跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2009年5月8日；284(19):13153-64.
doi:10.1074/jbc。M809229200。 Epub 2009年3月11日。

Rho激酶的抑制增强突变亨廷顿蛋白的降解

彼得·奥鲍尔 1, Kit Wong先生, 藤山富美, 阿南德·戈斯瓦米, 米萨科·奥库诺, 吉弘基诺, 宫崎骏, Nobuyuki Nukina公司
附属公司

抑制Rho激酶增强突变型亨廷顿蛋白的降解

彼得·奥鲍尔等。 生物化学杂志. .

摘要

亨廷顿病（HD）是一种致命的遗传性神经退行性疾病，由亨廷顿蛋白（htt）中多聚谷氨酰胺（polyQ）延伸的扩张引起。虽然扩张的polyQ的病理学意义已经明确确立，并且为开发HD治疗工具付出了巨大努力，但还没有有效的治疗方法。虽然已经确定了许多能够减少polyQ积累和聚集的分子，包括几种Rho激酶（ROCK）抑制剂，但确定潜在药物的作用机制仍然非常重要。据报道，包括Y-27632在内的ROCK抑制剂可通过ROCK1和蛋白激酶C相关蛋白激酶-2（PRK-2）减少htt和雄激素受体（AR）的聚集。ROCK1的下游效应器肌动蛋白结合因子profilin通过直接相互作用抑制突变的htt聚集，但不抑制AR。我们发现，ROCK抑制剂的抗聚集作用不仅限于突变的htt和AR，而且Y-27632还能够通过扩张的polyQ降低ataxin-3和atrophin-1的聚集。这些结果表明，除了报道的htt和AR的机制外，可能还有其他共同的介质参与不同polyQ蛋白的聚集减少。在这项研究中，我们表明Y-27632不仅通过增强其降解来减少突变htt聚集，而且令人惊讶的是，它能够激活主要的细胞降解途径、蛋白酶体和宏自噬。我们还表明，这种独特的效应是由ROCK1和ROCK2介导的。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
Y-27632减少了不同蛋白质的聚集聚乙烯。将Neuro2a细胞接种到24-（用于ArrayScan分析）或12孔板（用于Western blot分析），转染，4小时后分化并用Y-27632处理。A、 C、E、G、和我,转染Neuro2a细胞包涵体形成的ArrayScan分析编码不同含polyQ蛋白的质粒增加Y-27632的浓度（10、20和50μ米).Y-27632减少了在剂量依赖性方式。酒吧表示相对平均值±三个独立实验的S.D。0 μ米值表示控制条件（0μ米= 1).*,第页< 0.05;**,第页< 0.005;***,第页< 0.001.B、 D、F、H、和J，Western印迹分析表明，Y-27632降低了可溶性和不溶性水平(凝胶顶部)所有受试蛋白的形式与扩展的polyQ在剂量依赖性方式。A类、和B类，tNhtt-60Q，24小时后转染。C类、和D类，AR带99Q，24小时后转染。E类、和F类，截断了ataxin-3（trATX-3）130Q，转染后24小时。G公司和H（H），全长ataxin-3（FL ATX-3）130Q，转染48小时后。我、和J,DRPLA蛋白（阿托品-1）71Q，转染48小时后。
图2。
图2。
ROCK抑制剂减少细胞质和核polyQ聚集150Q和150Q-NLS Neuro2a细胞的毒性。细胞被镀入24-（用于ArrayScan分析）或12孔板（用于蛋白质印迹分析）。打开第二天，细胞分化为5 m米dbcAMP和用1μ诱导米指定不同时间段的ponA如图和下图所示。细胞用4%PFA固定，细胞核用赫斯特33258。A类，ArrayScan生成的合成图像（20×放大）显示150Q Neuro2a中polyQ聚集明显减少细胞在24和48小时后增加20μ米Y-27632。B-D公司，岩石抑制剂Y-27632、H-1152、HA1077和H89显著降低24小时150Q N2a细胞中包裹体形成率(B类)或48小时(C类)诱导和处理后，在150Q-NLS N2a细胞中48小时(D类)诱导和剂量依赖性治疗后。E类将150Q Neuro2a细胞置于12孔组织培养板中，第二天用5 m的细胞分化米dbcAMP、，用1μ诱导米ponA，并用Y-27632或H-1152处理。24小时后收集细胞并使用抗GFP和抗β-微管蛋白抗体。Western blot分析显示通过Y-27632和H-1152治疗呈剂量依赖性。F类，150Q时细胞死亡和150Q-NLS Neuro2a细胞。将细胞接种到24孔组织培养中第二天，对细胞进行分化、诱导和用20μ米Y-27632。3天后，PI和Hoechst 33258将最终浓度为5μg/ml的细胞添加到培养基中在进行ArrayScan分析之前，在37°C下培养10分钟。Y-27632在150Q和150Q-NLS中分别使PI阳性细胞减少31%和36%Neuro2a细胞(n个=3）与未处理细胞相比。酒吧在里面B-D公司表示四个相对平均值±S.D不同的实验。控制值1表示控制电池中未添加ROCK抑制剂的条件。*,第页< 0.05;**,第页< 0.005;***,第页< 0.001;第页<0.05，通过非参数Mann-Whitney检验方差分析得出的显著数据。
