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.2012年9月12日；31(18):3691-703.
doi:10.1038/emboj.2012.225。 Epub 2012年8月10日。

Atg1/ULK1激酶与泛素样蛋白Atg8的结合调节自噬

克劳迪娜·卡夫 1, 莫妮卡·基扬斯卡, 埃亚尔·卡利, Edyta Siergiejuk公司, 宋思利（Sung Sik Lee）, 朱塞佩·塞姆普利西奥, 英格丽德·斯托菲尔, 安德烈亚·布列佐维奇, 玛雅卡Verma, 伊莎贝拉·汉斯曼, 古斯塔夫·阿莫勒, 凯·霍夫曼, 莎伦·图兹, 马提亚斯·彼得
附属公司

Atg1/ULK1激酶与泛素样蛋白Atg8的结合调节自噬

克劳迪娜·卡夫等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

自噬是一种细胞内运输途径，将细胞质隔绝，并将多余和受损的货物输送至液泡进行降解。Atg1/ULK1激酶是核心自噬机制的重要组成部分，可能在饥饿时与Atg13结合而激活。事实上，我们发现Atg13直接与Atg1结合，并且消除这种相互作用的特定Atg13突变会干扰体内的Atg1功能。令人惊讶的是，Atg13与Atg1的结合是组成性的，并且不会因营养条件或用雷帕霉素复合物靶点1（TORC1）抑制剂雷帕霉素处理而改变。我们确定Atg8是Atg1/ULK1的一种新型调节因子，它以依赖LC3相互作用区域（LIR）的方式直接与Atg1/ULK1结合。分子分析表明，Atg13和Atg8在不同的步骤上协同调节Atg1的功能。Atg8将Atg1/ULK1靶向自噬体，在自噬体内可能促进自噬体成熟和/或与液泡/溶酶体融合。此外，Atg8结合触发酵母中Atg1-Atg13复合物的液泡降解，从而将Atg1活性与自噬通量耦合。总之，这些发现定义了酵母和哺乳动物自噬调节中的一个保守步骤，并扩展了依赖LIR的Atg8靶点的已知功能，包括Atg1/ULK1激酶的空间调节。

