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.2010年8月2日；207(8):1661-73.
doi:10.1084/jem.20092164。 Epub 2010年7月26日。

小鼠前脑中TDP-43的高表达足以导致神经和病理表型模仿FTLD-U

蔡国杰（Kuen-Jer Tsai） 1, 杨春红, 颜新芳, 关宏秋, 魏林坚, 王伟婷, 吴子伟, 林庆波, 文美福, 车昆·詹姆斯·沈
附属公司

小鼠前脑中TDP-43的高表达足以导致神经和病理表型模仿FTLD-U

蔡国杰（Kuen-Jer Tsai）等人。 实验医学杂志. .

摘要

TDP-43是一种多功能DNA/RNA-结合因子，参与神经元可塑性的调节。TDP-43也被确定为神经元胞质内含物（NCI）的主要成分，NCI是一系列神经退行性疾病的特征，包括具有泛素（+）内含物的额颞叶变性（FTLD-U）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）。我们已经建立了FTLD-U小鼠模型（CaMKII-TDP-43Tg），其中TDP-43在前脑中转基因过表达，导致表型特征与FTLD-U相似。特别是，转基因（Tg）小鼠表现出学习/记忆受损、进行性运动功能障碍和海马萎缩。认知和运动损伤伴随着Tg小鼠脑内神经调节因子磷酸化胞外信号调节激酶和磷酸化cAMP反应元件结合蛋白水平的降低以及胶质增生水平的增加。此外，具有TDP-43（+）、泛素（+）NCIs和TDP-43缺失细胞核的细胞以年龄依赖性的方式出现在Tg小鼠大脑中。我们的数据提供了直接证据，证明前脑中TDP-43蛋白水平的增加足以导致TDP-43（+）、泛素（+）NCI的形成和神经退行性变。该FTLD-U小鼠模型对于TDP-43在FTLD-Us发病机制中的作用的机理分析以及该疾病有效治疗方法的设计具有重要价值。

