A non-canonical MEK/ERK signaling pathway regulates autophagy via regulating Beclin 1

doi:10.1074/jbc.M109.026013

.2009年8月7日；284(32):21412-24.

doi:10.1074/jbc。M109.026013。 Epub 2009年6月11日。

非规范MEK/ERK信号通路通过调节Beclin 1调节自噬

王建荣¹, 玛丽·怀特曼, 连慧琴, 王广新（Guangxin Wang）, 艾米特·辛格, 东阳黄, 特德·丹麦

附属公司

PMID： 19520853
PMCID公司：项目经理2755866
内政部： 10.1074/jbc。M109.026013

非规范MEK/ERK信号通路通过调节Beclin 1调节自噬

王建荣等。生物化学杂志. 2009.

.2009年8月7日；284(32):21412-24.

doi:10.1074/jbc。M109.026013。 Epub 2009年6月11日。

作者

王建荣¹, 玛丽·怀特曼, 连慧琴, 王广新, 艾米特·辛格, 东阳黄, 特德·丹麦

附属

¹汕头大学医学院，广东515041，中国。jrwang@stu.edu.cn

PMID： 19520853
PMCID公司：项目经理2755866
内政部： 10.1074/jbc。M109.026013

摘要

自噬必需蛋白是保护性或破坏性自噬机制的分子基础。然而，关于控制这些蛋白质的信号机制以及哺乳动物自噬的相反后果，人们知之甚少。这里我们报道了一个非规范MEK/ERK模块，位于AMP-activated protein kinase（AMPK）下游和结节性硬化综合征（TSC）上游，通过调节Beclin 1调节自噬。ERK的耗竭部分抑制了自噬，而MEK的特异性抑制则完全抑制了自吞噬。MEK可以绕过ERK促进自噬。基础MEK/ERK活性通过阻止雷帕霉素复合物1（mTORC1）和mTORC2的哺乳动物靶点的分解而赋予基础Beclin 1。在自噬刺激下，AMPK激活MEK/ERK，通过结合和激活TSC分解mTORC1，但分解mTORC独立于TSC。短暂或中度激活的MEK/ERK对mTORC1或mTORC2的抑制导致Beclin 1中度增强，从而导致细胞保护性自噬，而持续激活MEK/ERK对mTORC 1和mTORC 2的抑制则导致Beclin-1显著增强，导致细胞破坏性自噬。因此，我们的研究结果表明，Beclin 1的AMPK-MEK/ERK-TSC-mTOR通路调控代表了负责保护性或破坏性自噬的不同阈值。

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数字

**图1。**
**自噬活性和Beclin 1表达依赖于MEK/ERK。** A类和B类自噬反应与MEK/ERK信号一致。H4IIE和K562细胞接受各种自噬刺激（10μ米雷帕霉素(说唱)48小时，血清耗尽48小时，氨基酸(*AA公司*)耗尽6 h或50 n米维生素D_三(*第3天*)72小时）有或没有2μ米PD98059型(*PD公司*).C类活性MEK或ERK触发自噬反应的组成性表达。H4IIE细胞转染组分活性(*加利福尼亚州*)在溶酶体蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制素A的存在下测定MEK或活性ERK和LC3的加工。D类GFP-LC3转染细胞接受指定处理后的荧光显微镜。点状图案的细胞百分比表示为平均值±S.D(n个= 3).电子，基础MEK/ERK活性赋予构成性Beclin 1表达。消耗性基础磷(第页)-MEK1/2，而不是Raf1，通过siRNA缺失的基础Beclin 1。F类，Raf1的CR3结构域的组成性表达没有触发自噬反应。*G公司*抑制MEK/ERK可降低自噬刺激增强的Beclin 1。H4IIE和K562细胞饥饿氨基酸6 h或血清48 h，或用10μ米雷帕霉素(房间)连同或不连同2μ米PD98059。*H（H）*，耗尽Beclin 1后，MEK/ERK激活导致自噬被取消。Beclin 1敲除的H4IIE细胞缺乏含有或不含2μ米PD98059。如图所示A类到*G公司*是三个独立实验中每个实验的代表性Western blot或荧光显微镜。控制，控制。

**图2。**
**MEK可以绕过ERK触发自噬。** A类和B类p90RSK或Elk的敲除并没有消除自噬。用抗p90RSK或Elk的siRNA转染K562细胞，并根据氨基酸测定LC3处理(*AA公司*)饥饿。C类ERK的敲除并没有废除自噬。用抗ERK1/2的siRNA转染K562细胞，并测定饥饿对LC3处理的影响。D类，MEK可以独立于ERK触发自噬反应(*卡梅克*)或组成型活性MEK与显性负性ERK(*德纳克*)自噬通量测定法检测LC3的加工过程。如图所示A类到D类是三个独立实验中每个实验的代表性Western blots。控制，控制；对-，磷酸化。

