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.2013;11（4）：e1001545。
doi:10.1371/journal.pbio.1001545。 Epub 2013年4月23日。

RanBP2/Nup358增强编码分泌蛋白的mRNA亚群的翻译

科希拉·马哈德万 1, 张慧（音）, 阿卜杜拉·阿基夫, 仙英阿翠, 谢尔盖·格鲁索夫, 坎·塞尼克, 弗雷德里克·P·罗斯, 亚历山大F宫
附属公司

RanBP2/Nup358增强编码分泌蛋白的mRNA亚群的翻译

科希拉·马哈德万等。 公共科学图书馆生物. 2013.

摘要

在高等真核生物中，大多数编码分泌或膜结合蛋白的mRNA含有促进替代mRNA核输出（ALREX）途径的元素。在这里，我们报告了ALREX促进因子在上游核因子存在的情况下也能增强翻译。这些RNA元素直接与RanBP2/Nup358的锌指重复序列相互作用，并可能与之共同进化，该锌指重复片段存在于核孔的细胞质表面。最后我们表明，RanBP2/Nup358不仅是ALREX促进元件刺激翻译所必需的，而且也是靶向内质网（ER）和线粒体的蛋白质高效全局合成所必需的。因此，在出口完成后，含有ALREX元件的mRNAs可能与RanBP2/Nup358相互作用，这一步骤是在细胞质中高效翻译这些mRNAs。因此，ALREX元件充当核苷酸平台，协调编码分泌蛋白的大多数mRNA的转录后调控的各个步骤。

