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。2011年2月；13(2):132-41.
doi:10.1038/ncb2152。 Epub 2011年1月23日。

AMPK和mTOR通过Ulk1的直接磷酸化调节自噬

金钟莫 1, 蒙迪拉·昆都, 伯努瓦·维奥莱特, 关坤良
附属机构

AMPK和mTOR通过Ulk1的直接磷酸化调节自噬

Joungmok Kim先生等。 Nat细胞生物学。 2011年2月。

摘要

自噬是一种细胞成分被降解以维持基本活性和生存能力以应对营养限制的过程。广泛的遗传学研究表明，酵母ATG1激酶在自噬诱导中具有重要作用。此外，AMP活化蛋白激酶（AMPK）促进自噬，AMPK是一种关键的能量传感器，调节细胞代谢以维持能量稳态。相反，雷帕霉素（mTOR）是一种整合生长因子和营养信号的中央细胞生长调节剂，其哺乳动物靶点可抑制自噬。在这里，我们证明了调节哺乳动物自噬起始激酶Ulk1（酵母ATG1的同源物）的分子机制。在葡萄糖缺乏的情况下，AMPK通过磷酸化Ser 317和Ser 777直接激活Ulk1来促进自噬。在营养充足的情况下，高mTOR活性通过磷酸化Ulk1 Ser 757和破坏Ulkl和AMPK之间的相互作用来阻止Ulk 1的激活。这种协同磷酸化对Ulk1的自噬诱导很重要。我们的研究揭示了Ulk1调节和自噬诱导对营养信号的响应的信号机制。