**图3。**
**MEK/ERK在自噬信号中位于AMPK下游。** A类，抑制AMPK抑制MEK对自噬刺激的激活。H4IIE细胞缺乏氨基酸(*AA公司*)并用10μ米化合物C。B类MEK的抑制并不能抑制AMPK对自噬刺激的反应。H4IIE细胞缺乏氨基酸，用或不用2μ米PD98059型(*PD公司*)，并测定AMPK活性。C类Beclin 1的上调和AMPK激活诱导的自噬依赖于MEK。H4IIE细胞用1μ米带或不带2μ的AICAR米测定PD98059、AMPK和MEK的活化、Beclin 1的表达、LC3的处理以及Beclin l与PI3KC3的结合。D类和电子MEK与AMPK相互作用，但对自噬刺激无Raf1反应。H4IIE细胞缺乏氨基酸或用1 m米AICAR，MEK和AMPK之间、Raf1和MEK之间或AMPK和Raf1之间的物理相互作用通过使用总量来确定(D类)或磷酸抗体(电子). 生长激素(*GH公司*)处理作为H4IIE细胞中典型Raf/MEK/ERK激活和相互作用的阳性对照。F类激酶头AMPK对AMPK的特异性抑制削弱了MEK的激活和对自噬刺激的自噬活性。稳定转染大鼠AMPKα2激酶d的H4IIE细胞(*杜兰特*)构建物或载体控制缺乏氨基酸6小时。总AMPKα和总磷酸和磷酸的表达(第页)-测定MEK和LC3的加工。如图所示A类到F类是典型的西方斑点吗(*工作分解结构*)或免疫共沉淀(*IP（IP）*)三个独立实验中每个实验的斑点。

**图4。**
**MEK/ERK在自噬信号中位于TSC上游。** A类TSC2是H4IIE细胞和K562细胞中TSC1/2的主要形式。B类TSC2的AMPK激活依赖于MEK/ERK。H4IIE细胞受到1m的刺激米带或不带2μ的AICAR米PD98059型(*PD公司*)，并测定AMPK或TSC2的活化。C类激活的MEK在自噬刺激下形成多个复合物。K562和H4IIE细胞缺乏氨基酸(*AA公司*)，并通过非变性蛋白质印迹法测定包括MEK在内的复合物的形成(*工作分解结构*).D类与TSC2相关的MEK和ERK对自噬刺激的反应。H4IIE细胞缺乏氨基酸或用AICAR处理，并测定TSC2与MEK或ERK的结合。电子，MEK绑定到TSC2需要ERK D域。用组成活性MEK转染H4IIE细胞(*卡梅克*)或具有ERK D结构域的组成性活性MEK突变体被破坏，并且TSC2与活性MEK或不具有ERK D结构域的MEK突变型结合。F类MEK和TSC2之间联系的破坏削弱了TSC2的激活和自噬反应。H4IIE细胞转染了组成活性的MEK、组成活性MEK和ERK siRNA，或组成活性的带有ERK D结构域的MEK突变体。如图所示A类到F类是典型的免疫印迹还是免疫共沉淀(*IP（IP）*)三个独立实验中每个实验的斑点。第页-，磷-；Ctrl，control。

**图5。**
**AMPK-MEK/ERK-TSC信号在小鼠自噬生理反应中的作用。** A类，AMPK-MEK/ERK信号传导对新生小鼠的自噬刺激有反应。Western blotting检测AMPK、MEK和ERK的活化；Beclin 1的表达；以及使用出生后5或120小时从小鼠心脏和肝脏制备的细胞裂解物加工LC3。B类在新生小鼠中，MEK/ERK与AMPK或TSC1相互作用以响应自噬刺激。使用出生后5或120小时小鼠心脏和肝脏的细胞裂解物，进行MEK或ERK联合免疫沉淀，以检测它们与上游调节器或下游效应器的相互作用，以响应自噬或非自噬刺激。图中所示为典型的Western blots(*工作分解结构*) (A类)或免疫共沉淀(*IP（IP）*)斑点(B类)三个独立实验中的每一个。第页-，磷酸-。

