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。2013年7月；59（1）：98-104。
doi:10.1016/j.jhep.2013.02.016。 Epub 2013年2月26日。

内质网应激通过自噬诱导肝星状细胞的成纤维活性

弗吉尼亚·埃尔南德斯·赫亚 1, 莫伊拉·希尔舍尔, 拉斐尔·罗森菲尔德, 玛丽贝尔·P·林, 娜塔莉亚·尼托, 萨宾·沃纳, 拉克希米·A·德维, 斯科特·弗里德曼
附属公司

内质网应激通过自噬诱导肝星状细胞的成纤维活性

弗吉尼亚·埃尔南德斯·赫亚等人。 肝脏病学杂志。 2013年7月。

摘要

背景和目标：肝损伤期间的代谢应激通过瘢痕基质的分泌增强自噬并刺激星状细胞活化。蛋白质合成增强的条件增加了内质网（ER）折叠能力的需求，并触发未折叠蛋白反应（UPR）以应对由此产生的ER应激。活性氧（ROS）的产生是肝纤维化的一个共同特征，氧化应激和内质网应激之间存在串扰。我们研究的目的是确定氧化剂和内质网应激对星状细胞活化的影响。

方法：在培养的肝星状细胞中使用过氧化氢或在体内使用乙醇诱导氧化应激，并分析UPR。由于UPR的分支主要受IREα影响，我们在星状细胞中阻断了这一途径，并分析了纤维生成反应、自噬和下游MAPK信号。在氧化应激条件下，还评估了星形细胞中的Nrf2抗氧化反应。

结果：培养物中的H2O2处理或体内的乙醇喂养增加了基于XBP1 mRNA剪接的UPR，从而触发自噬。在内质网应激条件下，通过其靶基因的qRT-PCR测定，Nrf2介导的抗氧化反应也被诱导。相反，星状细胞IRE1α通路的阻断以p38 MAPK依赖的方式显著降低了其激活和自噬活性，导致纤维生成反应降低。