图3。
图3。
Y-27632通过膨胀polyQ降低htt水平影响转录。16Q和150Q Neuro2a细胞被镀入12孔板。第二天，对细胞进行分化、诱导和用20μ米Y-27632适用于不同时间段如图所示。收集细胞，并对总RNA进行定量制备用于免疫印迹分析的TaqMan RT-PCR或蛋白质。A、，代表性Western blot显示16Q和150Q的htt蛋白水平Neuro2a细胞在诱导和治疗后的不同时间点使用抗GFP和抗β-微管蛋白抗体。B类，量化代表可溶性形式的抗GFP免疫印迹的带强度16Q蛋白质(左侧面板)和150Q Neuro2a细胞(正确的面板)收集自三个独立实验。16Q级别未经处理的和Y-27632处理的蛋白质没有显著差异细胞。Y-27632显著降低了可溶性150Q水平诱导后12h开始治疗。数据标准化使用β-微管蛋白。C类，定量TaqMan RT-PCR分析第16季度-(左侧面板)和150Q-EGFP(右侧面板)mRNA水平在20μ米Y-27632型在三个独立实验中的任何时间点进行治疗。数据为使用肌动蛋白mRNA水平进行标准化。中的值B类和C类是平均值±S.D。*,第页< 0.05;**,第页< 0.005.
图4。
图4。
Y-27632增强了膨胀聚Q对htt的降解。第16季度，60Q和150Q Neuro2a细胞被镀入12孔板，1天后用dbcAMP分化，用ponA诱导。16Q和60Q中24小时后在150Q Neuro2a细胞中，htt-polyQ的表达被去除ponA，用20μ米Y-27632用于图中所示的时间段。收集并处理细胞使用EM48、抗GFP、抗β-微管蛋白或抗泛素抗体。A类、Western blot和FTA分析60Q Neuro2a细胞的追踪实验显示，可溶性蛋白的降解增强60Q（抗GFP）和减少不溶性蛋白质的积累（EM48；FTA）。这个顶部面板显示60Q和16Q Neuro2a细胞追踪实验的实验设计。B、，Western blot的密度定量证实用Y-27632与未处理的细胞相比。C、，泛素的定量免疫反应显示多泛素化蛋白在Y-27632处理的细胞与未处理的细胞形成对比。D、，蛋白质印迹150Q Neuro2a细胞系追踪实验的FTA分析显示减少不溶性蛋白质的积累（抗GFP、凝胶顶部蛋白质印迹；EM48，FTA）通过Y-27632处理。这个顶部面板显示150Q Neuro2a中追逐实验的实验设计细胞。E类，可溶150Q水平的密度定量（抗GFP，Western blot）显示治疗组与对照组之间无显著差异和未经处理的细胞。F类，SDS不溶物的定量（聚合）150Q（EM48，FTA）的不溶物显著增加Y-27632处理细胞的蛋白质清除率。G公司，Western blot分析在16Q Neuro2a细胞系中进行追踪实验。H（H），密度测定量化结果显示，处理后和未经处理的细胞。使用β-微管蛋白对所有数据进行标准化。全部呈现数值为三个独立实验的平均值±S.D。*,第页< 0.05;**,第页< 0.005.
图5。
图5。
抑制UPS和/或自噬可改善Y-27632。 A类将150Q Neuro2a细胞接种于12孔板中。第二天，对细胞进行分化、诱导，并用20μ的不同组合米Y-27632，10μ米MG-132和10 m米3毫安。24小时后收集细胞，Western使用抗GFP、抗β-微管蛋白和EM48抗体。B类，150Q波段强度的量化Western blot显示UPS的抑制作用而非自噬的抑制作用改善了Y-27632对可溶性蛋白的影响。C类,FTA的密度定量显示，UPS和为了消除Y-27632对不溶性形式150Q的积累。抑制每个降解途径仅部分改善了Y-27632的作用。使用β-微管蛋白对密度测定数据进行标准化。D类，150个季度如上所述处理Neuro2a细胞并进行ArrayScan处理分析。ArrayScan生成的复合图像显示了降解途径阻断Y-27632介导的polyQ聚集。