°C下孵育20分钟，将产物点在P81色谱纸上，并用1%磷酸漂洗5次。用闪烁计数器测定放射性。实验一式三份，数据以³²与仅用GSK-3β磷酸化的组相比，P并入用ERK1或JNK1预磷酸化的HSF-1肽。

图6
热休克后GSK-3β的活性。将HeLa细胞在45℃下加热5、10或30分钟，或在45℃加热30分钟，并在37℃下恢复1、2、4、8、10或24小时。然后对其进行裂解，并用GSK-3β抗体免疫沉淀等量的蛋白质。如材料和方法中所述，使用免疫沉淀物磷酸化20μg用免疫沉淀ERK1预磷酸化的HSF-1肽。磷酸化HSF-1肽被发现在P81色谱纸上，并按照图5图例所述进行分析。GSK-3β活性以相对于未加热对照的活性百分比表示。

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参考文献

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