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数字

图1
图1
葡萄糖饥饿通过AMPK依赖的磷酸化激活Ulk1蛋白激酶。(一)如图所示，HEK293细胞缺乏葡萄糖（4小时），内源性Ulk1被免疫沉淀，并进行了自身磷酸化分析。蛋白质通过SDS–PAGE进行解析，并通过放射自显影（顶部）或蛋白质印迹（WB；底部）进行可视化。(b条)按指示将细胞在无葡萄糖培养基中孵育（4小时）并裂解。如图所示，用lambda磷酸酶（λPPase）培养裂解液。western blotting检测内源性Ulk1迁移率。(c（c）)将HA–Ulk1与野生型（WT）AMPKα1或激酶死亡（DN）突变体一起转染HEK293细胞。细胞缺乏葡萄糖（4 h；Glu）或氨基酸（−A.A），并用化合物C（20µM，C.C）处理，如图所示。通过western blotting测定ACC和S6K的Ulk1迁移率以及磷酸化水平。(d日)从转染的HEK293细胞中免疫纯化HA–Ulk1蛋白，如图所示，该细胞经历了葡萄糖饥饿（4 h）。用λPPase处理HA–Ulk1蛋白，并且在体外在GST–ATG13存在的情况下进行激酶分析。蛋白质通过SDS-PAGE进行解析；磷酸化蛋白用放射自显影法显示，HA–Ulk1用western blotting显示，GST–Atg13用考马斯染色显示。(e（电子）)在富含葡萄糖的培养基下，从转染的HEK293细胞中免疫纯化HA–Ulk1，并在冷ATP存在下用AMPK处理15分钟，然后按照d日. (（f）)AMPK野生型（WT）和α1/α2双敲除（DKO）MEF在有或无葡萄糖的情况下培养（4 h）。对内源性Ulk1进行免疫沉淀，并测量自身磷酸化（平均值±标准差。，n个= 3). 自磷酸化活性标准化为Ulk1蛋白水平；通过在富含葡萄糖的条件下对AMPK野生型MEF的Ulk1活性进行归一化来计算相对活性。(克)将HA–Ulk1与载体（Vec）或AMPKα1激酶缺失突变体（DN）一起转染HEK293细胞。细胞缺乏葡萄糖（−Glu）或氨基酸（−A.A），或在裂解前用50 nM雷帕霉素（Rapa）处理3 h。左：自磷酸化活性评估和标准化如（f）（平均值±标准差。，n个= 3). 右图：与富营养条件下细胞的Ulk1自磷酸化相比，Ulkl自磷酸化中的折叠诱导。斑点的未截取图像如补充图S5所示。
图2
图2
AMPK直接磷酸化Ser 317和Ser 777的Ulk1。(一)AMPK磷酸化Ulk1 S/T结构域在体外顶部：用于绘制磷酸化位点的Ulk1结构域结构和缺失结构的示意图。小鼠Ulk1蛋白由N末端激酶域（KD；1–278）、丝氨酸/苏氨酸富集域（S/T域，279–828）和C末端域（CTD，829–1051）组成。底部：从转染的HEK293细胞中免疫纯化所示Flag–Ulk1缺失突变体，并用于在体外AMPK分析作为底物。磷酸化通过32western blot检测P-放射自显影和蛋白水平。(b条)Ulk1中AMPK磷酸化位点的测定。所示的重组GST–Ulk1突变体从大肠杆菌，用作在体外AMPK磷酸化。缺失分析表明，S/T结构域中的两个Ulk1片段279-425和769-782被AMPK高度磷酸化在体外Ser 317突变消除了Ulk1片段279-425中的大部分磷酸化。在片段769-782中，五个丝氨酸残基（774号、777号、778号、779号和780号）突变为丙氨酸，表示为（769-782）5SA，完全消除了AMPK的磷酸化作用。在该突变背景（769–782）4SA-S777中重组Ser 777，而不是其他四个残基中的任何一个，恢复了AMPK的磷酸化。GST和GST–TSC2F（TSC2片段1300–1367包含Ser 1345的AMPK磷酸化位点）分别用作AMPK反应的阴性和阳性对照。磷酸化测定方法32考马斯染色检测P-放射自显影和蛋白水平。(c（c）)葡萄糖饥饿诱导的Ulk1磷酸化需要Ser 317/Ser 777体内将HA–Ulk1和突变体转染到HEK293细胞中。如图所示，细胞缺糖4小时。HA–Ulk1进行免疫沉淀，并通过western blot检测其流动性。(d日)AMPK诱导Ulk1 Ser 317和Ser 777的磷酸化。如图所示，野生型HA–Ulk1或S317/777A突变体与AMPK共同转染到HEK293细胞中。HA–Ulk1被免疫沉淀（IP），Ser 317和Ser 777的磷酸化被western blotting检测。斑点的未截取图像如补充图S5所示。
图3
图3