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利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。ALREX促进SSCR促进翻译。
（A） 对于中的每个密码子MHC公司,2Ile-MHC公司SSCR公司(x个-轴），每1000个密码子在人类基因组中出现的频率（“Freq/1000”；年-轴）绘制。请注意，两个亮氨酸到异亮氨酸的突变被圈出。（B） 密码子分析Ins公司,2检查SSCR如（A）所示。（C–L）U2OS细胞与含有不同版本的自由贸易区基因，以及第二个质粒，该质粒包含（“+”）或缺少（“−”）H1B-GFP型基因。作为对照，用缺乏自由贸易区基因（“载体”）。然后在转染后18–24小时对细胞进行分析。（C–D）细胞裂解物通过SDS-PAGE分离，并用HA表位、GFP和α-微管蛋白抗体进行检测。从细胞裂解物中提取（E–F）RNA，在变性琼脂糖凝胶上分离，并使用Northern blotting分析[32P] -针对的标记探针自由贸易区和GFP公司抄本。（G–H）细胞质和细胞核中发现的总mRNA的百分比由自由贸易区mRNA荧光原位杂交。每个条形代表三个独立实验（每个实验至少包含30个单元格的平均值）之间的平均值和标准误差。（I–L）对于表达指定版本的自由贸易区，细胞百分比(年-轴）具有不同数量的SG(x个-轴）绘制。请注意，SGs是通过Tia1免疫染色检测到的，但几乎总是在自由贸易区mRNA。对于每个图，分析了>160个细胞（I–J）和>580个细胞（K–L）。请注意，虽然>15%2Ile-INS-ftz型表达细胞有SG，在表达INS-赫兹.（M）对于前17个密码子(x个-axis）在野生型和4Ile突变体中的表达CALR（校准）基因，每1000个密码子在人类基因组中出现的频率(年-轴）。请注意4个日历被圈起来。（N–P）U2OS细胞与含有任一版本HA标记的质粒共同转染CALR（校准）基因，以及第二个质粒，该质粒包含（“+”）或缺少（“−”）H1B-GFP型基因。作为对照，用缺乏CALR（校准）基因（“载体”）。转染后18–24小时对细胞进行分析。（N） 用SDS-PAGE分离细胞裂解物，并用HA表位、GFP和α-微管蛋白抗体进行检测。（O） 从细胞裂解物中提取RNA，在变性凝胶上分离，并使用[32P] -针对的标记探针CALR（校准）和GFP公司RNA。（P） 细胞质和细胞核中总mRNA的百分比由CALR（校准）mRNA荧光原位杂交。
图2
图2。ALREX促进元素需要核因子才能刺激ftz蛋白合成。
（A–C）向COS-7细胞的细胞质（A，C）或细胞核（B）微量注射体外合成、封端和聚腺苷酸MHC-英尺mRNA和FITC-标记的70kDa右旋糖酐。2小时后，用探针将细胞固定并用FISH染色自由贸易区mRNA和使用针对Tia1（A–B）或eIF3B（C）的抗体的免疫荧光。每行代表一个单元格字段。注意，在细胞质注射的细胞中MHC-英尺mRNA积累在富含Tia1和eIF3B的细胞质聚集体中（见（A和C）中的重叠部分）。（D–E，H）NIH-3T3细胞微量注射FITC-标记的70kDa右旋糖酐，并在体外合成、封端和聚腺苷化MHC-英尺mRNA，未经处理（D–E）或预先与HeLa核提取物（H）孵育。将细胞孵育3 h，然后固定并使用针对FLAG表位的抗体进行免疫荧光染色。每行代表单个细胞场，这些细胞被微注射到细胞质（D，H）或细胞核（E）中，如通过70kDa右旋糖酐的分布所确定的。请注意，当MHC-英尺mRNA直接导入细胞质，只有在与核提取物预先孵育后才能翻译。比例尺=20µM。（F–G）NIH-3T3细胞微注射MHC-英尺mRNA和FITC-标记的70 kD右旋糖酐，单独或与HeLa核提取物（“+NE”）一起，位于细胞核或细胞质中。固定细胞，然后对FLAG（F–G）或HA（F）表位进行免疫染色。（F） 注射后3 h，对细胞的FLAG和HA免疫荧光总积分强度进行量化。（G） 通过FLAG免疫荧光的出现来测量微注射细胞表达ftz蛋白的百分比，并在注射后的每个时间点进行量化。（F–G）中的每个数据点/条由三个实验的平均值组成，每个实验都包含>100个单元格。误差条表示实验之间的标准偏差。
图3
图3。HeLa核提取物中ALREX元素相关蛋白的鉴定。
（A–B）各种[32P] -标记的RNA片段，82(Ins公司SSCR、，7A-英寸SSCR和βG ORF的5′端）或86(MHC公司SSCR）核苷酸长，与或不与HeLa核提取物（“NE”）孵育，并在非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，并通过放射自显影术进行可视化。（C）[32P] -已标记Ins公司SSCR RNA与越来越多的各种未标记RNA片段混合，然后与NE孵育。反应在非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，并通过放射自显影术进行可视化。（D–F）链亲和素包被磁珠，与各种生物素化RNA（每个76个核苷酸长）或不含任何RNA（“无RNA”）结合，用于从HeLa核提取物中分离蛋白质。通过首先用RNase A处理珠粒（D，泳道1-4），然后在90°C下在SDS中变性5分钟（D，泳道5-8）来洗脱蛋白质。（D） 洗脱蛋白的银染凝胶。右侧显示了质谱鉴定的谱带。使用识别RanBP2、RanGAP1、Ran或FG-repeat Nucleoporin蛋白（mAb414）的抗体，通过免疫印迹分析（E–F）洗脱蛋白和NE。
