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比较研究
.1997年9月8日；138(5):1149-57.
doi:10.1083/jcb.138.5.1149。

ICAP-1是一种新的β1整合素胞质结构域相关蛋白，与β1整合素的保守且功能重要的NPXY序列基序结合

D D Chang公司 1, C Wong先生, H史密斯, J刘
附属公司
比较研究

ICAP-1是一种新的β1整合素胞质结构域相关蛋白，与β1整合素的保守且功能重要的NPXY序列基序结合

D D Chang公司等。 J细胞生物学. .

摘要

整合素的细胞质域对细胞粘附至关重要。我们报告了一种新蛋白ICAP-1（整合素胞质域相关蛋白-1）的鉴定，该蛋白与1整合素细胞质域结合。ICAP-1和β1整合素之间的相互作用具有高度特异性，如ICAP-1与其他β整合素的细胞质域之间缺乏相互作用所示，并且需要在β1整合素细胞质域的COOH末端区域发现一个保守且功能重要的NPXY序列基序。突变研究表明，NPXY基序的Asn和Tyr以及位于该基序NH2末端的Val残基对ICAP-1结合至关重要。ICAP-1的两种亚型，一种是200-氨基酸蛋白（ICAP-1alpha），另一种是较短的150-氨基酸蛋白质（ICAP-1β），来源于交替剪接的mRNA，在大多数细胞中表达。ICAP-1α是一种磷酸化蛋白，其磷酸化程度由细胞-基质相互作用调节。首先，当细胞被镀在纤维连接蛋白涂层上而非非特异性聚赖氨酸涂层表面时，观察到ICAP-1α磷酸化增强。第二，组成性激活的RhoA蛋白的表达破坏了细胞-基质相互作用，导致ICAP-1α去磷酸化。细胞-基质相互作用对ICAP-1α磷酸化的调节表明，ICAP-1在整合素依赖性细胞粘附中起着重要作用。

