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.2009年9月4日；284(36):24242-56.
doi:10.1074/jbc。M109.014498。 Epub 2009年6月25日。

人类混合谱系白血病蛋白-1（MLL1）核心复合物多重赖氨酸甲基化的机制研究

阿纳米卡·帕特尔 1, Venkatasubramanian护法, 瓦拉里·沃特, 迈克尔·科斯格罗夫
附属公司

人混合系白血病蛋白-1（MLL1）核心复合物多重赖氨酸甲基化机制的研究

阿纳米卡·帕特尔等。 生物化学杂志. .

摘要

真核生物基因组中的转录依赖于调节组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）甲基化程度的酶。混合血统白血病蛋白-1（MLL1）是H3K4甲基转移酶SET1家族的成员，在急性白血病中经常重排。尽管序列比较预测SET1家族酶只能使其底物单甲基化，但H3K4的单甲基化、二甲基化和三甲基化已被归因于体内和体外的SET1家族复合物。为了更好地理解这一悖论，我们对含有人类MLL1、WDR5、RbBP5、Ash2L和DPY-30的五组分200-kDa MLL1核心复合物进行了生化重组和表征。我们证明了分离的MLL1 SET结构域是一个缓慢的单甲基转移酶，MLL1的酪氨酸3942阻止H3K4的二甲基化和三甲基化。相反，含有MLL1 SET结构域、WDR5、RbBP5、Ash2L和DPY-30的复合物的酶活性显著增加约600倍，但仅限于H3K4的二甲基形式。单循环动力学实验表明，导致H3K4二甲基化的反应涉及一个单甲基化物种的瞬时积累，这表明MLL1核心复合物使用非加工机制来催化多个赖氨酸甲基化。我们还发现，MLL1核心复合物的非SET结构域成分具有以前未被识别的甲基转移酶活性，该活性催化MLL1中心复合物中的H3K4二甲基化。我们的结果表明，MLL1核心复合物的多重赖氨酸甲基化机制涉及复合物中两个不同活性位点的两个甲基的顺序加成。