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图1
图1
与Atg1结合的Atg13促进Cvt和自噬功能，但不受饥饿条件的调节。(A类)出芽酵母Atg13的示意图，以及Atg1结合区域与不同酵母物种同源物的比对。Atg1装订所需的残留物用灰色方框标记。带圆圈的“P”标记Atg13上已知的磷酸化位点。N： 氨基末端蛋白；C： 羧基末端。(B类)包含Atg13（wt）的432–520氨基酸或相应的FV突变体（FV）的片段在大肠杆菌并与纯化自大肠杆菌（GST-Atg1）。输入（5.5%）和结合蛋白通过考马斯蓝染色进行分析，该染色对与其大小成比例的蛋白质进行染色。标记蛋白的大小（以kDa为单位）如左图所示。(C类)ATG1-TAP atg13将含有内源性GFP标记的Atg17、Atg29或Vac8和野生型（wt）或Atg13 FV突变型（F468A；V469A）的Δ细胞生长至对数中期。Atg1被免疫沉淀，并通过免疫印迹分析其与Atg13和GFP标记蛋白的关联。提取输入如补充图S1B所示。(D类)atg1处Δ和atg1处Δ第13天表达HA标记Atg1的Δ细胞和含有空质粒的野生型（wt）细胞生长到对数中期（富），然后用雷帕霉素（rapa）处理或在SD-N培养基（starv）中饥饿4h。免疫沉淀Atg1，并通过免疫印迹分析其与Atg13的相关性。请注意，从富培养基中生长的细胞中分离出的磷酸化Atg13在SDS-PAGE上迁移稍慢，其程度与我们在凝胶条件下观察到的典型迁移相对应。(电子)将含有内源性标记的Atg1-TAP（带有或不带有内源性标记Atg13-GFP）的酵母细胞，或含有内源性标签的Atg13-TAP和Atg1-GFP（由着丝粒质粒表达）的细胞培养至对数中期（富），并用雷帕霉素（rapa）处理或在SD-N培养基（starv）中饥饿4小时。对Atg1-TAP和Atg13-TAP进行亲和纯化，并通过western blotting分析其与GFP标记蛋白的关联。(F类)组蛋白3-HA标记的Atg1与野生型（wt）或与Suv甲基化酶（Suv）融合的Atg13-FV突变体一起表达atg1处Δ第13天Δ电池，或与Pbs2-Suv一起用于控制atg1处Δ单元。对数生长的培养物用雷帕霉素（rapa）处理0或120分钟，并通过制备细胞提取物和用抗三甲基化特异性抗体进行蛋白质印迹来监测甲基化。请注意，Suv-、GFP-或TAP-标记的Atg13具有完全的功能，但是，在我们的凝胶条件下，未标记的蛋白质没有表现出磷酸化诱导的迁移率降低的特征。(G公司)atg1处Δ第13天将含有TAP标记的野生型Atg1（wt）或Atg1激酶死亡（kd）K54A突变体和野生型Atg 13、Atg13-FV突变体或空质粒的Δ细胞培养至中对数期。Atg1被免疫沉淀并通过放射自显影术测定其自身磷酸化活性体外试验。(小时)照片8Δ60磷13Δ第13天表达野生型Atg13（wt）、Atg13-FV突变体（FV）或空质粒的Δ细胞生长至对数中期，并在SD-N培养基中饥饿4h。在“材料和方法”中所述的三个独立实验中测量了Pho8Δ60特异性碱性磷酸酶（ALP）活性（nmol/min/mg），并绘制了与野生型对照组相比具有标准偏差（s.d.）的相对ALP活性图。(我)第13天表达GFP-Atg8并含有野生型Atg13、Atg13-FV突变体或空质粒的Δ细胞在SD-N中生长至中对数期，在饥饿和不饥饿的情况下生长4h。通过western blotting分析内源性Ape1的加工和GFP-Atg 8的裂解，并通过计算裂解与未裂解Ape1或GFP-Atg8的比率进行量化，分别是。星号表示Atg13抗体检测到的非特异性带。图源数据可以通过补充数据找到。
图2
图2
Atg1以依赖LIR的方式绑定Atg8。(A类)芽殖酵母Atg1的示意图表示及其假定的LIR基序与不同物种的Atg1同源物的序列比对。预测的LIR基序的保守残基用灰色方框表示，突变靶向残基用星号（*）标记。Atg1激酶结构域下划线，Atg13结合区以黑色阴影显示。带圆圈的“P”标记Atg1上已知的磷酸化位点。N： 氨基末端；C： 羧基末端。(B类)GST-Atg8或GST-泛素（Ub）从大肠杆菌并绑定到GSH珠子上。从酵母中纯化野生型Atg1-TAP或VE和EYE突变体，与固定化GST蛋白和结合蛋白孵育，并通过western blotting分析。(C类)GST-Atg8和GST-泛素按照(B类)，并探索其结合从野生型或第13天Δ单元。(D类)atg1处Δ第13天表达所示野生型Atg1-TAP或VE或EYE突变体的Δ细胞，以及野生型Atg 13或Atg13-FV突变体的细胞生长到中对数期。Atg1被免疫沉淀，并通过western blotting检测其与Atg13的关联。(电子)GST、GST-LC3B、GST-GATE16和GST-GABARAP从大肠杆菌并绑在珠子上。将表达野生型（wt）HA-ULK1或DFP突变体的细胞制备的HEK293细胞裂解物与珠培养，并通过western blotting分析结合蛋白。(F类)将GFP或GFP-GABARAP与野生型HA-ULK1或DFP突变体共同转染HEK293细胞。将GFP和GFP-GABARAP固定在GFP-Trap树脂上，通过western blotting分析HA-ULK1结合。图源数据可以在补充数据中找到。