**图6。**
**MEK/ERK通过下调mTOR活性上调Beclin 1和自噬。** A类mTOR激活时，MEK/ERK未能上调Beclin 1和自噬。H4IIE细胞转染有或无1m组成活性Akt米测定AICAR、MEK/ERK或mTOR激活、Beclin 1表达和LC3处理。B类转染组分活性Akt的GFP-LC3细胞的荧光显微镜(*caAkt公司*)有或没有自噬刺激。C类，过表达活性Akt增强了以GST-4EBP1为底物的mTORC1活性。这个³²纳入GST-4EBP1的P(*GST-4EBP1-P型*)显示在条形图中。D类，MEK/ERK激活抑制mTORC1活性。用指定的自噬刺激物刺激H4IIE细胞或用组成活性MEK转染(*卡梅克*)或组成活性ERK(*卡埃尔克*)带或不带2μ米PD98059型(*PD公司*)，mTORC1活性测定如*C.E公司*，抑制MEK/ERK使mTORC1和mTORC2均解除关联。H4IIE细胞缺乏氨基酸(*AA公司*)有或没有2μ米测定PD98059、Beclin 1表达、LC3处理以及mTOR与猛禽、Rictor或GβL的结合。F类，抑制mTORC1或mTORC2分别引起Beclin 1和自噬反应的轻度增加，但抑制mTORC1和mTORC2都引起显著的Beclin 1水平和自噬反应。用抗mTOR或抗Raptor或Rictor的siRNA分别或联合转染H4IIE细胞，并通过自噬通量分析测定mTOR效应器激活、Beclin 1表达和LC3处理。Beclin 1水平通过密度扫描定量。*G公司*、GFP-LC3转染H4IIE细胞的荧光显微镜，分别或联合敲除Raptor或Rictor。如图所示A类到*G公司*是典型的西方斑点吗(*工作分解结构*)或免疫共沉淀(*IP（IP）*)三个独立实验中每个实验的斑点或量化数据（平均值±S.D.）。*Ctrl键*，控制；*Kd（千克）*，激酶头；第页-，磷酸-。

**图7。**
**MEK/ERK对mTORC1的抑制是TSC2依赖性的，但对mTORC2的抑制是TS依赖性的。** A类TSC2的消耗增加了mTOR活性，并通过MEK/ERK激活削弱了Beclin 1的上调和LC3的处理。稳定转染具有组成活性的H4IIE细胞(*加利福尼亚州*)用抗TSC2的siRNA瞬时转染MEK或ERK。B类，消耗TSC2不会影响MEK/ERK的激活，但会削弱Beclin 1的上调和LC3对自噬刺激的反应。用抗TSC2的siRNA转染H4IIE细胞，使其缺乏氨基酸(*AA公司*).C类在自噬刺激的反应中，TSC2的耗竭削弱了mTORC1的分解，而不是mTORC2的分解。用抗TSC2的siRNA转染H4IIE细胞并饥饿氨基酸，测定mTOR与猛禽、Rictor或GβL的结合。通过密度扫描定量结合。如图所示A类到C类是典型的西方斑点吗(*工作分解结构*)或免疫共沉淀(*IP（IP）*)三个独立实验中每个实验的斑点或量化数据（平均值±S.D.）。*Ctrl键*，控制；第页-，磷酸化。

**图8。**
**适度增强的Beclin 1引起细胞保护性自噬，但显著增强的Beclin 1引起细胞破坏性自噬。** A类氨基酸饥饿导致早期的保护性自噬和晚期的破坏性自噬）。H4IIE细胞缺乏氨基酸，自噬活性以LC3点表示(*上部面板*)和细胞活力(*下部面板*)在指定的时间点确定。B类，血清饥饿在早期导致保护性自噬，在晚期导致破坏性自吞噬，如交流、雷帕霉素（10μ米)导致保护性自噬，在指定时间确定，如中所述A类，贯穿始终。数据如所示A类,B类、和C类为平均值±S.D(n个= 3) (*,第页< 0.05, **,第页< 0.01).D类，氨基酸饥饿导致MEK/ERK持续高活化，Beclin 1表达日益显著。密度扫描定量Beclin 1表达和ERK激活。电子，血清饥饿导致MEK/ERK持续高活化，Beclin 1表达显著。F类，雷帕霉素导致MEK/ERK持续中度激活，Beclin 1中度增强，如D类。如图所示D类到F类是三个独立实验中每个实验的代表性Western blot和量化数据。*平均值*，自噬空泡；*Baf公司*，巴非霉素A1；第页-，磷酸化。

**图9。**
**非规范MEK/ERK信号通路通过调节Beclin 1调节自噬的图。**基本MEK/ERK活性通过保护mTORC1和mTORC2不被分解来维持其活性，从而维持不能触发自噬反应的基本Beclin 1水平。非规范MEK/ERK模块在自噬刺激时被上游调节器AMPK激活。MEK/ERK的激活通过分解mTORC1和/或mTORC2上调Beclin 1水平，Beclin l水平显著持续升高，导致细胞破坏性自噬，Beclin-1中度升高，导致保护性自噬。MEK/ERK分解mTORC1依赖于TSC，而分解mTORC不依赖于TSC2。虽然ERK与自噬的调节有关，但MEK可以绕过ERK触发自噬反应。

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