结论：这些数据暗示了蛋白质折叠质量控制在调节肝星状细胞纤维化反应中的机制。

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数字

图1
图1。氧化应激诱导内质网应激
内质网应激相关基因的（A，B）实时定量RT-PCR分析Bip、Chop、Atf4和附件6，归一化为家务基因-肌动蛋白（A）从乙醇喂养大鼠分离的大鼠星状细胞和（B）用H处理的JS1细胞2O（运行）2（C）标准RT-PCR新业务流程1显示拼接亚型（sXbp1）增加。（D，E）ATF6和ATF4的Western blot分析，GAPDH显示为加载控制。信使RNA标准化为看家基因-肌动蛋白，表示为相对于对照的折叠变化（*P<0.05；误差条表示SEM）。蛋白质比率（标准化为GAPDH）用于量化相对于对照组的折叠变化，并在每个印迹下方的绘图中显示。数据表示3个实验的平均值(*P（P）<.05，NS=不显著）。
图2
图2。阻断IRE1通路导致星状细胞活化和自噬减少
（A） 成纤维基因第11列、第12列, -斯马和-脉冲多普勒频率信使RNA（q-rt rt-PCR）和（B）它们在表达DNIRE1或对照的JS1细胞中的蛋白表达。（C） 免疫印迹显示表达DN IRE1或对照的JS1细胞经PDGF-BB刺激后总ERK和AKT水平降低。（D） 乙醇喂养大鼠星状细胞和H处理的JS1细胞的免疫印迹2O（运行）2，显示LC3II转化率增加（LC3II/LC3I比率），P62降低。（E） 表达DNIRE1或对照的JS1细胞的免疫印迹显示，在基线条件下和（F）用溶酶体抑制剂CQ处理后，LC3降低。标准化为持家基因肌动蛋白的信使RNA表达为相对于对照的倍数变化（**P＜0.001：误差条表示SEM）；与面板B使用相同的螺栓，因此具有相同的载荷控制。数据表示至少3个实验的平均值。蛋白质比率（标准化为GAPDH或Gln合成酶）用于量化相对于对照的倍数变化，并显示在每个印迹下或作为绘图图（图2D）。数据表示至少3个实验的平均值（*P<0.05**P（P）< .001)
图2
图2。阻断IRE1通路导致星状细胞活化和自噬减少
（A） 成纤维基因第11列、第12列, -斯马和-脉冲多普勒频率信使RNA（q-rt rt-PCR）和（B）它们在表达DNIRE1或对照的JS1细胞中的蛋白表达。（C） 免疫印迹显示表达DN IRE1或对照的JS1细胞经PDGF-BB刺激后总ERK和AKT水平降低。（D） 乙醇喂养大鼠星状细胞和H处理的JS1细胞的免疫印迹2O（运行）2，显示LC3II转化率增加（LC3II/LC3I比率），P62降低。（E） 表达DNIRE1或对照的JS1细胞的免疫印迹显示，在基线条件下和（F）用溶酶体抑制剂CQ处理后，LC3降低。标准化为持家基因肌动蛋白的信使RNA表达为相对于对照的倍数变化（**P＜0.001：误差条表示SEM）；与面板B使用相同的螺栓，因此具有相同的载荷控制。数据表示至少3个实验的平均值。蛋白质比率（标准化为GAPDH或Gln合成酶）用于量化相对于对照的倍数变化，并显示在每个印迹下或作为绘图图（图2D）。数据表示至少3个实验的平均值（*P<0.05**P（P）< .001)
图3
图3。IRE1调节p38/MAPK通路
（A，B）经TNC（A）处理的JS1细胞p38和磷酸化p38的蛋白质印迹，以及DN IRE1细胞的基线表达（B）。用P38抑制剂SB 203580处理的JS1细胞的COL 1、ASMA、LC3和P62的（C，D）蛋白印迹。以calnexin或GAPDH作为加载控制，进行了三种不同的实验。数据表示至少3个实验的平均值。蛋白质比率（标准化为calnexin或GAPDH）用于量化相对于对照组的折叠变化，如图所示在下面每个污点。数据表示至少3个实验的平均值(*P（P）< 0.05).”
图4
图4。氧化应激诱导Nrf2依赖性抗氧化反应
（A-C），Nqo1、Gstm、Gclc、Gclm、Srx和编号2用q-rt rt-PCR评估H处理的（A）JS1细胞信使RNA的表达2O（运行）2（B） 从乙醇喂养大鼠分离的星状细胞和（C）表达DN IRE1的JS1细胞。（D）GST活动。（E）Nrf2、Nqo1、Gclc、Gstm Srx通过q-rt rt-PCR评估表达DN NRF2的星状细胞中信使RNA水平。（F） 第11列、第12列, -斯马, -脉冲多普勒频率和百万分之二通过q-rt rt-PCR评估表达DN NRF2的原代星状细胞中信使RNA水平。信使RNA标准化为看家基因-肌动蛋白，表示为相对于对照的折叠变化（*P<0.05，**P<0.001：误差条表示SEM）。数据表示至少3个实验的平均值。
图4
图4。氧化应激诱导Nrf2依赖性抗氧化反应
（A-C），Nqo1、Gstm、Gclc、Gclm、Srx和编号2用q-rt rt-PCR评估H处理的（A）JS1细胞信使RNA的表达2O（运行）2（B） 从乙醇喂养大鼠分离的星状细胞和（C）表达DN IRE1的JS1细胞。（D）GST活动。（E）Nrf2、Nqo1、Gclc、Gstm Srx通过q-rt rt-PCR评估表达DN NRF2的星状细胞中信使RNA水平。（F） 第11列、第12列, -斯马, -脉冲多普勒频率和百万分之二通过q-rt rt-PCR评估表达DN NRF2的原代星状细胞中信使RNA水平。信使RNA标准化为看家基因-肌动蛋白，表示为相对于对照的折叠变化（*P<0.05，**P<0.001：误差条表示SEM）。数据表示至少3个实验的平均值。
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