Molecular characterization of apoptosis induced by CARF silencing in human cancer cells

doi:10.1038/cdd.2010.129

。2011年4月；18(4):589-601.

doi:10.1038/cdd.2010.129。 Epub 2010年11月5日。

CARF沉默诱导人癌细胞凋亡的分子特征

C T Cheung先生¹, R辛格, A R Yoon公司, M K哈桑, T Yaguchi先生, S C考尔, 曹云, R瓦德瓦

附属公司

PMID： 21052095
预防性维修识别码：项目经理131902
内政部： 10.1038/cdd.2010.129

CARF沉默诱导人癌细胞凋亡的分子特征

C T Cheung先生等。细胞死亡差异。 2011年4月。

。2011年4月；18(4):589-601.

doi:10.1038/cdd.2010.129。 Epub 2010年11月5日。

作者

C T Cheung先生¹, R辛格, A R Yoon公司, M K哈桑, T Yaguchi先生, S C考尔, 曹云, R瓦德瓦

附属

¹日本茨城县筑波县东1-1-1号中央4区国家先进工业科学技术研究所（AIST），邮编：305-8562。

PMID： 21052095
预防性维修识别码：项目经理131902
内政部： 10.1038/cdd.2010.129

勘误表in

细胞死亡不同。2011年7月；18(7):1238

摘要

ARF的合作者（CARF）被克隆为ARF相互作用蛋白，并显示可以调节p53-p21（WAF1）-HDM2通路，这是通过衰老和凋亡抑制肿瘤的核心。我们以前曾报道过癌细胞中CARF的抑制导致多倍体和caspase依赖性凋亡，然而，控制这一现象的机制尚不清楚。因此，我们检测了各种细胞死亡和存活途径，包括线粒体应激、共济失调毛细血管扩张突变（ATM）-ATR、Ras-MAP激酶和视网膜母细胞瘤级联。我们发现CARF是一种具有广泛效应的多效性调节因子；其抑制作用影响了所有研究途径。最显著的是，它保护细胞免受遗传毒性；CARF敲除引起DNA损伤反应，磷酸化ATM和γH2AX水平增加证明了这一点，导致有丝分裂阻滞和最终凋亡。我们还表明，CARF沉默诱导的体外细胞凋亡转化为体内细胞凋亡。在人类肿瘤异种移植小鼠模型中，用短发夹RNA（shRNA）通过腺病毒载体对抗CARF治疗正在发展的肿瘤，可诱导肿瘤生长完全抑制，这表明CARF shRNA是抗癌试剂的有力候选物。我们证明，CARF在基因组保存和肿瘤抑制中具有重要作用，CARF siRNA是一种有效的新型癌症治疗剂。

PubMed免责声明

数字

图1
CARF抑制导致的细胞死亡发生在线粒体应激和caspase依赖途径导致的有丝分裂阻滞后。转染CARF靶向siRNA的HeLa细胞的TUNEL染色显示CARF抑制后细胞死亡增加(一). CARF抑制后，同基因p53+/+和p53−/−HCT116细胞表现出相似的凋亡（细胞活力降低，左侧caspase 3活性增加，右侧）(b条). CARF受损的细胞经历了有丝分裂阻滞，其证据是细胞周期蛋白B1和组蛋白H3的积累，至少有三个实验的代表性斑点的密度定量，其中CARF抑制组表现为相对于对照组的折叠变化，设置为1(**c（c）**). 免疫荧光显示，CARF水平降低的细胞周期蛋白B1核积累增加，如箭头所示(天). 对CARF受损的HeLa细胞进行免疫印迹分析，以确定构成线粒体应激和半胱天冬酶途径的蛋白质(**e（电子）**). 肌动蛋白和α-Tubulin被用作负荷控制。图表表示为平均值±S。D(**（f）**)CARF抑制后导致细胞死亡的假设途径示意图。我们认为CARF抑制诱导的细胞凋亡可能激活多种通路，包括ATM/ATR/CHK1/CHK2、Ras-MAPK和/或RB/E2F1网络

图2
CARF抑制诱导的细胞死亡不需要Ras相关通路。通过免疫印迹法对CARF受损U2OS细胞中的Ras、总ERK和磷酸ERK1/2进行评估，并对至少三个实验中的代表性印迹进行密度定量(一). 用CARF siRNA转染GFP-ERK1过表达的U2OS细胞(b条)用台盼蓝排斥法测定细胞活力(**c（c）**)和procaspase 3的免疫印迹，并对至少三个实验中的代表性印迹进行密度定量(天). 通过免疫印迹分析CARF受损HT1080细胞的总ERK、磷酸ERK1/2、CHK1和caspase裂解(**e（电子）**). PD98059对CARF抑制的HT1080细胞中ERK1/2有抑制作用，用台盼蓝排除法测定细胞活力(**（f）**). SB203580和沃特曼素分别抑制CARF受损U2OS细胞中的p38MAPK和PI3K，并如上所述测量细胞活力(克). 肌动蛋白和α-Tubulin被用作负荷控制。进行了密度定量，其中CARF抑制组显示为对照siRNA的折叠变化，对照siRNA设置为1。图表表示为平均值±S。D.细胞存活率作为存活的CARF靶向细胞控制siRNA转染细胞的百分比，被认为是100%

