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.2010年9月1日；19(17):3413-29.
doi:10.1093/hmg/ddq253。 Epub 2010年6月21日。

抗氧化剂可以抑制聚谷氨酰胺病模型中的基础自噬并增强神经变性

本杰明·安德伍德 1, 萨拉·伊马里西奥, 安吉丽·弗莱明, 克劳迪娅·罗斯, 高里·克里希纳, 菲比·赫德, 玛丽·奎克, 维克多一世科洛楚克, 毛里齐奥·雷纳, 索万·萨卡尔, 莫伊斯·加西亚·阿伦西比亚, 卡希尔·J·奥凯恩, 迈克尔·P·墨菲, 大卫·C·鲁宾斯坦
附属公司

抗氧化剂可以抑制聚谷氨酰胺病模型中的基础自噬并增强神经变性

本杰明·安德伍德等。 人类分子遗传学. .

摘要

许多神经退行性疾病表现出蛋白质积累和氧化应激增加。治疗策略包括通过增强自噬或使用抗氧化剂减少氧化应激来清除易聚集的蛋白质。许多自噬诱导刺激增加了活性氧（ROS），这引起了人们的担忧，即自噬上调的益处可能会被ROS毒性抵消。这里我们显示，并非所有自噬诱导物都显著增加ROS。然而，许多抗氧化剂同时抑制基础和诱导的自噬。通过阻断自噬，抗氧化药物可以增加与神经退行性疾病相关的易聚集蛋白的水平。在亨廷顿病的苍蝇和斑马鱼模型中，抗氧化剂加剧了疾病表型，并取消了自噬诱导剂的拯救作用。因此，某些类别的抗氧化剂在神经退行性疾病中的潜在益处可能会因其自噬阻断特性而受到损害。