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数字

图1
图1
ICAP-1α是一种新型富含丝氨酸/苏氨酸的20-kD蛋白。(A类)ICAP-1的序列。ICAP-1α的翻译氨基酸序列如图所示。ICAP-1β中缺失的50个氨基酸用斜体下划线表示。核苷酸序列数据可从GenBank/EMBL/DDBJ获得，登录号为AF012023。(B)ICAP-1α的Northern印迹分析。不同人类组织（Clontech）转录物的Northern blots与ICAP-1αcDNA探针杂交。所有八个组织样本中均表达0.9-kb mRNA。来自下游多聚腺苷化位点的小1.3kb mRNA在所有八个样本中也以不同的数量表达。(C)ICAP-1的Western blot分析。使用多克隆抗ICAP-1抗体（lane）在293T细胞的总细胞裂解液（5μg）中检测到ICAP-1α和ICAP-1β1). ICAP-1α和ICAP-1β的分配通过瞬时表达ICAP-12)和ICAP-1βcDNA（车道三)293T细胞中。(D类)示意图中显示了全长200-aa ICAP-1α和缺乏内部50-aa的选择性拼接ICAP-1β。
图1
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ICAP-1α是一种新的富含丝氨酸/苏氨酸的20kD蛋白。(A类)ICAP-1的序列。ICAP-1α的翻译氨基酸序列如图所示。ICAP-1β中缺失的50个氨基酸用带下划线的斜体表示。核苷酸序列数据可从GenBank/EMBL/DDBJ获得，登录号为AF012023。(B)ICAP-1α的Northern印迹分析。不同人类组织（Clontech）转录物的Northern blots与ICAP-1αcDNA探针杂交。所有八个组织样本中均表达0.9-kb mRNA。来自下游多聚腺苷化位点的小1.3kb mRNA在所有八个样本中也以不同的数量表达。(C)ICAP-1的Western blot分析。使用多克隆抗ICAP-1抗体（lane）在293T细胞的总细胞裂解液（5μg）中检测到ICAP-1α和ICAP-1β1). ICAP-1α和ICAP-1β的分配通过瞬时表达ICAP-12)和ICAP-1βcDNA（车道三)293T细胞中。(D类)示意图中显示了全长200-aa ICAP-1α和缺乏内部50-aa的选择性拼接ICAP-1β。
图2
图2
ICAP-1α和β的体内外相互作用1整合素。(A类)GST-β之间的相互作用1和体外ICAP-1α。使用网织红细胞裂解物（lane）在体外合成ICAP-1α（aa 54–200）1)并与2μg含有整合素β胞质域的细菌表达的GST融合蛋白孵育1（车道2), β2（车道三)、和αL（左）（车道4). (B)GST-ICAP1α和β的相互作用1体内整合素。ICAP-1α（aa 54–200）（车道1)和全长ICAP1α（车道2)利用真核表达载体pEBG在293T细胞中表达为GST融合蛋白。对于控制器，GST-Stat1（车道三)和GST（车道4)使用了。内源性β的共沉淀1用TS2/16（抗人β1整合素抗体）。(C)ICAP1α的限制性结合特异性。GST-ICAP1α在293T细胞中表达，以及α的表达结构L（左）β2或αL（左）β2-1（嵌合β2具有被β的COOH末端21aa取代的COOH末端20aa的亚基1整合素）。转染整合素与GST-ICAP1α的共沉淀用抗α蛋白免疫印迹法测定L（左）抗体。车道1和2，表达GST-ICAP1α和α的细胞的总裂解物L（左）β2（车道1)和αL（左）β2-1（车道2). 车道三和4，与车道中的样本相同1和2分别在GST“下拉”之后
图3
图3
ICAP-1α是一种磷酸蛋白。(A类)Western blot分析显示ICAP-1表达。使用抗ICAP1抗体在Western blot上分析来自不同细胞系的总细胞裂解物（15μg）。ICAP-1α和ICAP-1β的位置以及与磷酸化ICAP-1(p-ICAP1α)显示。(B)体外磷酸酶处理实验。15μg UTA-6细胞裂解物在30°C下培养30分钟1，输入；车道2，在钒酸钠和花萼蛋白A存在下培养；车道三，在30°C下培养。
图4
图4
细胞粘附期间ICAP-1α磷酸化的调节。将UTA-6细胞胰蛋白酶化，并将其重新放置在涂有聚乳酸的平板上-我-赖氨酸(PLK公司)（车道1和三)或纤维连接蛋白(FN公司)（车道2和4). 粘附细胞在0.5%NP-40中以t吨=15分钟（车道1和2)、和t吨=30分钟（车道三和4)用抗ICAP-1抗体在Western blot上测定ICAP-1α磷酸化程度。
图5
图5
RhoA蛋白对ICAP-1α磷酸化的控制。(A类)活化RhoA的表达会干扰细胞的扩散。显示了在四环素诱导启动子控制下表达RhoA（Q63L）的UTA-6细胞的形态。在缺乏四环素诱导RhoA（Q63L）表达的情况下，细胞保持圆形，无法扩散。(B)活化RhoA的表达导致ICAP-1α去磷酸化。在使用抗ICAP1抗体的蛋白质印迹分析中评估表达RhoA（Q63L）的两个独立衍生的UTA-6细胞系中ICAP-1α磷酸化的程度。在亲代细胞中（车道1)或存在四环素（车道2和4)，ICAP-1α的很大一部分被磷酸化。RhoA（Q63L）的诱导与ICAP-1α磷酸化的丢失有关三和5).
图5
图5
通过RhoA蛋白控制ICAP-1α磷酸化。(A类)激活的RhoA的表达会干扰细胞的扩散。显示了在四环素诱导启动子控制下表达RhoA（Q63L）的UTA-6细胞的形态。在缺乏诱导RhoA（Q63L）表达的四环素的情况下，细胞保持圆形，无法扩散。(B)活化RhoA的表达导致ICAP-1α去磷酸化。使用抗ICAP1抗体进行Western blot分析，评估两个独立衍生的表达RhoA（Q63L）的UTA-6细胞系中ICAP-1α磷酸化的程度。在亲代细胞中（车道1)或存在四环素（车道2和4)，ICAP-1α的很大一部分被磷酸化。RhoA（Q63L）的诱导与ICAP-1α磷酸化的丢失有关三和5).
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