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数字

图1。
图1。
MLL1核心复合物组分的纯化和流体力学特性。 一考马斯亮蓝染色SDS-PAGE显示纯化的MLL1核心复合物成分。b条，示意图显示了全长MLL1的结构域和本研究中使用的结构，该结构域由残基3745–3969（MLL3745).c（c），无扩散沉降系数分布（c（s）），由单个MLL1岩芯复合组分的沉降速度数据得出：MLL3745(蓝色)，WDR5(粉红色)，RbBP5(绿色)、Ash2L(紫色)和DPY30(红色).
图2。
图2。
MLL1核心复合体内的成对相互作用。 一，总结了通过沉降速度分析超速离心可以观察到的成对相互作用。（+）检测到相互作用；（−）未检测到交互作用。b–e类，c（s）以下浓度下二元络合物沉降速度数据的分布：7μ米(实心黑线), 3.5 μ米(虚线)和1.5μ米(虚线).b条、MLL3745-WDR5（摘自参考文献45）。c（c），WDR5-RbBP5；d日，RbBP5-Ash2l；和e（电子），Ash2L-DPY-30。如果，图解模型总结了观察到的成对相互作用和离解常数(K（K）d日)MLL1核杂岩内。
图3。
图3。
MLL1核心复合物的组装和酶活性的表征。这个左列从顶部到底部显示了添加MLL1岩心复合体各组成部分后沉降速度实验的c（s）分布，从以下开始：一、MLL3745（M） ；d日、MLL3745-WDR5（M-W）（转载自参考文献45）。克、MLL3745-WDR5-RbBP5（M-W-R）；j个、MLL3745-WDR5-RbBP5-Ash2L（M-W-R-A）；和米、MLL3745-WDR5-RbBP5-Ash2L-DPY30（M-W-R-A-D2). 这个中间立柱从顶部到底部(b条,e（电子）,小时,k个、和n个)显示了24小时后酶分析的MALDI-TOF质谱。每个光谱对应于c（s）面板上左边. The第三列从顶部到底部(c（c）,如果,我,我、和哦)显示了甲基化反应的动力学进展，甲基化反应由相应的配合物催化左边。每个时间点表示MALDI-TOF分析中每个物种的总整合面积百分比。
图4。
图4。
用MALDI-TOF质谱法测定单个周转过程曲线的速率常数。 一MLL催化的反应总速率的比较3745(M（M）)存在或不存在MLL1相互作用蛋白（W-R-A-D2).实线根据“实验程序”下的方程式1拟合未修饰组蛋白H3肽峰相对强度的降低，得出b条，MLL1核配合物催化反应的单周转进度曲线(MWRA公司)来自MALDI-TOF MS分析。使用DynaFit将H3K4、H3K4me1和H3K4me2物种的数据全局拟合到方程式1-3（见“实验程序”）。误差线表示±S。E.重复实验。c（c），在DPY30存在下MLL1核配合物催化的反应的单周转进度曲线(MWRAD公司)全球安装，如b.天，速率常数总结（±S.E.）h−1根据“实验程序”下方程式1-3的全局拟合实验数据得出
图5。
图5。
MLL1核心复合物是组蛋白H3K4二甲基转移酶。 1-4车道，比较未修饰组蛋白H3底物（H3K4，车道1)或之前的单甲基化（H3K4me1，车道2); 二甲基化（H3K4me2，车道3); 或三甲基化（H3K4me3，车道4)在H3K4处。这个上部面板显示了考马斯蓝染色的SDS-PAGE酶反应凝胶。这个下部面板显示[三H] 荧光法测定甲基并入组蛋白肽。
图6。
图6。
MLL1的酪氨酸3942控制MLL1 SET结构域的产品特异性。 一，MLL1（蛋白质数据库（PDB）代码：2W5Z）和Dim5（PDB代码：1PEG）SET结构域活性位点的Phe/Tyr开关位置重叠。MLL1如所示洋红，Dim5如所示绿色指示MLL1的Tyr-3942的位置。赖氨酸底物和AdoHcy辅因子来自Dim5三元络合物结构，如所示黄色的。b条和c（c）野生型MLL催化组蛋白H3肽在不同时间点甲基化的MALDI-TOF质谱3745（MLL3745（重量）) (b条)和Y3942F MLL3745（MLL3745（Y3942F）) (c（c）).d日和e（电子），野生型MLL催化甲基化反应的动力学进展3745(d日)和Y3942F MLL3745(e（电子）).如果，野生型与不同H3K4底物的酶活性比较(左侧面板)和Y3942F(右侧面板)MLL公司3745酶。这个上部面板显示考马斯亮蓝染色凝胶的甲基化反应，以及下部面板显示[三H] 荧光法测定甲基并入组蛋白肽。
图7。
图7。
MLL1核心复合物的非SET结构域成分具有组蛋白甲基转移酶活性。 一酶分析显示，MLL1的天冬酰胺3906被丙氨酸（MLL）取代3745（N3906A）)消除分离的MLL1 SET结构域的酶活性(车道1和2).车道3和4显示含有MLL的复合物的分析3745（N3906A）、WDR5、RbBP5、Ash2L和DPY30。这个上部面板显示甲基化反应的考马斯蓝染色凝胶下部面板显示同一凝胶的荧光图。b条，c（s）用化学计量的MLL组装的MLL1核心复合物的沉降速度分析超速离心的分布3745（N3906A）、WDR5、RbBP5和Ash2L。c（c）MLL催化的典型甲基化反应的MALDI-TOF质谱3745（N3906A）24小时后，在WDR5、RbBP5、Ash2L和DPY30存在下设置域。
图8。
图8。
隔离W-R-A-D2亚复合物单甲基化组蛋白H3的赖氨酸4，并在MLL1核心复合物内催化H3K4二甲基化。 一，W-R-A-D的比较2-在未修饰的组蛋白H3肽（H3K4，车道1)或单甲基化（H3K4me1，车道2); 二甲基化（H3K4me2，车道3)，或三甲基化（H3K4me3，车道4)H3K4。这个上部面板显示考马斯蓝染色SDS-PAGE凝胶，以及下部面板显示[三H] 荧光法甲基掺入。b条，组蛋白H3肽中与N3906A MLL1 SET结构域组装的MLL1核心复合物的酶活性比较，如面板a以上。（*表示的蛋白质带是部分降解的MLL3745（N3906A）.)
图9。
图9。
MLL1核心复合物的多赖氨酸甲基化机制与Y3942F MLL1 SET结构域的机制不同。 一，比较由分离的野生型和Y3942F MLL催化的未修饰组蛋白H3肽相对强度降低的反应进程曲线3745通过MALDI-TOF质谱测定的SET域。每种酶的产品特异性用箭头。b条，野生型MLL的比较3745-MALDI-TOF质谱法测定未修饰H3K4肽在存在和不存在MLL1相互作用蛋白的情况下的催化反应进度曲线。
图10。
图10。
提出了MLL1核心复合物多赖氨酸甲基化机制的模型。在这个模型中，MLL1 SET结构域催化组蛋白H3在位点1的单甲基化，随后将单甲基化肽转移到W-R-a-D上的第二个活性位点2子复合体(站点2,白色虚线椭圆)，然后催化组蛋白H3的二甲基化。这个白色问号在里面站点2表示W-R-A-D的催化基序2子复合体未知。速率常数是通过将数据拟合到该模型得出的（图4）。此外，还显示了MLL1 Win基序的WDR5和Arg-3765之间的相互作用，这是之前显示的MLL1核心复合物的组装和二甲基化活性所必需的（45）。
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参考文献

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