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数字

图1。
图1。
并非所有自噬诱导剂都会导致活性氧增加。海藻糖和雷帕霉素都不会引起ROS水平的增加。HeLa细胞负载DCFDA(一)，二氢罗丹明123(B类)或MitoSOX™红色(C类)，在用H治疗之前2哦2、甲萘醌、雷帕霉素、海藻糖、二甲基亚砜或在汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中饥饿。按照材料和方法中的描述，连续测量荧光信号。直方图显示24小时时的信号作为阳性对照的百分比，而相邻线图则显示24小时内从基线到时间的变化(D类)用海藻糖、二甲基亚砜（DMSO）、雷帕霉素或两者均不处理细胞24小时，然后加载DCFDA，1小时后读取信号。装载后用过氧化氢处理或饥饿1小时可提供阳性对照。雷帕霉素和海藻糖不会引起信号增加。(E类)COS-7细胞负载羧基-H2DCFDA，然后按照与（a）类似的方式进行治疗。只有H2哦2饥饿导致信号显著增加。所有实验均未使用探针作为阴性对照（无DCFDA、NoDCFDA；无二氢罗丹明、NoDHR；无Mito、no MitoSOX™红色；无羧基-H2DCFDA，NoH2DCF）。所有数据点都有误差条（但有些数据点的误差条太小，无法看到），并显示了三个独立实验的标准平均误差（SEM），一式三份（NS，不显著*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001).
图2。
图2。
抗氧化药物抑制基础和诱导的自噬。NAC、胱胺和谷胱甘肽都能抑制海藻糖诱导的自噬。用海藻糖处理COS-7细胞，并与指定浓度的NAC共同处理(一)，用胱胺（Cys）预处理24小时(B类)或与谷胱甘肽（Glu）共同处理(C类). 24小时后，在收获前的最后4小时内添加饱和剂量的巴非霉素A1。每个印迹下面的图表显示了LC3-II/肌动蛋白的密度分析，该分析来自于三个实验，分三次进行，控制条件（仅海藻糖）设置为100%。(D类)NAC损害雷帕霉素诱导的基础自噬。用25 m米NAC、雷帕霉素、雷帕霉素和NAC、海藻糖（Tre）或海藻糖和NAC处理24小时。所有条件在收获前用巴非霉素处理4小时。该图显示了密度分析，未将处理（对照）设置为100%。(E类)NAC对自噬的影响也见于神经元。分化的人类初级皮层神经元按指示进行治疗（NAC 10 m米)并在24小时后无需进一步处理（上面板）或在4小时后用巴非霉素A1处理（下面板）进行印迹。显示了三份实验的代表性数据。(F类)NAC的作用见于HeLa细胞。Hela细胞在对照条件下或用NAC（15 m）处理米)、海藻糖或海藻糖和NAC，24小时后进行蛋白质印迹分析。所有实验均在巴非霉素饱和剂量下进行，持续4小时。注意，HeLa细胞的LC3-1水平很低。(G公司)半胱氨酸能抑制基础自噬。用250µ米半胱胺48h，最后4h在bafilomycin存在下进行westernblot分析。所有面板中的误差条代表至少三个独立实验的SEM，一式三份(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001).
图3。
图3。
NAC在第二次实验中损害自噬体合成。(一)NAC显著降低自噬体和自噬多胞体的数量。如材料和方法中所述，表达RFP和GFP标记LC3-II的HeLa细胞按如下所示进行处理（NAC 10 m米)，然后进行固定并进行红点和绿点的自动计数。显示了典型的共焦显微镜图像。(B类)自动细胞计数结果。左侧面板显示相对于对照的绿点（自噬体）的数量，右侧面板显示红色减去绿色点（自噬多体）的数量。所示图表代表了一式三份的五次实验的平均结果。误差条代表SEM(*P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001，NS，不显著）。
图4。
图4。
NAC损害自噬底物的清除。(一)在关闭转基因表达之前，诱导48小时表达HA标记的A53Tα-突触核蛋白[一种在这些细胞（22）中不形成可见聚集物的蛋白的突变形式]。在关闭期间，按如下所示处理细胞（NAC 10 m米，Rap，雷帕霉素），收获前24小时，并通过western blotting进行分析。该图显示了密度分析，NAC结果设置为100%。(B类)NAC增加突变体亨廷顿蛋白的聚集。在8小时（47）内诱导EGFP标记的亨廷顿蛋白外显子1的表达，该外显子具有扩展的（74Q）聚谷氨酰胺重复序列。然后关闭转基因，并对细胞进行如下处理（NAC 10 m米)固定和计数前72小时。该图显示了代表性实验中每个条件下具有聚集的单元格的百分比，误差条表示标准偏差。对于所有其他面板，误差条代表SEM(*P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001，NS，不显著）。
图5。
图5。
