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。2011年1月10日；192（1）：17-27。
doi:10.1083/jcb.201009067。

p62靶向自噬体形成位点需要自我寡聚，但不需要LC3结合

板仓英介 1, Noboru水岛
附属公司

p62靶向自噬体形成位点需要自我寡聚，但不需要LC3结合

板仓英介等。 J细胞生物学。 。

摘要

自噬是一种细胞内降解过程，通过该过程，溶酶体中的细胞质内容物被降解。除了非选择性吞噬细胞质外，自噬体膜还可以选择性识别特定的蛋白质和细胞器。一般认为，主要选择性底物（或货物受体）p62通过与LC3的相互作用被招募到自噬体膜。在这项研究中，我们分析了p62及其相关蛋白NBR1的负载，发现它们定位于内质网（ER）相关的自噬体形成位点，而与LC3定位于膜无关。p62与上游自噬因子（如ULK1和VMP1）共定位，即使自噬体的形成被沃特曼或FIP200敲除阻断。p62的自寡聚化对其定位到自噬体形成部位至关重要。这些结果表明，p62定位于内质网上的自噬体形成位点，自噬体有核。这个过程类似于酵母细胞质到液泡的靶向途径。

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数字

图1。
图1。
p62在早期自噬结构中的定位与LC3无关。（A） 稳定表达GFP-LC3的MEF在常规培养基或饥饿培养基中培养1h。细胞用抗p62抗体染色，并用免疫荧光显微镜进行分析。（B和C）p62在自噬结构中的定位与LC3的脂质化无关。将稳定表达GFP-LC3的野生型（B）和Atg3 KO MEFs（C）在饥饿培养基中培养2 h。用抗Atg16L1和抗p62抗体对细胞进行染色。箭头表示Atg16L1和p62的阳性结构，但GFP-LC3的阳性结构除外。（D–G）p62在自噬结构中的定位与Atg5无关。将稳定表达HA–WIPI-1的野生型（D和E）和Atg5 KO MEFs（F和G）在常规（D和F）或饥饿培养基（E和G）中培养2小时。用抗HA和抗p62抗体对细胞进行染色。信号颜色由字体的颜色表示。常规培养基；St.M.，饥饿培养基；WT，野生型。棒材：（白色）10µm；（黄色）1µm。
图2。
图2。
p62定位于自噬体形成部位。稳定表达GFP-Atg14的（A–D）NIH3T3细胞在常规培养基（A）、含（C）或不含（B）0.2µM沃特曼的饥饿培养基中培养1h，或在含有50µg/ml嘌呤霉素的常规培养基中培育2h（D）。使用抗GFP和抗p62抗体通过免疫荧光显微镜分析细胞。在所示培养基中培养稳定表达HA-ULK1的（E–H）野生型（E–G）和FIP200 KO MEFs（H）1h。如图1所示对细胞进行染色。信号颜色由字体的颜色表示。（一） 图中显示了每个细胞（左）HA-ULK1点的定量和p62点（右）的HA-ULK1阳性率（%）。数据表示30张图像的平均值±SEM。常规培养基；St.M.，饥饿培养基；WM，沃特曼；WT，野生型。棒材：（白色）10µm；（黄色）1µm。
图3。
图3。
p62 punta独立于FIP200与ER关联。（A） 将稳定表达GFP-ER（GFP与细胞色素b5残基95–134融合）的MEFs在饥饿培养基中培养1小时。将细胞固定、透化，并使用抗GFP和抗p62抗体进行免疫荧光显微镜检查。（B和C）p62点在FIP200 KO细胞中与VMP1共定位。将稳定表达VMP1-GFP的野生型（B）和FIP200 KO MEFs（C）在饥饿培养基中培养1h。用抗p62抗体对细胞进行染色。信号颜色由字体的颜色表示。棒材：（白色）10µm；（黄色）1µm。
图4。
图4。
p62的PB1结构域而非LRS对于定位到自噬体形成位点至关重要。在饥饿培养基中培养稳定表达GFP-p62野生型、GFP-p62-LRS突变体1（L343A）、GFP-p62-LRS突变2（D337A、D338A和D339A）、GFP-p62ΔC（1-265个氨基酸）和PB1突变（K7A和D69A）的（A和B）p62 KO-MEFs 1h。用抗LC3抗体通过免疫荧光显微镜分析细胞。B显示了LC3点的GFP-p62阳性率（%）。数据表示30张图像的平均值±SEM。（C和D）将稳定共表达HA-ULK1的p62 KO MEFs和A中描述的GFP-p62之一在含有0.2µM wortmannin的饥饿培养基中培养1小时。使用抗HA抗体通过免疫荧光显微镜分析细胞。LC3点的GFP-p62阳性率（%）如D所示。数据表示30张图像的平均值±SEM。（E） 稳定表达所示GFP-p62的p62 KO MEF在常规培养基或饥饿培养基中培养1.5和3 h。细胞裂解产物用抗p62和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析。信号颜色由字体的颜色表示。St.M.，饥饿培养基；WM，沃特曼；WT，野生型。棒材：（白色）10µm；（黄色）1µm。
图5。
图5。
p62的自我齐聚对其定位到自噬体形成部位至关重要。（A） 使用FKBP域的人工p62齐聚系统的示意图。p62的PB1结构域被一个FKBP或两个串联FKBP结构域取代。小配体AP20187在化学上连接两个FKBP结构域。（B） 用乙醇（载体）或0.1µM AP20187处理稳定表达GFP-1xFKBP-p62或GFP-2xFKBP-p62的p62 KO MEF 24 h。均质和离心后，将所得上清液部分应用于Superose 6柱。使用抗p62抗体通过免疫印迹分析每个组分。显示了分子质量标准（kD）的位置。用乙醇（载体）或0.1µM AP20187处理稳定表达HA-ULK1和GFP-1xFKBP-p62或GFP-2xFKBP-p62的（C–E）p62 KO MEF 24 h，并在含有0.2µM沃特曼的常规或饥饿培养基中培养1 h，该培养基含有或不含有0.1µM AP20187。使用抗HA抗体通过免疫荧光显微镜分析细胞。显示了每个细胞（D）的p62点数量和p62点（E）的ULK1阳性率（%）。数据表示30张图像的平均值±SEM。信号颜色由字体的颜色表示。AP，AP20187；WM、沃特曼。（F） 提出了p62定位到自噬结构的模型。条形：（白色）10µm；（黄色）1µm。
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