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数字

图1。
图1。
CaMKII-TDP-43 Tg小鼠的产生和表征。（A） 原核注射用CaMKII-TDP-43片段的物理图。箭头指示转录的方向。指出了来自腺病毒剪接供体、免疫球蛋白G剪接受体和SV40多聚（A）加合序列（pA）的短杂交内含子的位置。还指出了Southern印迹和PCR探针的大致位置。通过Southern印迹上的4.4-kb KpnI片段和凝胶上的523-bp PCR带对Tg小鼠进行鉴定。地图上的限制位点如下：K，KpnI；E、 EcoRV；N、 不是I；S、 SfiI公司。（B） Tg小鼠的基因分型。举例说明了尾部DNA的PCR（顶部）和Southern blotting（底部）分析数据。NT代表非转基因样本。（C） 分别对WT、NT和Tg小鼠的海马、皮层、小脑和脊髓的蛋白质提取物进行蛋白质印迹。（D） WT和TDP-43 Tg小鼠（Tg）大脑中TDP-43转录物的原位杂交模式。棒材，500µm。（E） WT和Tg小鼠大脑中TDP-43蛋白的免疫染色模式。CA1、CA1层；CA3、CA3层；DG，齿状回。棒材，200µm。B-E中的结果代表了三个独立的实验。
图2。
图2。
CaMKII-TDP-43 Tg小鼠的行为表现。（A） 2个月龄WT和TDP-43 Tg小鼠的水迷宫试验。学习/记忆能力表示为连续六次测试中显示的延迟。结果代表三个独立实验的平均值±SEM(n个=20只小鼠/组）。（B） 2月龄WT和Tg小鼠在恐惧条件反射任务中认知功能的比较。（C） 2个月龄WT和Tg小鼠的运动活性试验。B和C中的结果表示三个独立实验的平均值±SEM(n个=16只小鼠/组）。（D） 与用尾巴悬吊的WT小鼠相比，6个月大的Tg小鼠出现了异常的肢体弯曲。结果代表了五个独立实验。（E） WT和Tg小鼠的Rotarod试验。显示了2、4和6个月龄小鼠从旋转杆（20转/分）上掉落的时间。（F） 小鼠在1小时新物体识别测试中的表现。结果代表三个独立实验的平均值±SEM(n个=10只小鼠/组）。*，P<0.05。
图3。
图3。
CaMKII-TDP-43 Tg小鼠的电生理研究。（A） 2月龄CaMKII-TDP-43 Tg小鼠海马中的LTP减弱。强烈破伤风刺激CA1放射层可诱发LTP。结果代表三个独立实验的平均值±SEM(n个=18只小鼠/组）。（B） 记录CaMKII-TDP-43 Tg小鼠原代海马培养物中mEPSCs的改变。对WT和TDP-43 Tg小鼠培养的海马神经元（12–15 DIV）进行全细胞电压钳记录。顶部显示了神经元记录的mEPSCs的代表性痕迹。mEPSC的频率、振幅、衰减τ和上升τ如直方图所示。*，P<0.05；***，P<0.001。刻度条分别为50 pA和1 s。结果表示三个独立变量的平均值±SEM(n个=10只小鼠/组）。
图4。
图4。
CaMKII-TDP-43 Tg小鼠学习/记忆相关蛋白水平的变化。（A） 2月龄WT和Tg小鼠大脑皮层和海马提取物中不同蛋白质的Western blot分析(n个=2只小鼠/组）。结果代表了三个独立的实验。蛋白质印迹数据的定量分析显示在A的下半部分。（B）GAD67表达的免疫染色分析和GABA释放的测量。WT（左）和TDP-43 Tg（Tg，右）小鼠的原代海马神经元培养物用抗-GAD67（绿色）和抗-TDP-43（红色）双重染色。棒材，50µm。GAD67相对GAD67强度的统计比较+共聚焦图像下方的左直方图显示了WT和Tg小鼠的细胞。数据代表三个独立实验的平均值±SEM(n个=20只小鼠/组）。右下方的直方图显示了WT和Tg小鼠GABA水平的统计比较(n个= 5; P<0.05）。
图5。
图5。
CaMKII-TDP-43 Tg小鼠大脑的神经变性。（A） 2月龄TDP-43 Tg和WT小鼠海马和皮层（CX）中显示GFAP染色（绿色）的典型免疫荧光图像。细胞核用DAPI（蓝色）标记。CA1、CA1层；CA3、CA3层；DG，齿状回。棒材，100µm。（B） WT小鼠和Tg小鼠大脑皮质和海马提取物中尿素可溶部分的代表性蛋白质印迹模式+/+小鼠分别在2mo和6mo时。箭头指向未修改的TDP-43形式。A–C中的结果代表了五个独立实验。
图6。
图6。
小鼠脑神经元中TDP-43分布的免疫荧光染色分析。（A） WT和Tg小鼠的脑切片与抗TDP-43（红色）、抗NeuN（绿色）和DAPI（蓝色）共染。TDP-43型+NCI用箭头表示。Tg中每个神经元一个+/+WT样本（盒装）在右下角放大(n个=5只小鼠/组）。棒材，20µm。（B） 6个月龄Tg的代表性免疫染色模式+/+小鼠脑切片显示含有TDP-43（绿色）的神经细胞NCI，抗泛素（Ub）染色也呈阳性（红色，箭头）。其中一个带有TDP-43的细胞的高倍照片+，单位Ub+NCI显示在右下角。棒材，20µm。
图7。
图7。
Tg小鼠大脑中的神经元丢失和凋亡。（A） 降低6个月龄Tg小鼠的脑质量。对整个大脑进行解剖和称重。n个= 5; P<0.05。（B） Tg小鼠皮层神经元丢失。用抗NeuN抗体对6个月龄Tg和WT小鼠的冠状脑切片进行免疫染色。比较了Tg小鼠和WT小鼠皮层神经元的平均数量（右；n个每组=5，P<0.05）。棒材，100µm。（C） 6个月龄Tg小鼠大脑的TUNEL分析。凋亡细胞核显示为绿色（箭头），DAPI染色显示为蓝色。（D） 6月龄WT和Tg小鼠大脑总提取物（皮质+海马）的蛋白质印迹显示总caspase-3和活性caspase-2水平(n个=5只小鼠/组）。棒材，20µm。
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