维生素E和SOD的过度表达也可以抑制自噬。(一)维生素E可以抑制海藻糖诱导的自噬。用海藻糖和增加剂量的维生素E（DL-α-生育酚，VitE）处理COS-7细胞24小时，然后用巴非霉素处理4小时，处理方式与图2A-C中的实验类似。密度分析显示了误差条和三次实验的统计数据，如图2A-C所示。(B类)维生素E可以抑制基础自噬。用250µ米维生素E在用类似于图2G的方法进行蛋白质印迹分析之前。(C类)维生素E对自噬的影响也见于原代神经元培养。按照指示，在最后4小时内添加巴非霉素处理分化的小鼠初级皮层神经元(D类)维生素E对HeLa细胞的基础自噬和诱导自噬有类似的作用。在对照条件下或使用维生素E（250µ米)、海藻糖或海藻糖和维生素E，24 h后进行western blot分析。所有实验都是在巴非霉素饱和剂量下进行的，持续4小时(E类)维生素E可以抑制与神经退行性疾病相关的自噬底物的清除。在对细胞进行如图所示的处理（维生素E，250µ米)收获前24小时，用western印迹法进行分析。该图显示了密度分析，控制结果设置为100%。(F类)用人SOD1转染COS-7细胞，并允许其表达48 h，最后用巴非霉素表达4 h。显示了一个具有代表性的western blot。该图显示了在pcDNA（对照）设置为100%的情况下，对五个独立实验进行的三次密度分析。误差条代表SEM(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，NS，不显著）。
图6。
图6。
抗氧化剂影响调节自噬的不同典型机制。(一)维生素E增加mTOR底物的磷酸化。用250µ米采收前24小时服用维生素E、雷帕霉素或雷帕霉素和维生素E。在两种凝胶上同时运行裂解液，并探测mTOR底物和负载控制。4E-BP-1（一种mTOR底物）具有多个磷酸化位点，并作为四条带运行，上部带代表主要的磷酸化形式。与对照组相比，维生素E增加磷酸化，并削弱雷帕霉素抑制4E-BP1磷酸化的能力。使用第二种底物核糖体蛋白S6证实了这些结果。T4E-BP表示总4E-BP、P4E-BP磷酸化4EBP、TS6总S6和PS6磷酸化S6。Dk-exp表示暗曝光，Lt-exp表示光曝光。(B类)NAC降低mTOR底物的磷酸化。该实验以与（a）类似的方式进行，但使用25 m米NAC代替维生素E。显示了典型的蛋白质斑点。(C类)硫醇抗氧化剂降低JNK磷酸化。COS-7细胞用25 m米NAC或谷胱甘肽和使用FACE ELISA试剂盒测量的JNK磷酸化。该图显示了磷酸化（PJNK）/总JNK（TJNK。(D类)硫醇抗氧化剂降低Bcl-2磷酸化。如图所示，将COS-7细胞处理24小时，并在剥离和重制总Bcl-2（TBcl-2）之前进行磷酸化Bcl-2的印迹。该图表示密度分析。(E类)维生素E对Bcl-2磷酸化没有影响。用维生素E或二甲基亚砜对照物处理COS-7细胞24小时，并通过western blot分析磷酸化Bcl-2和Beclin 1的水平。未发现显著差异。(F类)超氧化物生成剂甲萘醌增加LC3-II和JNK和Bcl-2的磷酸化，但对mTOR底物或Beclin-1的表达没有影响。用100µ米采收前1小时服用甲萘醌，并通过western blot分析LC3-II、磷酸化Bcl-2和总Bcl-2。图表显示了控制设置为100%时的密度分析。甲萘醌和维生素E对JNK磷酸化的影响以类似于（C）的方式进行分析。所有面板代表三个独立的三次重复实验的结果，误差条代表SEM(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，NS，无显著性）。
图7。
图7。
硫醇抗氧化剂和SOD的过度表达可以增强果蝇属聚谷氨酰胺病模型。(一)高剂量NAC加剧了突变的亨廷顿蛋白表型。在眼睛中表达突变型Q120亨廷顿蛋白外显子-1的苍蝇在接受高剂量NAC（5–10 mg/ml）治疗时，表现出神经退化增加，而在Q23对照苍蝇中未发现这种现象。(B类)当雷帕霉素与NAC或胱胺联合使用时，用雷帕霉素对Q120苍蝇的救援被取消。当用100µ米胱胺或2µ米雷帕霉素。当Q120苍蝇用500 mg/ml NAC或100µ米胱胺与2µ米雷帕霉素(*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，NS，无显著性）。(C类)SOD过度表达会加剧神经变性。在眼睛中表达裸聚谷氨酰胺束（Q48）的雄性苍蝇与过表达SOD1或SOD2的苍蝇杂交时，其神经退化程度显著增加，而过表达SOD2或SOD1的对照苍蝇则没有这种影响。
图8。
图8。
在亨廷顿病斑马鱼模型中，NAC和维生素E可以抑制自噬流量并增加聚集。(一)氯化铵导致斑马鱼幼虫中LC3-II水平显著升高，这与阻断自噬体/溶酶体融合的能力一致。(B类和C类)在斑马鱼中，与NAC或维生素E联合治疗可显著降低氯化铵存在时的LC3-II水平，这与斑马鱼降低自噬流量的能力一致。面板显示LC3-II与微管蛋白负荷控制的蛋白质斑点。这些图表代表了三个独立实验的密度分析。(D类和E类)NAC和维生素E增加EGFP突变体亨廷顿蛋白在转基因斑马鱼视网膜中的聚集，而自噬诱导药物雷帕霉素和可乐定则减少其聚集。（D） 显示了与对照组相比，每种情况下每个视网膜的平均聚集数量。从视网膜上拍摄的代表性图像如（E）所示，亨廷顿蛋白聚集体用箭头表示。（A，对照条件；B，NAC治疗；C，维生素E；D，雷帕霉素治疗；E，雷帕霉素和NAC；F，可乐定治疗；G，可乐平和NAC）。请注意，雷帕霉素或可乐定的抢救作用因与NAC联合治疗而被取消(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，NS，无显著性）。
图9。
图9。
NAC抑制饥饿小鼠肝脏LC3-II的增加。小鼠经历了两个24小时的饥饿期，每90分钟进食一次。处死后，用免疫印迹法分析肝脏中LC3-II的水平。该图表示饥饿（阳性对照，Starv）设置为100%时每组五只小鼠的平均结果。误差条代表SEM(**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，NS，不显著）。
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