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.2011年1月；18(1):133-44.
doi:10.1038/cdd.2010.82。 Epub 2010年7月9日。

TSC1和TSC2肿瘤抑制因子是内质网应激反应的必要条件，可保护细胞免受内质网胁迫诱导的凋亡

杨俊康 1, M-K路, K-L关
附属公司

TSC1和TSC2肿瘤抑制因子是内质网应激反应的必要条件，可保护细胞免受内质网胁迫诱导的凋亡

杨俊康等。 细胞死亡不同. 2011年1月.

摘要

结节性硬化综合征（TSC）1和TSC2是抑制细胞生长的肿瘤抑制剂，其中任何一种基因的突变都会导致多个组织中的良性肿瘤。TSC1和TSC2基因产物形成一种功能性复合物，该复合物对脑中富集的Ras同源物（Rheb）具有GTPase激活蛋白（GAP）活性，以抑制哺乳动物雷帕霉素靶点复合物1（mTORC1），该复合物在TSC突变肿瘤中被组成性激活。我们发现TSC1或TSC2突变的细胞对内质网（ER）应激非常敏感，并发生凋亡。尽管TSC突变细胞显示eIF2α磷酸化升高，这是一种早期内质网应激反应标记物，但在基础和诱导条件下，包括ATF4、ATF6和C/EBP同源蛋白（CHOP）在内的其他内质网胁迫反应标记物的诱导严重受损。内质网应激反应的缺陷通过猛禽击倒而不是通过雷帕霉素处理在TSC突变细胞中得以恢复，这表明雷帕霉素不敏感的mTORC功能是内质网胁迫反应缺陷的原因。一贯地，Rheb的激活使细胞对内质网应激敏感。我们的数据显示TSC1/TSC2和Rheb在未折叠蛋白反应和细胞存活中起着重要作用。我们推测TSC1/2抑癌剂的一个重要生理功能是保护细胞免受有害条件的影响。这些观察结果表明，使用内质网应激剂选择性杀伤TSC1或TSC2突变细胞用于TSC治疗具有潜在的治疗应用价值。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
TSC缺乏细胞对内质网应激诱导的细胞死亡敏感。TSC1+/+或−/−MEF(一)和TSC2+/+或−/−LEF(b条)与thapsigargin（TG，1）孵育μM） ，衣霉素（Tm，2μg/ml）或MG 132（MG，10μM） 持续18h，观察细胞死亡情况。本文的所有结果都是2-3个独立实验的代表
图2
图2
内质网应激诱导TSC缺乏细胞中caspase活化。TSC1+/+或−/−MEF(一)和TSC2+/+或−/−LEF(b条)与MG 132（MG）、他普司加林（TG）或衣霉素（Tm）一起孵育指定的时间。使用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12、裂解半胱氨酸蛋白酶9或裂解半胱天冬酶3的特异性抗体通过western blotting分析细胞裂解产物。肌动蛋白水平作为负荷控制进行测量
图3
图3
ER应力诱导eIF2αTSC缺乏细胞的磷酸化增加。TSC1+/+或−/−MEF(一)和TSC2+/+或−/−LEF(b条)用MG 132（MG）、他普司加林（TG）或膜霉素（Tm）处理，并在指定的时间点制备细胞裂解物。eIF2的磷酸化α通过使用抗磷酸-eIF2的蛋白质印迹进行测量α（p-eIF2）α)抗体。通过用抗eIF2重组细胞膜来分析细胞裂解物的负载α和抗肌动蛋白抗体
图4
图4
TSC缺陷细胞表现出缺陷的内质网应激反应。(一)TSC1+/+或−/−MEF和TSC2+/+或-/−LEF与MG 132（MG）、thapsigargin（TG）或突尼斯霉素（Tm）孵育，并在指定的时间点制备核提取物（NE）或全细胞裂解物（WCL）。使用特异性抗体通过免疫印迹法检测ATF4、CHOP、ATF6和XBP-1剪接形式的诱导。使用抗U1SnRNP 70（NE）或抗肌动蛋白（WCL）抗体测定等蛋白载量。(b条)内质网应激对TSC1+/+或−/−MEF中ATF4和CHOP的诱导作用。细胞与MG 132（MG）、thapsigargin（TG）或tunicamycin（Tm）孵育4h，制备总RNA。使用特定引物进行定量RT-PCR，折叠诱导用肌动蛋白mRNA水平进行标准化
图5
图5
