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.2011年1月28日；331(6016):456-61.
doi:10.1126/science.1196371。 Epub 2010年12月23日。

AMP活化蛋白激酶对ULK1（hATG1）的磷酸化将能量传感与有丝分裂联系起来

丹尼尔·F·伊根 1, 大卫·B·沙克尔福德, 玛丽亚·米哈伊洛娃, 萨拉·盖利诺, 丽贝卡·科恩斯, 威廉·迈尔, 黛比·S·巴斯克斯, 阿什什·乔希（Aashish Joshi）, 达纳·M·格温, 瑞贝卡·泰勒, 约翰·M·阿萨拉, 詹姆斯·菲茨帕特里克, 安德鲁·迪林, 贝诺伊特·维奥利特, 蒙迪拉·昆都, 马琳·汉森, 鲁本·J·肖
附属公司

AMP活化蛋白激酶对ULK1（hATG1）的磷酸化将能量传感与有丝分裂联系起来

丹尼尔·F·伊根等。 科学类. .

摘要

腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）是一种保守的细胞内能量激活传感器，用于响应低营养利用率和环境胁迫。在AMPK保守底物的筛选中，我们鉴定了ULK1和ULK2，这是酵母蛋白激酶Atg1的哺乳动物同源基因，是自噬所必需的。哺乳动物肝脏和秀丽隐杆线虫AMPK或ULK1的遗传分析表明，在自噬中需要这些激酶。在哺乳动物中，AMPK或ULK1的缺失导致自噬适配器p62异常积累和有丝分裂缺陷。用AMPK不能磷酸化的突变ULK1重建ULK1缺陷细胞表明，这种磷酸化是线粒体稳态和饥饿期间细胞生存所必需的。这些发现揭示了营养状态与自噬和细胞生存相耦合的保守生化机制。

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图1
图1
ULK1是AMPK的保守底物。（A）ULK1中的四个保守位点和ULK2中的两个位点与最佳AMPK底物基序匹配的晶体排列。（B）将ULK1和GST或GST-14-3-3表达载体转染到人胚胎肾（HEK）293T细胞中，并将其置于含有20µM STO-609（STO）、载体（veh）或5mM苯乙双胍（Phen）的培养基中1小时。如图所示，对细胞裂解物和GST下拉物进行免疫印迹。（C）用myc-标记的催化失活（KI:K46I）ULK1或myc-标签的野生型猛禽进行体外激酶分析，这些猛禽是从HEK293T细胞中免疫沉淀出来的，并用作纯化活性AMPK的底物，存在于32P-γ-ATP。（D）将转染myc标记的野生型ULK1或丝氨酸-丙氨酸ULK1突变体的HEK293T细胞用载体或1mM苯甲酸处理1h，或与组成活性AMPKα1（aa1-312）哺乳动物表达载体联合转染（11）。如图所示，用磷酸特异性抗体对裂解产物中的蛋白质进行免疫印迹。（E）使用上述myc-ULK1和纯化AMPK进行体外激酶分析。用指示的磷酸特异性抗体免疫印迹检测myc-ULK1的磷酸化。（F）用2mM AICAR或载体处理小鼠原代胚胎成纤维细胞（MEFs）1h。所示的裂解物免疫印迹，包括检测内源性ULK1 P-Ser555
图2
图2
小鼠肝脏或原代小鼠肝细胞AMPK或ULK1基因缺陷会导致自噬缺陷。（A）对来自母鼠配对小鼠的肝裂解物进行免疫印迹以检测所示抗体。通过免疫印迹密度测定计算p62与肌动蛋白的比值。数据显示为平均值+/-SEM。*p<.01（B）来源于ULK1的原代肝细胞+/+或ULK1−/−小鼠或AMPKa1+/−a2级L（左）/+或AMPKa1−/−a2级升/升如方法所述，将其置于含有2mM二甲双胍（met）或载体（veh）的培养基中2h。用所示抗体对裂解液进行免疫印迹。（C）对所示基因型的原代小鼠肝细胞进行透射电子显微镜（TEM）检查，发现AMPK-和ULK1-缺陷细胞中线粒体积聚。线粒体伪红色，细胞质蓝色，细胞核绿色，脂滴黄色。（D）通过线粒体标记物TOM20（红色）和细胞核（蓝色）的免疫细胞化学染色，对指定基因型的原代小鼠肝细胞进行染色。比例尺，10微米。
图3
图3
AMPK对于诱导自噬是必要的和充分的秀丽线虫.（A）胰岛素受体daf-2（e1370）用对照RNAi或RNAi处理表达GFP:：LGG-1（相当于GFP-LC3）的突变蠕虫贝克-1（贝克林），aak-2型（AMPKα2）或unc-51号机组（ULK1）和每个皮下缝细胞LGG-1/LC3阳性点状细胞的数量被量化。（B） aak-2（ok524）表达GFP:：LGG-1的突变体或野生型N2（WT）动物接受对照或daf-2型RNAi和LGG-1阳性点状细胞进行评分。（C）表达组成活性AAK-2（参考文献11）（氨基酸1-321）：：番茄（CA-AAK-2:：番茄）的转基因蠕虫(1-321)分析融合或对照组每个缝细胞的LGG-1阳性点。（D）表达CA-AAK-2的动物（1-321）：：番茄和GFP:：LGG-1用对照或unc-51号机组RNAi和LGG-1/LC3阳性点状细胞评分。所有面板均显示相对计数，详见图S10。数据显示为平均值+/-SEM。*P<.0001
图4
图4
ULK1的AMPK磷酸化是营养剥夺后有丝分裂和细胞存活所必需的（A）将稳定表达小鼠野生型（WT）或催化非活性（KI）或AMPK非磷酸化（4SA）ULK1 cDNA的U2OS细胞或空逆转录病毒载体（v）以及抗内源性人类ULK1和ULK2的shRNA放在含有5mM苯丙氨酸（Phen）或载体的培养基中1h。如图所示，对裂解液进行免疫印迹。（B）将稳定表达WT、KI或4SA ULK1 cDNA的ULK1−/−MEF或空逆转录病毒载体（v）以及针对内源性ULK2的shRNA放置在EBSS饥饿培养基（饥饿）或对照培养基（ctl）中，在有或无BafilomycinA（BafA）的情况下放置6h，并按指示进行免疫印迹。（C）用TEM和Inform形态测量软件分析（B）细胞。线粒体伪红色，细胞质蓝色，细胞核绿色。（D）对在基础条件下用JC-1染色或以线粒体解偶联物CCCP为对照的（B）细胞进行荧光激活细胞分选（FACS）分析，以测量线粒体膜电位。受损的线粒体膜电位向左移动，正如在CCCP处理的细胞中观察到的那样。（E）将转染20nM siRNA池的野生型（WT）MEF放入通用对照（ctl）、小鼠Atg5或小鼠ULK1和ULK2中72小时，然后放置在饥饿培养基（starv）或标准培养基（ct1）中12小时，并通过AnnexinV-FACS对细胞死亡进行评分。（F）将来自（B）的细胞置于饥饿培养基（starv）或标准培养基（ctl）中12小时，并用AnnexinV-FACS对细胞死亡进行评分。（G）通过直接磷酸化ULK1和抑制mTORC1对ULK1的抑制，在双分支机制中激活ULK1 AMPK的模型。
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参考文献

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    1. Shackelford DB，Shaw RJ.Nat Rev癌症。2009;9:563.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Shaw RJ等人，《科学》。2005年；310:1642.-公共医学
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