图3
图3
Atg1中的LIR域在功能上很重要体内试验。(A类)atg1处Δ第13天将含有空对照质粒、野生型或指示的Atg1突变体、以及Atg13野生型、Atg13 FV突变体或空质粒的Δ细胞生长到中对数期。通过western blotting分析内源性Ape1的加工过程，并如图1I图例所示进行量化。不同蛋白的表达由抗Atg1或Atg13抗体的免疫印迹控制。星号表示Atg13抗体检测到的非特异性带。(B类)第8页Δ60磷13Δatg1处表达野生型（wt）、激酶死亡（kd）、Atg1-VE（VE）或-EYE（EYE）突变体或空质粒的Δ细胞生长至对数中期，并在SD-N培养基中饥饿4h。在“材料和方法”中所述的三个独立实验中测量了Pho8Δ60特异性碱性磷酸酶（ALP）活性（nmol/min/mg），并绘制了与野生型对照组相比具有标准偏差（s.d.）的相对ALP活性图。(C类)单元格，如中所示(A类)表达GFP-Atg8的细胞在SD-N培养基中饥饿4h后生长至对数中期。GFP-Atg8的加工过程如图1I所示进行了分析和量化。(D类)呈指数级增长atg1处Δ和atg1处Δatg8型通过荧光显微镜检查表达PAS标记物Ape1-RFP和GFP标记的野生型Atg1或Atg1-VE突变体的Δ菌株。棒材=5μm。(电子)atg1处含有TAP标记野生型或所示Atg1突变体的Δ细胞生长到对数中期。Atg1被免疫沉淀在体外放射自显影法测定自身磷酸化活性。激酶死亡（kd）Atg1突变体K54A作为阴性对照。图源数据可以通过补充数据找到。
图4
图4
Atg1/ULK1定位于酵母和哺乳动物的自噬体。(A类)呈指数级增长密码7Δ细胞在SD-N培养基中饥饿4h，裂解并将提取物分离为细胞质（S）和5000克膜颗粒分数。用（+）或不使用（−）TX-100处理颗粒，离心，并用抗Atg1、抗Pep12和抗Pgk1抗体进行免疫印迹分析上清液（S）和颗粒（P）组分。(B类)呈指数级增长密码7Δatg1处表达野生型Atg1或Atg1-VE突变蛋白的Δ细胞在SD-N中饥饿4h，裂解并将提取物分离为细胞质（S）和膜（P）部分。用抗Atg1、抗Pgk1和抗Ape1抗体对组分进行western blotting分析，并量化颗粒组分中Atg1与Ape1的比率，并将其表示为与野生型细胞的比率。(C类)用GFP-GABARAP和HA-ULK1共同转染HEK293细胞，饥饿2h，然后免疫染色HA（红色）和WIPI2（白色）。箭头标记假定的自噬体，这三种标记均为阳性。巴=10μm。(D类)用野生型HA-ULK1或DFP突变体转染稳定表达GFP-LC3的HEK293细胞，饥饿2h后进行HA和WIPI2免疫染色。使用Imaris软件对70多个细胞（两个实验中的一个）的HA-ULK1和WIPI2斑点数进行计数，并绘制为ULK1与WIPI2点状细胞的比率***表示具有统计显著性P（P）-值<0.0001。展示了两个独立实验中的一个。(电子)表达野生型HA-ULK1或DFP突变体的HEK293细胞中HA-ULK1和WIPI2斑点数的量化。细胞按上述方法处理，并使用Imaris软件计算斑点数。具有代表性的免疫荧光图像如补充图S3F所示。***和*表示P（P）-值分别小于0.0001或0.0158。图源数据可以通过补充数据找到。
图5
图5
在饥饿期间，Atg1与自噬体一起进入液泡。(A类)atg1处将含有野生型Atg1或带有GFP标记的激酶缺失型Atg1-T226A突变体的Δ细胞培养至对数中期，然后在SD-N中饥饿24小时。在指定的时间点采集样品，并通过western blotting分析GFP的裂解。饥饿条件下内源性Ape1的处理监测自噬通量。(B类)atg1处含有GFP标记的野生型Atg1或Atg1-VE突变体的Δ细胞按照(A类). (C类)atg1处Δ第四人民党含有YFP标记野生型Atg1或Atg1-VE突变体的Δ细胞生长到对数期并在SD-N中饥饿。通过延时显微镜监测细胞，并按照“材料和方法”中的描述量化Atg1的空泡堆积。数据绘制为至少90个量化细胞的平均值±标准偏差。补充图S3H中显示了其他图像。棒材=5μm。(D类)atg1处Δ第13页表达GFP标记的野生型Atg13的Δ细胞、野生型Atg 1或Atg1-VE突变体（左面板）以及含有Atg13-GFP和野生型Atg13或Atg13-FV的野生型细胞生长到对数中期，然后在SD-N培养基中饥饿6小时。western blotting分析GFP裂解。图源数据可以通过补充数据找到。
图6
图6
Atg13和Atg8在Atg1监管方面的合作模式。Atg13构成对Atg1的约束。饥饿时，Atg1通过自身磷酸化激活，进而磷酸化Atg13，从而进一步增加其激酶活性。Atg1通过其LIR基序与Atg8结合，触发其从PAS中移除，并介导其与自噬体的关联。自噬体上的Atg1可能磷酸化参与自噬体内成熟的未知底物。自噬体融合后，Atg1–Atg13复合物在液泡/溶酶体中降解，从而限制饥饿期间的自噬流量。
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