TSC1和TSC2功能是细胞生存应对内质网应激所必需的。(一–d日)TSC2重组阻断内质网应激诱导的细胞凋亡。(一)TSC2抗体免疫印迹证实TSC2过度表达。(b条–d日)细胞用培养基（无）、thapsigargin或突尼斯霉素处理。4或24小时后制备细胞裂解物以检测内质网应激标记物ATF6(b条)或诱导裂解caspase-3(c（c）)通过免疫印迹法。24小时后收集细胞，通过FACS分析测定凋亡诱导(d日). (电子–小时)内质网应激诱导TSC1敲低的HeLa细胞凋亡。(电子)用无靶向shRNA（对照）或TSC1感染HeLa细胞，用抗TSC1抗体进行免疫印迹证实TSC1的敲除。(（f）–小时)用培养基（无）、thapsigargin或突尼斯霉素处理细胞，6或24小时后获得细胞裂解物以检测ATF6(（f）)或裂解半胱天冬酶-9(克)通过免疫印迹法。24小时后通过FACS分析测定细胞凋亡诱导(小时). 每个象限中的数字表示人口的平均百分比
图5
图5
TSC1和TSC2功能是细胞生存应对内质网应激所必需的。(一–d日)TSC2重组阻断内质网应激诱导的细胞凋亡。(一)TSC2抗体免疫印迹证实TSC2过度表达。(b条–d日)用培养基（无培养基）、他普司加林或衣霉素处理细胞。4或24小时后制备细胞裂解物以检测内质网应激标志物ATF6(b条)或诱导裂解caspase-3(c（c）)通过免疫印迹法。24小时后收集细胞，通过FACS分析测定凋亡诱导(d日). (电子–小时)内质网应激诱导TSC1敲低HeLa细胞凋亡。(电子)用无靶向shRNA（对照）或TSC1感染HeLa细胞，并用抗TSC1抗体进行免疫印迹证实TSC1的敲除。(（f）–小时)用培养基（无）、thapsigargin或突尼斯霉素处理细胞，6或24小时后获得细胞裂解物以检测ATF6(（f）)或裂解半胱天冬酶-9(克)通过免疫印迹法。24小时后通过FACS分析测定细胞凋亡诱导(小时). 每个象限中的数字表示人口的平均百分比
图6
图6
雷帕霉素不能保护TSC突变细胞免受内质网应激诱导的凋亡。(一)TSC1−/−MEF或TSC2−/–LEF与或不与雷帕霉素（10 nM）孵育1 h，然后用培养基MG 132（MG）、thapsigargin（TG）或突尼斯霉素（Tm）处理，或用无葡萄糖培养基（-葡萄糖）孵养，如图所示。18小时后，观察到细胞死亡(一)制备细胞裂解物，用抗裂解caspase-3抗体分析细胞死亡诱导(b条). 通过使用抗肌动蛋白抗体重制膜来测量蛋白质负荷。24小时后收集细胞，通过流式细胞术测量细胞死亡诱导(c（c）)
图6
图6
雷帕霉素不能保护TSC突变细胞免受内质网应激诱导的凋亡。(一)TSC1−/−MEF或TSC2−/–LEF与或不与雷帕霉素（10 nM）孵育1 h，然后用培养基MG 132（MG）、thapsigargin（TG）或突尼斯霉素（Tm）处理，或用无葡萄糖培养基（-葡萄糖）孵养，如图所示。18小时后，观察到细胞死亡(一)制备细胞裂解物，用抗裂解caspase-3抗体分析细胞死亡诱导(b条). 通过使用抗肌动蛋白抗体对膜进行重编程来测量蛋白质负载。24小时后收集细胞，通过流式细胞术测量细胞死亡诱导(c（c）)
图7
图7
高Rheb活性使细胞对内质网应激诱导的凋亡敏感。(一)用对照型、野生型或组成活性突变体（S16H）Rheb-编码慢病毒感染HeLa细胞，并用抗CBP-tag抗体进行western blotting证实过表达。(b条,c（c）)细胞用培养基（无）、thapsigargin或突尼斯霉素处理。24小时后，制备细胞裂解物，通过western blot分析检测裂解caspase-9的诱导(b条)，收集细胞，通过FACS分析测量细胞死亡诱导(c（c）). (d日)野生型MEF被慢病毒载体感染，慢病毒载体不表达任何（N）、组成活性Rheb（Act）或靶向Rheb的shRNA（KD）。48 h后，用培养基（无）、MG 132（MG）、thapsigargin（TG）或tunicamycin（Tm）处理细胞18 h，制备细胞裂解物，用特异性抗体通过western blotting分析caspase 9或caspase 3裂解形式的诱导。通过抗Rheb抗体测量Rheb的过度表达或敲除，并且通过使用抗肌动蛋白抗体测量蛋白质负载
图8
图8
TSC1−/−MEF中猛禽基因敲除可恢复内质网应激反应，并保护细胞免受内质网胁迫诱导的凋亡。TSC1−/−MEF细胞被无靶向（对照）或猛禽的shRNA-编码慢病毒感染，并且通过western blot分析证实猛禽被击倒。(b条–d日)细胞用培养基（无）、thapsigargin或突尼斯霉素处理。处理4或24小时后制备细胞裂解物，用于检测ATF6(b条)或裂解半胱天冬酶-3(c（c）)通过免疫印迹法。24小时后通过FACS分析测定细胞死亡诱导(d日)
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