Regulation of mTORC1 signaling by pH

doi:10.1371/journal.pone.0021549

.2011;6（6）：e21549。

doi:10.1371/journal.pone.0021549。 Epub 2011年6月29日。

pH对mTORC1信号的调节

阿鲁纳·D·巴尔吉¹, 格雷厄姆·H·迪林, 伊丽莎白·多诺霍, 凯伦·K·Y·林, 布鲁诺·D·丰塞卡, 卡拉·齐默尔曼, Masayuki Numata公司, 米歇尔·罗贝奇

附属公司

PMID： 21738705
预防性维修识别码： PMC3126813型
内政部： 10.1371/journal.pone.0021549

pH对mTORC1信号的调节

阿鲁纳·D·巴尔吉等。公共科学图书馆一号. 2011.

.2011;6（6）：第21549页。

doi:10.1371/journal.pone.0021549。 Epub 2011年6月29日。

作者

阿鲁纳·D·巴尔吉¹, 格雷厄姆·H·迪林, 伊丽莎白·多诺霍, 凯伦·K·Y·林, 布鲁诺·D·丰塞卡, 卡拉·齐默尔曼, Masayuki Numata公司, 米歇尔·罗贝奇

隶属关系

¹加拿大不列颠哥伦比亚大学生物化学和分子生物学系，温哥华。

PMID： 21738705
预防性维修识别码： PMC3126813型
内政部： 10.1371/journal.pone.0021549

摘要

背景：细胞质和细胞外环境酸化与许多生理和病理条件有关，如剧烈运动、缺氧和肿瘤发生。酸化影响重要的细胞功能，包括蛋白质合成、生长和增殖。其中许多重要功能由mTORC1控制，这是一种主调节蛋白激酶，可被各种生长刺激信号激活，并在饥饿条件下失活。mTORC1是否也能响应细胞外或细胞质pH值的变化，并在酸性条件下限制合成代谢过程中发挥作用尚不清楚。

方法/结果：我们研究了将细胞外培养液从pH 7.4酸化至6.4对人乳腺癌MCF-7细胞和永生化小鼠胚胎成纤维细胞的影响。通过测量mTORC1底物S6K的磷酸化来评估降低细胞外pH值导致细胞内酸化和快速、分级和可逆的mTORCl抑制。结节性硬化症复合物TSC2基因是mTORC1的主要负调控因子，被删除的成纤维细胞在酸性细胞外条件下无法抑制mTORC2，这表明TSC1-TSC2复合物是该反应所必需的。对汇聚在TSC1-TSC2复合物上的主要上游通路的检查表明，Akt信号不受pH值的影响，但Raf/MEK/ERK通路受到抑制。药物对MEK的抑制仅引起适度的mTORC1抑制，这意味着其他未知途径也起主要作用。

结论：本研究揭示了TSC1/TSC2复合物和mTORC1在感知环境pH值变化中的新作用。作为低组织灌注、低葡萄糖利用率和高能量消耗的共同特征，酸性pH值可作为mTORC1下调能量消耗合成代谢过程（如蛋白质合成）的信号，作为对代谢应激条件的适应性反应。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。酸性细胞外pH对mTORC1信号的快速可逆抑制。**
A、将MCF-7细胞暴露于缓冲至指定pH值的细胞培养基中5分钟或30分钟。使用磷酸化-Thr抗体通过免疫印迹分析裂解液中的mTORC1激活³⁸⁹S6K和S6K以及使用磷酸化-Ser抗体激活mTORC2⁴⁷³PKB/Akt和PKB/Akt。采用管蛋白免疫检测作为蛋白质负荷控制。B、将生长在正常细胞培养基中的MCF-7细胞暴露于pH 6.4或7.4的缓冲培养基中30分钟。取出培养基，用pH 7.4的缓存培养基替换，并立即（0分钟）或在指定时间采集样品。同时，细胞在正常细胞培养基（CM）中暴露或不暴露于mTORC1抑制剂雷帕霉素（Rapa，30nM）30分钟。用免疫印迹法分析裂解产物。请注意，改变细胞培养基会导致PKB/Akt-Ser的轻微短暂下降⁴⁷³与酸性pH值无关的磷酸化。所有图中显示的结果代表了三个或更多独立实验。

**图2。暴露于细胞外酸化的细胞内pH值的变化。**
A、转染mCherry/de4GFP的CHO细胞在pH钳（高[K⁺]/尼日利亚霉素）从pH 6.75到pH 8.0。绿色荧光的增加表明pH值向碱性方向移动。比例尺=10µm。B、测定了mCherry/de4GFP荧光比率与pH值之间的关系。C、在添加缓冲至指示pH值的细胞培养基后，随时间监测mCherry/de4GFP转染的MCF-7细胞中的细胞内pH。N> 每个条件70个细胞。D、显示了MCF-7细胞暴露于对照培养基5或60分钟或酸化培养基60分钟的样品图像。绿色荧光消失导致的红移表明细胞内酸化。比例尺=10µm。

**图3。细胞外酸化对mTORC1控制途径的影响。**
TSC2系统^+/+和TSC2^−/−将MEF（A）或MCF-7细胞（B）暴露于缓冲至指示pH值或30 nM雷帕霉素的培养基中1 h，并使用指示抗体通过western blotting分析裂解产物。

**图4。MEK抑制剂对mTORC1信号传导的影响。**
细胞在正常细胞培养基中暴露于MEK抑制剂PD98059或PD184352或雷帕霉素1h，并使用所示抗体通过western blotting分析裂解产物。

**图5。细胞外酸化对mTOR和溶酶体细胞质定位的影响。**
MCF-7细胞未经处理，暴露于pH 6.4或7.4缓冲培养基中1 h，或暴露于HBSS中2 h，并使用抗体进行免疫染色，如图所示。黄色信号表示mTOR和LAMP-1的共同定位。棒材，10µm。

**图6。酸性细胞外pH对血清诱导的TSC2 mTORC1通路激活的影响^+/+和TSC2^−/−MEF公司。**
将细胞在无血清培养基中培养18小时，然后将其暴露在缓冲至指定pH值或30 nM雷帕霉素的含血清培养基上1小时。用所示抗体通过western blotting分析裂解液。

**图7。酸性细胞外pH值对MCF-7细胞中血清诱导的mTORC1通路激活的影响。**
将细胞在无血清培养基中培养18小时，然后将其暴露在缓冲至指定pH值或30 nM雷帕霉素的含血清培养基上1小时。用所示抗体通过western blotting分析裂解液。

**图8。细胞外酸化对蛋白质合成的影响。**
成立³⁵在TSC2中测量S-Met蛋白^+/+和TSC2^−/−MEF暴露于缓冲至指定pH值的细胞培养基中。The rates of³⁵在治疗的最后15分钟内测量S-Met掺入量，以使cpm/µg蛋白质/15分钟孵育。结果是相对于pH 7.4培养基中的平均掺入量表示的。（平均值±S.D.，n=6）。

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