图4
图4。RanBP2锌指直接与ALREX元素相互作用。
（A） 在细菌中表达并纯化RanBP2基因的各种His-tagged（TPR，三肽重复区；RBR1/2，ran binding domain-containing region 1/2；C-Term，carboxy-terminal domain）或GST-tagged的片段（E3，E3 SUMO连接酶域）。蛋白质经SDS-PAGE分离，考马斯蓝染色。在出现多条带的情况下，在抗His-tag免疫印迹上检测到的蛋白质用星号表示。（B） RanBP2的域结构。注意，该蛋白包含四个1型Ran结合域（RanBD1）、八个ZFRs、一个E3连接酶域、一个顺反式脯氨酸异构酶域和几个FG重复。（C–D）[32P] -已标记Ins公司SSCR RNA与纯化蛋白孵育，在非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后通过放射自显影术显示。注意，ZFD与Ins公司RNA。（E） 各种[32P] 标记的RNA片段与ZFD蛋白孵育，在非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后通过放射自显影术显示。（F）[32P] -已标记Ins公司SSCR RNA在没有或存在各种未标记RNA的情况下与ZFD蛋白片段一起孵育。复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后通过放射自显影术进行可视化。（G） 数量图[32P]（P）英寸-含络合物(年-轴）存在各种数量的未标记RNA(x个-轴）。每个点是两个独立实验的平均值和标准偏差。（H） 在加载GTP或GDP前后，细菌表达的ZFD和GST标记Ran的考马斯染色。为了估计Ran和ZFD蛋白的水平，凝胶上还装载了不同数量的BSA。（一） ZFD与BSA或Ran预先孵化，然后与GDP或GTP一起孵化[32P] -已标记Ins公司SSCR RNA。在非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离复合物，然后通过放射自显影术进行可视化。
图5
图5。SSCR中的腺嘌呤缺失与后生动物中RanBP2锌指的数量相关。
（A–B）对于每种生物体，分析来自至少500个编码分泌蛋白基因的ORF（单个值见表S2）。分析了前99个核苷酸或随机延伸的99个核苷酸中最长无腺嘌呤轨道的平均长度。（A） 对于每种生物体，平均无腺嘌呤轨道长度(年-轴）相对于ZFR的数量绘制(x个-轴）在RanBP2基因中。（B） 前99个核苷酸中无腺嘌呤轨道长度与99个核苷酸随机延伸的比率(年-轴）与RanBP2中的ZFR数量绘制(x个-轴）。趋势线和相应的决定系数（R2)也包括在内。注意，对于一种后生动物，人类P（人类头虱），RanBP2中既没有腺嘌呤消耗也没有ZFRs。还要注意非后生动物(盘状D和酿酒酵母)缺乏SSCR特异性腺嘌呤缺失和RanBP2基因。（C） 一个系统发育树，描述了导致人类P.
图6
图6。ALREX介导的翻译增强需要RanBP2。
（A） U2OS细胞感染含有针对RanBP2或对照病毒的shRNA1慢病毒。感染后4天，收集细胞裂解物，用SDS-PAGE在6%丙烯酰胺凝胶上分离，并对RanBP2或α-微管蛋白进行免疫染色。（B–E）U2OS细胞感染慢病毒，慢病毒传递shRNA1对抗RanBP2或对照病毒。感染后三天，细胞被转染含有多种自由贸易区构造和H1B-GFP型.转染后18–24 h，通过免疫印迹（B，在C中定量）和mRNA（D，在E中定量）分析蛋白质水平。每个条形代表六个独立实验的平均和标准误差。*，第页<0.025; **,第页<0.01. （F） 感染后三天，U2OS细胞被转染含有MHC-英尺.转染后18–24小时MHC-英尺FISH检测细胞质和细胞核中的mRNA。一条代表三个实验的平均值，每个实验由20-30个细胞组成。误差线表示三个实验之间的标准偏差。（G） 用各种慢病毒处理U2OS细胞。感染后4天，固定细胞并用FISH染色poly（A）mRNA。绘制细胞质或细胞核中poly（A）mRNA的平均水平。一条代表三个实验的平均值，每个实验由20-30个细胞组成。误差线表示三个实验之间的标准偏差。（H） 慢病毒介导的shRNAs递送同时耗尽U2OS细胞中的UAP56和URH49。感染后4天，收集细胞裂解物，用SDS-PAGE分离，并对这两种蛋白和α-微管蛋白进行免疫染色。（I–K）U2OS细胞感染含有针对RanBP2（shRNA3）3′UTR的shRNA慢病毒或对照病毒。（一） 感染后三天，用含有GFP-RanBP2或GFP-RanBP 2Δ6ZFR的质粒或不含质粒的质粒（“模拟”）转染细胞。