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.2010年1月15日；9(2):389-97.
doi:10.4161/cc.9.2.10475。 Epub 2010年1月29日。

磷酸化H2AX病灶形成和DNA双链断裂时DNA修复组装的复杂性

Asako J Nakamura公司 1, V阿什图什·拉奥, 伊威斯·波米尔, 威廉·M·邦纳
附属公司

磷酸化H2AX病灶形成和DNA双链断裂时DNA修复组装的复杂性

Asako J Nakamura公司等。 细胞周期. .

摘要

基因组稳定性的维持需要通过断裂位点附近多组蛋白H2AX分子的磷酸化介导的有效DNA双链断裂（DSB）修复。磷酸化H2AX（gammaH2AX）分子形成病灶，覆盖许多巨大的染色质碱基。γ-H2AX病灶的形成对于有效的DNA损伤反应（DDR）和维持基因组稳定性至关重要，然而，病灶中蛋白质组织的机制尚不清楚。为了研究γH2AX病灶形成的性质，我们使用多种技术分析了γH2AX和其他DDR蛋白在DSB位点的分布，以可视化、扩展和部分破坏染色质。我们在此报告，γH2AX病灶在细胞周期中改变了成分，蛋白53BP1、NBS1和MRE11从G（2）的病灶中分离出来，有丝分裂在下一个G（1）开始时恢复。相反，在有丝分裂期间，MDC1与γ-H2AX保持共定位。此外，虽然gammaH2AX被发现跨越DSB位点两侧的大区域，但53BP1和NBS1更为局限，MDC1在病灶中的双重定位。发现H2AX和MDC1参与DSB形成后的染色质松弛。我们的数据表明，DSB修复焦点是一个包含内部复杂性的异构动态结构。

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数字

图1
图1
IRIF的成分在细胞周期中重组。用秋水仙素使HeLa细胞同步化，暴露于1Gy IR，孵育30分钟后固定。DAPI染色对有丝分裂期进行分类。（A） γH2AX和53BP1的免疫染色。I-III指所述区域的扩大。（B） γH2AX和MDC1免疫染色。（C） γH2AX病灶部分与53BP1（左）或MDC1（右）共定位。
图2
图2
γH2AX病灶在染色质肿胀时扩大，MDC1病灶也是如此，而53BP1、NBS1和MRE11病灶则没有。（A，左图）暴露于1 Gy后30分钟，HeLa细胞肿胀，然后对γH2AX和53BP1、MRE11、NBS1或MDC1进行双重免疫染色。顶行显示了53BP1的无涌流控件。底行显示了一个反向染色控件。（A，右图）沿着合并图像中显示的白线进行密度扫描。（B） 印度麂细胞染色质纤维上γH2AX和53BP1或NBS1的免疫染色。在暴露1 Gy后30分钟制备染色质纤维，并对γH2AX和53BP1或NBS1进行免疫染色。
图3
图3
γH2AX病灶在肿胀的中期染色体上扩大。（A） HeLa中期染色体γH2AX免疫染色，有（右）或无（左）肿胀。HeLa细胞的中期扩散在室温下用无菌水培养15分钟。小心地从细胞中取出溶液后，用80%乙醇在−20°C下固定30分钟。（B）印度麂细胞中期染色体在（右）肿胀或（左）肿胀后进行γH2AX免疫染色。右侧面板显示了中间面板中所标注区域的放大倍数。
图4
图4
在IR后2小时，γH2AX定位于DNA DSB位点周围的一个大区域。（A，左图）HeLa细胞在暴露1 Gy后的指定时间制备膨胀的间期细胞核，并对γH2AX和53BP1进行免疫染色。（A，右图）沿合并图像中显示的白线进行密度扫描。注意，在2小时及以后，γH2AX病灶不会在肿胀的染色质上扩张。（B） （A）中数据的图形表示。三个独立实验的平均值。每个实验中至少统计了25个病灶。误差线表示标准偏差。
图5
图5
MDC1形成双焦点，似乎包围了γH2AX焦点。（A） HeLa中期染色体γH2AX和MDC1染色。右侧面板显示合并图像中方框区域的放大图像。（B） HeLa中期染色体进行γH2AX和MDC1染色，并通过DeltaVision OMX™3D-SIM™超分辨率成像系统进行分析。
图6
图6
γH2AX和MDC1参与红外照射后的染色质松弛。（A） 红外照射后染色质的MNase可及性增加。用MNase处理H2AX野生型MEF（WT）、H2AX-null MEF（KO）、H_2AX-S139A突变的H2AX-MEFs（S139A）、HeLa细胞（CTR）和MDC1-depleted HeLa电池（MDC1-siRNA）的细胞5min，并对片段进行凝胶电泳分析。（B） （A）中所示凝胶的不同通道的剖面。N1-N7表示每个寡核小体的核小体数量。注意IR暴露后野生型H2AX或MDC1细胞中寡核苷酸大小的变化。
图7
图7
DSB周围病灶中DNA修复蛋白的分布模型。γH2AX在DNA DSB位点周围大面积形成IRIF。MDC1主要积聚在γ-H2AX病灶的外边缘。相反，53BP1、NBS1和MRE11主要聚集在DNA DSB位点附近的较小区域。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • DNA双链断裂：并非所有的病灶都是相同的。
    Cobb JA，Lees-Miller SP.公司。 Cobb JA等人。 细胞周期。2010年2月1日；9（3）:442-3。Epub 2010年2月1日。 细胞周期。2010 PMID：20130448 没有可用的摘要。
  • 转移焦点。
    Nelson G、von Zgliniki T。 Nelson G等人。 细胞周期。2010年2月1日；9(3):443-4. Epub 2010年2月1日。 细胞周期。2010 PMID：20130449 没有可用的摘要。
  • DNA损伤信号和修复病灶的解剖和细胞周期演变。
    伊利亚基斯·G·。 伊利亚基斯·G·。 细胞周期。2010年2月1日；9(3):444-5. Epub 2010年2月1日。 细胞周期。2010 PMID：20130450 没有可用的摘要。

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参考文献

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