AMPK依赖性Ulk1 Ser 317和Ser 777磷酸化是响应葡萄糖饥饿而激活Ulk1所必需的。(一)如图所示，AMPK野生型或DKO MEF缺乏葡萄糖（4小时）。对总细胞裂解液进行Ulk1蛋白和磷酸化检测。(b条)Ulk1 Ser 317和Ser 777磷酸化响应葡萄糖饥饿/再添加的时间进程。MEF在指定时间内缺乏葡萄糖（−Glu）。饥饿3小时后，将培养物切换至含葡萄糖（25 mM）培养基，并采集样品（Re-Glu）。同时，用无氨基酸（−A.A）培养基或50 nM雷帕霉素（Rapa）处理细胞3小时(c（c）)Ulk1 Ser 317和Ser 777的磷酸化与AMPK活性相关。MEF缺乏葡萄糖（4小时），如存在或不存在20µM化合物C（C.C）所示。同时，在富含葡萄糖的培养基中用2 mM二甲双胍（Met，2 h）处理细胞。测试ACC S79的磷酸化作用作为AMPK活化的阳性对照。(d日)葡萄糖饥饿导致Ulk1在Ser 317和Ser 777高度磷酸化体内.测定Ulk1磷酸化水平体内，免疫纯化的HA–Ulk1蛋白被AMPK磷酸化在体外（100%代表AMPK对Ulk1的完全磷酸化）。体外磷酸化的HA–Ulk1按指示稀释，并与在富含葡萄糖（+Glu）或无葡萄糖（−Glu，4h）培养基中生长的细胞的免疫沉淀的HA–Ultk1一起进行免疫印迹。然后量化条带的密度。通过此测量，从葡萄糖缺乏细胞中分离出的大约50%的Ulk1在Ser 317和Ser 777上被磷酸化。(e（电子）)从在高糖培养基中生长的转染HEK293细胞中免疫纯化所示HA–Ulk1蛋白，然后在冷ATP存在下与AMPK孵育15分钟在体外反应后，通过大量洗涤去除AMPK，在存在的情况下对产生的Ulk1免疫复合物进行激酶活性检测32P-ATP。(（f）)HA–Ulk1蛋白（野生型或S317/777A突变型）从转染的HEK293细胞中免疫沉淀，在裂解前用葡萄糖或不加葡萄糖孵育细胞（4h）。安在体外在GST–ATG13和FIP200存在下进行激酶反应。斑点的未裁剪图像如补充图S5所示。
图4
图4
mTORC1干扰Ulk1–AMPK相互作用。(一)AMPK与Ulk1互动。将各种Flag–Ulk1缺失突变体与AMPKα/β/γ、Atg13和FIP200一起转染HEK293细胞。免疫沉淀Flag–Ulk1蛋白（用白色箭头表示），并用western blots检测AMPKα/β/γ、Atg13和FIP200的共同免疫沉淀。(b条)负责AMPK相互作用的Ulk1区域的缺失分析。所示Flag–Ulk1截断突变体是从共表达AMPK复合物（α/β/γ）的转染HEK293细胞免疫沉淀而来。通过western blots检测AMPK亚单位的共免疫沉淀。(c（c）)Rheb抑制Ulk1–AMPK相互作用。如图所示，将HA–AMPKα、Flag–Ulk1和Myc–Rheb联合转染到HEK293细胞中。细胞在裂解前用或不用雷帕霉素（50 nM Rapa）处理1小时。Flag–Ulk1进行免疫沉淀，并通过蛋白质印迹测定AMPKα的共免疫沉淀。(d日)雷帕霉素处理增强内源性Ulk1和AMPK的相互作用。从Ulk1或AMPK野生型和敲除（单敲除；KO或双敲除；DKO）MEF中免疫沉淀内源性Ulkl蛋白。建议使用50 nM雷帕霉素治疗1小时（Rapa）。western blot检测内源性AMPKα蛋白的共免疫沉淀。箭头表示AMPKα蛋白。（e） mTORC1磷酸化抑制Ulk1结合AMPK的能力在体外如图所示，用链霉亲和素珠从转染的HEK293细胞中纯化CBP/SBP–Ulk1，并用猛禽免疫沉淀法制备的mTORC1在冷ATP存在下培养Ulk1-珠复合物。将产生的Ulk1复合物与含有AMPK的细胞裂解物孵育，然后广泛清洗。western blot检测Ulk1和相关AMPKα。斑点的未裁剪图像如补充图S5所示。
图5
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mTORC1在Ser 757磷酸化Ulk1。(一)mTORC1磷酸化Ulk1 S/T结构域。从转染的HEK293细胞制备Ulk1缺失突变体，用于在体外mTORC1分析。磷酸化通过32通过western blot（底部）测定P-放射自显影图（顶部）和蛋白质水平。(b条)Ser 757被mTORC1磷酸化。左图：所示的重组GST–mUlk1突变体从大肠杆菌和用于在体外mTORC1测定作为底物。缺失分析分离出片段（753-771）作为mTORC1的靶点。Ulk1（753–771）片段包含五个保守的丝氨酸/苏氨酸残基，即Thr 754、Ser 757、Ser 760、Thr 763和Thr 770。右：Ser 757突变通过mTORC1消除了Ulk1磷酸化在体外GST作为mTORC1磷酸化反应的阴性对照。磷酸化测定方法32P-放射自显影（顶部），而蛋白质水平通过考马斯染色检测（底部）。(c（c）)Rheb增加Ulk1 Ser 757磷酸化。从转染的HEK293细胞中免疫沉淀HA–Ulk1野生型和S757A突变体。提示联合转染Rheb和雷帕霉素（Rapa）治疗。western blot检测Ulk1 Ser 757磷酸化。(d日)Rheb在野生型Ulk1中诱导迁移，但在Ulkl中没有诱导迁移S757A型突变体。将HA–Ulk1转染到HEK293细胞中，无论是否含有Rheb。在富含营养的培养基下，从细胞中免疫沉淀HA–Ulk1，并用western blot检测Ulkl的迁移率。(e（电子）)内源性Ulk1 Ser 757磷酸化在Tsc1型−/−MEF公司。Tsc1型+/+（重量）和Tsc1型−/−（KO）MEF缺乏葡萄糖（4小时），或用50 nM雷帕霉素治疗（Rapa，1小时）。用磷酸化-Ulk1 Ser 757抗体检测内源性Ulk1的Ser757磷酸化。斑点的未裁剪图像如补充图S5所示。