图3
CARF抑制诱导的细胞死亡并不严重依赖RB。通过免疫印迹法分析CARF受损U2OS细胞中的总RB、磷酸化RB、E2F1和caspase 3，并对至少三个实验中的代表性印迹进行密度定量，其中CARF抑制组显示为对照组的倍数变化，设为1(一). 用CARF靶向siRNA转染Saos-2细胞，并用台盼蓝排斥试验测定细胞活力(b条). CARF、E2F1、p21^CIP1/WAF1级通过western blotting对CARF受损的Saos-2细胞中caspase 3和CHK1进行评估(**c（c）**). 对对照组和RB再储存的Saos-2细胞进行CARF抑制，并对CARF、HA标记、RB、CHK1和caspases 3、7和9进行免疫印迹(天). 还进行了CARF抑制后对照和RB恢复的Saos-2细胞的细胞活力(**e（电子）**). 肌动蛋白和α-Tubulin被用作负荷控制。图表表示为平均值±S。D.细胞活力以存活的CARF靶向细胞的百分比来测量，以控制siRNA转染的细胞，其被认为是100%

图4
CARF抑制激活ATM通路，但它不是细胞死亡所必需的。总ATM、总ATR和γ通过免疫印迹分析H2AX和CARF水平，并对至少三个实验中的代表性印迹进行密度定量，其中CARF抑制组显示为对照组的折叠变化，设置为1(一). 1981年丝氨酸磷酸化ATM(b条)以及γH2AX型(**c（c）**)免疫荧光染色检测，其中蓝色染色表示细胞核。通过western blotting检测CHK2的磷酸化形式，包括丝氨酸19、丝氨酸33/35和苏氨酸68的磷酸化、总CHK1和磷酸化CHK1(天). 用CARF siRNA转染ATM+/+和空细胞，图像中显示凋亡为圆形浮动细胞(**e（电子）**)用免疫印迹法检测procaspase 3的裂解(**（f）**). 肌动蛋白用作负荷控制，Hoechst 33 258用于核染色。图表表示为平均值±S。D。

图5
ATR–CHK1是CARF抑制诱导的细胞死亡所必需的。用GFP-CHK1或对照载体瞬时转染U2OS细胞(一). 在CARF抑制后，用台盼蓝排除法测量细胞存活率，其中，将存活的CARF靶向细胞的百分比与对照siRNA转染细胞的百分比进行比较，后者被认为是100%(b条). CARF、GFP、，γ通过至少三个实验中代表性斑点的密度定量，对CARF抑制后的对照细胞和CHK-1过表达细胞进行H2AX、组蛋白H3和细胞周期蛋白B1的检测，其中CARF抑制组显示为对照组的折叠变化，设置为1(**c（c）**). 对CARF、细胞周期蛋白B1和γ甲醇/丙酮固定细胞中的H2AX（CARF siRNA-转染对照和CHK1过度表达）(天–**（f）**). 为了表征凋亡表型，用免疫印迹法检测caspase的激活(克)和基于荧光的测定(小时)CARF敲除后，在对照组和CHK1-过表达细胞中。此外，通过对两个独立实验中的500–2000个细胞进行计数，进行TUNEL染色并进行定量(我). 最后，使用在对照细胞和CARF抑制细胞中对CHK1进行的逆转录PCR，我们证明CHK1转录物在CARF击倒后减少。PCR产物从两个独立的实验中进行了定量，CARF siRNA样品显示为与对照相比的折叠变化。α-Tubulin用作负荷控制，Hoechst 33 258用于核染色。图表表示为平均值±S。D。

图6
导致CARF抑制诱导凋亡的假设途径示意图。我们的结果排除了Ras-MAPK和RB–E2F1通路的关键参与，并证明CARF抑制诱导的有丝分裂阻滞和细胞死亡通过ATR–CHK1通路进行

图7
CARF抑制体内诱导肿瘤消退。用携带shCARF腺病毒的0.2–5的MOI感染A549细胞，以确定最佳剂量(一). 裸鼠(n个=每组5-6人）注射1×10⁷A549细胞，当肿瘤达到100毫米时^三体积为3×10⁸每2天瘤内注射三次Ad-ΔB7（正方形）或Ad-△B7-shCARF（灰圈）的斑块形成单位，同时测量肿瘤大小(b条). 动物的存活率也记录为存活率的百分比（%）(**c（c）**). 老鼠在第50天被杀

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[6] Hasan K、Cheung C、Kaul Z、Shah N、Sakaushi S、Sugimoto K等。CARF是细胞衰老和凋亡的重要双重调节因子。生物化学杂志。2009;284:1664–1672.-公共医学

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[8] Castedo M，Perfettini JL，Roumier T，Andreau K，Medema R，Kroemer G.有丝分裂突变导致的细胞死亡：分子定义。致癌物。2004;23:2825–2837.-公共医学

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