在允许表达48小时后，收集细胞裂解物，并使用抗GFP、RanBP2和α-微管蛋白的抗体通过免疫印迹进行检测。请注意，GFP-RanBP2结构不包含内源性UTR，并且能够抵抗shRNA3的耗竭。（J–K）感染后第三天，用含有MHC-ftz和GFP-RanBP2、GFP-RanBP 2Δ6ZFR或H1B-GFP的质粒共同转染细胞，并允许表达48小时。使用抗GFP和抗HA一级抗体以及适当的荧光二级抗体对细胞进行免疫染色。（J） 对于同时表达GFP和MHC-ftz的细胞，将HA-免疫荧光强度制成表格，取平均值，然后将其归一化为表达MHC-ftz的模拟、对照shRNA-处理细胞的表达水平。每个条形代表四个独立实验之间的平均误差和标准误差，每个实验由30-50个单元格组成。用shRNA3耗竭内源性RanBP2并表达各种GFP-RanBP2构建体和MHC-ftz的细胞的实例如（K）所示。每行是GFP和HA的单场联合免疫染色。请注意，表达GFP-RanBP2的细胞（顶行，箭头）表达的MHC-ftz水平高于仅表达MHC-ftz的相邻细胞（顶排，箭头）。相反，表达GFP-RanBP2Δ6ZFR（底行，箭头）的细胞表达的MHC-ftz蛋白与仅表达MHC-ftz的细胞表达量一样多（底排，箭头）。未转染细胞用星号表示。比例尺=20µM。
图7
图7。RanBP2班次消耗MHC-英尺 从多聚体到单聚体。
U2OS细胞被慢病毒感染，慢病毒传递shRNA1对抗RanBP2或对照病毒。（A–D）感染后三天，用含有MHC-英尺和H1B-GFP型.转染后18–24小时，将0.6 ml细胞裂解物分层到10.5 ml蔗糖梯度（25%–45%）上，并在200000下离心克手动收集10个等分（梯度顶部在左侧），在变性琼脂糖凝胶上通过电泳纯化和分离RNA。通过溴化乙锭染色分析18S和28S rRNA的分布（定量见图S5）和自由贸易区和GFP公司用Northern blot（A–B）分析mRNA。注意，单体主要存在于分数3-4中。（C–D）等级(年-轴）每个片段中的两个mRNA(x个-轴）通过密度计分析进行分析并绘制。每个数据点都是三个独立实验的平均值和标准误差。（E–F）感染后三天，用含有MHC-英尺（E）立即固定细胞以显示细胞质和核mRNA，或用洋地黄素短暂渗透以去除所有未固定在ER上的细胞质mRNA，然后如前所述固定细胞，。MHC-英尺通过FISH染色显示mRNA，并在一次实验中计算至少30个细胞与每个隔室相关的荧光强度分数。每个条形代表三个独立实验之间的平均误差和标准误差。（F） 转染细胞被固定以可视化MHC-英尺mRNA通过FISH和Tia-1通过免疫荧光。细胞百分比(年-轴）具有不同数量的SG(x个-轴）绘制。每个条形代表三个独立实验的平均误差和标准误差。（G） 感染后4天，将含有MHC-英尺20分钟后，通过添加α-鹅膏氨酸终止了进一步的mRNA合成，2小时后固定细胞。细胞染色MHC-英尺mRNA、Tia-1和SG的列表如（F）所示。*，第页<0.025; **,第页<0.01.
图8
图8。RanBP2是高效翻译分泌蛋白所必需的。
用各种慢病毒处理（A–B）U2OS细胞，然后在含有[35S] -蛋氨酸/半胱氨酸20分钟。通过不同的洗涤剂处理和离心步骤对细胞进行裂解和亚分离，以产生三种组分：一种富含核蛋白，另一种含有ER和线粒体蛋白，以及剩余的细胞质蛋白。（A） 比率[35S] -测量每个组分与总蛋白的结合，并将其归一化为对照细胞。每个条形代表三个独立实验的平均误差和标准误差。请注意，当细胞在预处理前15分钟用翻译抑制剂高三尖杉酯碱（HHT）预处理时，放射性并入部分被阻断[35S] -蛋氨酸/半胱氨酸标记，证明组分不含游离（即未结合）标记氨基酸。（B） 利用针对Trapα（常驻ER蛋白）、F1 ATP酶α（线粒体蛋白）、α-微管蛋白（细胞质蛋白）和层粘连蛋白a/C（核蛋白）的抗体，通过免疫印迹分析敲除细胞和对照细胞的各种细胞组分。用各种慢病毒处理（C–D）U2OS细胞，然后在含有[35S] -蛋氨酸/半胱氨酸作用20分钟。细胞被裂解，BiP和α-微管蛋白被特定抗体免疫沉淀。然后通过SDS-PAGE分离沉淀物，并通过放射自显影术观察沉淀物。通过密度计测量谱带强度，然后将其标准化为对照细胞，并绘制三个独立实验之间的平均值和标准误差（D）。（E） U2OS细胞用各种慢病毒处理，然后在感染后4天立即固定细胞以显示细胞质和细胞核poly（A）mRNA，或者用洋地黄素短暂透化以去除所有未锚定在ER上的细胞质mRNA，然后固定。用荧光寡核苷酸探针通过FISH染色显示Poly（A）mRNA，并在单个实验中计算至少30个细胞与每个隔室相关的荧光强度分数。每个条形代表三个独立实验之间的平均误差和标准误差。
图9
图9。ALREX调节过程的一般模型。
（1） 含有ALREX-promoting SSCR的mRNA被打包成mRNP，并通过未知机制导出。（2） 输出的mRNA在核孔的细胞质表面与RanBP2瞬时相互作用。这种相互作用可能会导致mRNP内发生一些改变。（3）最终，这种相互作用会促进这些mRNAs转化为内质网表面的分泌蛋白。
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