图6
图6
mTORC1对Ulk1 Ser 757的磷酸化抑制Ulk1-AMPK相互作用。(一)mTORC1需要Ulk1 Ser 757来调节Ulkl与AMPK的相互作用体内CBP/SBP标记的Ulk1（野生型或S757C）与HA–AMPKα和Rheb共同转染到HEK293细胞中，如图所示。用链霉亲和素珠纯化Ulk1，并用western blot检测共沉淀的HA–AMPKα（Rapa，50 nM雷帕霉素处理1 h后细胞裂解）。(b条)雷帕霉素需要Ulk1 Ser 757来增强Ulk1-AMPK相互作用在体外CBP/SBP Ulk1蛋白（野生型或S757C）是从转染的HEK293细胞中制备的，如图所示，这些细胞预先与50 nM雷帕霉素（Rapa，1h）孵育。通过链霉亲和素珠纯化Ulk1蛋白，并将得到的Ulk1-珠与细菌纯化的AMPKα/β/γ复合物孵育。AMPKα蛋白水平在体外使用AMPKα抗体通过western blot检测下拉试验。L.E.公司。；长期接触。(c（c）)Ulk1中AMPK位点Ser 317和Ser 777的磷酸化在Tsc1型−/−MEF公司。Tsc1型+/+（重量）和Tsc1型−/−（KO）MEF缺乏葡萄糖（4小时），或用50 nM雷帕霉素治疗（Rapa，1小时）。用western blotting检测内源性Ulk1的Ser 317和Ser 777磷酸化的Ulkl抗体。(d日)Rheb以依赖于mTORC1的方式抑制Ulk1 Ser 317和Ser 777磷酸化。如图所示，将HA–Ulk1、AMPKα激酶突变体（DN）和Myc–Rheb联合转染到HEK293细胞中。用无葡萄糖培养基（−Glu，4 h）培养细胞，其中添加20µM化合物C（C.C.）或50 nM雷帕霉素（Rapa）。如图所示，用针对在Ser 317、Ser 777、Ser 757和HA磷酸化的Ulk1的抗体探测总细胞裂解物。(e（电子）)Rheb抑制葡萄糖饥饿诱导的Ulk1激活。将HA–Ulk1和Myc–Rheb转染到HEK293细胞中，在裂解前用无葡萄糖（−Glu）、无氨基酸（−A.A）培养基或50 nM雷帕霉素（Rapa）培养4 h。对HA–Ulk1进行免疫沉淀，并进行激酶分析。Ulk1活性的测量方法为32用western blot和考马斯氏染色分别测定P-放射自显影图和检测中使用的HA–Ulk1和GST–Atg13蛋白水平。斑点的未截取图像如补充图S5所示。
图7
图7
AMPK磷酸化是葡萄糖饥饿时Ulk1自噬功能所必需的。(一)Ulk1需要Ser 317/Ser 777来保护细胞免受葡萄糖饥饿。存活率（24小时，平均值±标准差。，n个= 4; 顶部）和PARP裂解（8小时；western blot，中部；定量，n个=2，底部）乌尔克1+/+（重量），乌尔克1−/−（KO），乌尔克1−/−重新表达野生型Ulk1（KO-WT），以及乌尔克1−/−重新表达Ulk1 S317/777A突变体（KO-S317/777A）MEF。western blot中的箭头表示PARP无劈开和劈开。(b条)Ulk1 S317/777A突变体在LC3脂质化中受到损害，以应对葡萄糖饥饿。ULK1 MEF在无葡萄糖培养基中培养指定时间。通过western blotting测定LC3-II水平，并用α-微管蛋白标准化LC3-II积累，并进行定量（底部，n个=3，平均值±标准差）。显示了一个具有代表性的western blot。本实验中使用的LC3抗体似乎优先识别脂质修饰的LC3-II，后者在凝胶上迁移更快。(c（c）)Ulk1 S317/777A突变体在自噬体形成方面存在缺陷。所示MEF缺乏葡萄糖（4小时），通过共焦显微镜检查GFP–LC3阳性自噬体的形成。GFP–LC3；绿色和DAPI；蓝色。比例尺，20µm。(d日)用电子显微镜进行自噬液泡分析。的低放大率图像乌尔克1−/−（KO，左上面板），乌尔克1−/−用野生型Ulk1（KO-WT，两个带有高倍图像的中间面板）重建，以及乌尔克1−/−图中显示了用Ulk1 S317/777A（KO-S317/777A，左下面板）重建的。来自KO-WT的自噬体的高倍图像显示在右上角和右下角的面板中。低倍图像上的箭头和高倍图像中的箭头所示的自噬体/自溶体样结构。比例尺；低倍率，1µm；高增感，200nm。
图8
图8
AMPK和mTORC1对葡萄糖信号的Ulk1调节模型。左图：当葡萄糖充足时，AMPK不活跃，mTORC1活跃。活性mTORC1磷酸化Ser 757上的Ulk1，以防止Ulkl与AMPK相互作用并被AMPK激活。右：当细胞能量水平受限时，AMPK被激活，mTORC1被AMPK通过TSC2和猛禽的磷酸化被抑制。Ser 757的磷酸化降低，随后Ulk1可以与Ser 317和Ser 777上的AMPK相互作用并被其磷酸化。AMPK-磷酸化的Ulk1激活，然后启动自噬。
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