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.1998年9月1日；95(18):10626-31.
doi:10.1073/pnas.95.18.10626。

PIAS1抑制Stat1介导的基因激活

B刘 1, J廖, X Rao公司, S A库什纳, C D钟, D D Chang公司, K帅
附属公司

PIAS1抑制Stat1介导的基因激活

B刘等。 美国国家科学院程序. .

摘要

STAT（信号转导子和转录激活子）蛋白是一种潜在的细胞质转录因子，在细胞因子刺激下通过酪氨酸磷酸化被激活。酪氨酸磷酸化的STAT二聚体化并转位到细胞核以激活特定基因。STAT蛋白家族的不同成员在细胞因子信号传导中具有不同的功能。生化和遗传分析表明，Stat1对干扰素刺激反应中的基因激活至关重要。尽管在理解STAT激活方面取得了进展，但人们对STAT信号是如何下调的知之甚少。我们在这里报道了一个PIAS（活化STAT蛋白抑制剂）蛋白家族的分离。PIAS1，而非其他PIAS蛋白，阻断Stat1的DNA结合活性，并抑制Stat1介导的基因激活，以应对干扰素。协同免疫沉淀分析表明，配体刺激后，PIAS1与Stat1相关，而与Stat2或Stat3无关。体内PIAS1-Stat1相互作用需要Tyr-701上Stat1的磷酸化。这些结果确定PIAS1是Stat1介导的基因激活的特异性抑制剂，并提示在每个STAT信号通路中可能存在特异性PIAS抑制剂。

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数字

图1
图1
PIAS蛋白家族的序列比较。显示了PIAS1、PIAS3、PIASxα、PIASxβ和PIASy的预测氨基酸序列。h、 人类；m： 鼠标。半胱氨酸和组氨酸残基被预测会形成锌指。保守的酸性区域被装箱。点表示氨基酸身份。
图2
图2
PIAS1抑制Stat1介导的基因激活。(A类)荧光素酶报告分析。将[（3x）Ly6]荧光素酶报告子构建物与空表达载体FLAG–Stat1或各种数量的FLAG–PIAS1载体单独或联合转染人293细胞，如图所示。用干扰素-γ处理或不处理细胞6小时。显示了干扰素γ处理后的倍数增加。(B)蛋白质印迹分析。等量的蛋白质提取物A类用抗FLAG（Sigma）进行免疫印迹分析。
图3
图3
PIAS1抑制Stat1的DNA结合活性。使用Daudi细胞制备的核提取物进行EMSA分析，在不存在或存在GST、GST–PIASxα、GST-PIAS3或GST–PAAS1蛋白（15–75 ng）的情况下，使用（+）或（−）IFN-α处理。使用的探针是高亲和力Stat1–DNA结合位点（10）。以不同稀释度的BSA为标准，在7%SDS/PAGE上估计GST融合蛋白的浓度。
图4
图4
PIAS–STAT相互作用的特异性。(A类)PIAS1与Stat1交互体内制备未经IFN-α处理（−）或处理（+）15分钟的Daudi细胞蛋白提取物，并用于抗PIAS1n的免疫沉淀。然后在SDS/PAGE上分析免疫沉淀物，并用抗Stat1探针检测印迹。用抗PIAS1清洗过滤器并重新进行处理(下部). (B)PIAS1不与Stat2交互。用干扰素-α处理Daudi细胞达到指定时间。制备了全细胞提取物，其中一半用于抗PIAS1n的免疫沉淀(左侧). 按照中所述进行免疫沉淀A类用anti-Stat1和anti-Stat2探测过滤器。用抗PIAS1n清洗并重新处理同一过滤器(下部). 另一半蛋白质提取物经过抗Stat1免疫沉淀(赖特). 用抗Stat1和抗Stat2抗体的混合物探测过滤器。p-Stat1，磷酸化Stat1。(C类)蛋白质印迹分析。HepG2细胞未经处理或用IL-6或IFN-γ处理15分钟，制备蛋白质提取物，并用所示的抗Stat1、抗pStat1（新英格兰生物实验室）、抗Stat3（圣克鲁斯生物技术）或抗pStat3（新英格兰生化实验室）进行免疫印迹分析。(D类)PIAS1与Stat1交互，但与Stat3交互。蛋白质提取物C类用抗PIAS1n免疫沉淀。对沉淀进行电泳，并用抗Stat1蛋白印迹过滤器(左侧). 对同一个过滤器进行清洗，并用抗Stat3重新进行处理(左侧)或用抗PIAS1n重新进行试验(下部). (E类)与相同D类除抗PIAS3c用于免疫沉淀外。使用anti-Stat3探测过滤器(左侧)或反Stat1(赖特)或PIAS3c(下部).
图5
图5
PIAS1–Stat1相互作用需要对Stat1的Tyr-701进行磷酸化。用Stat1或Stat1（Tyr-701→Phe）突变蛋白补充的U3A细胞未经处理或用IFN-γ处理15分钟，并制备蛋白提取物。(A类)用抗Stat1进行免疫沉淀，然后用特定的磷酸酪氨酸抗血清[anti-pTyr（KY，Lexington，Transduction Laboratories）]进行印迹。对同一个过滤器进行清洗，并用抗Stat1重新进行处理(下部). (B)用抗PIAS1n抗血清进行免疫沉淀，并用抗Stat1进行印迹。用抗PIAS1清洗过滤器并重新进行处理(下部).
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