E类,ArrayScan分析量化支持FTA分析获得的数据。F类，用10 ng/ml多西环素处理MEF 5-7细胞5天击倒Atg5并抑制自噬。演示UPS抑制10μ米MG-132型(MG公司)，细胞被转染泛素化dsRED(Ub-dsRED)或mRFP，用MG治疗1天。使用抗Atg5抗体的Western blot分析显示几乎完全缺失强力霉素处理细胞中的Atg5蛋白（与Atg12复合）。抗-LC3免疫印迹显示这些细胞缺乏自噬活性。细胞内多泛素化蛋白和Ub-dsRED水平升高用MG治疗，而mRFP水平保持不变。G公司，未经处理将多西环素处理的MEF 5-7细胞接种到6孔板中，然后第天转染tNhtt-150Q-EGFP。然后用20μ米Y-27632或0.2μ米雷帕霉素和/或10μ米MG-132持续24小时。阵列扫描分析证实，只有同时抑制UPS和自噬抵消了Y-27632（在用MG-132处理的dox+/Atg5细胞中(MG公司)). 雷帕霉素mTOR抑制剂激活自噬并用作对照。酒吧表示三个独立的相对平均值±S.D实验。控制值1表示没有Y-27632号(B、 C类、和E类)或不含Y-27632和雷帕霉素处理(G公司).*,第页< 0.05;**,第页< 0.005;***,第页< 0.001.
图6。
图6。
Y-27632增加UPS和自噬活性。 A类，野生将Neuro2a型细胞培养成12孔板。第二天，用mRFP或Ub-dsRED转染细胞，4h后分化用20μ米Y-27632和/或10μ米MG-132用于另外24小时，用抗RFP和抗β-微管蛋白。B类，Western blot定量证实Y-27632显著降低Ub-dsRED水平，但不降低mRFP水平。C类和D、，将150Q、60Q和16Q Neuro2a细胞接种到24孔板，并以类似的方式转染A类.4小时后，对细胞进行分化、诱导，并用药物。ArrayScan分析显示Ub-dsRED阳性的百分比单元格(C类)和细胞中的平均红色荧光(D类)Y-27632处理细胞减少。Y-27632对mRFP无影响荧光。E类，野生型Neuro2a细胞被镀入6孔平板，1天后，细胞未经处理或用20μ米Y-27632处理24小时，并进行蛋白质印迹分析LC3转换。F类，密度定量证实Y-27632显著增加了LC3的转化率，表示增加了处理细胞中的自噬活性。酒吧在里面B类和F类表示三个值的相对平均值±S.D独立实验。控制值1表示控制未经Y-27632治疗的情况。酒吧在里面C类和D类表示三个独立值的平均值±S.D实验。*,第页< 0.05;**,第页< 0.005;***,第页< 0.001.
图7。
图7。
敲除ROCK1和/或ROCK2可减少polyQ聚集并激活150Q Neuro2a细胞的主要降解途径。150Q Neuro2a细胞将其置于12孔板中，1天后转染不同的pSil载体、ROCK1（R2）和ROCK2（R2）shRNA（+mRFP作为转染标记物）。4小时后，细胞分化48小时，然后诱导，最终用20μ米Y-27632。细胞是24小时后进行Western blot或ArrayScan分析。A类,使用抗GFP、抗ROCK1和抗ROCK2抗体的免疫印迹显示降低岩石沉默后150Q的水平（尤其是可溶性形式）。生命周期3只有在两种岩石都不存在的情况下，转换才能得到加强。B类,ArrayScan分析显示150Q夹杂物的形成显著减少通过火箭静音。Y-27632治疗对所有ROCK均有额外影响击倒条件。C类，量化LC3印迹显示，当两种ROCK亚型均为被击倒。D类和E类，ROCKs击倒是在类似于上述方式。2天后，细胞未经处理或用10μ米MG-132（用于分析控制）并培养用于18 h。然后制备细胞裂解物在体外UPS活动分析。敲除ROCK1可激活类胰蛋白酶活性，而ROCK2似乎对UPS的PGPH活动负责。y轴表示460 nm处的吸光度。酒吧在里面B、 D类、和E类表示平均值±S.D.，以及钢筋在里面C类表示三个值的相对平均值±S.D独立实验。1英寸的控制值C类代表用空pSil载体转染对照细胞。*,第页< 0.05;**,第页< 0.005;***,第页< 0.001.
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Myers，R.H.（2004）NeuroRX，1 255-262-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 亨廷顿病协作研究小组（1993）细胞72 971-983-公共医学
    1. Orr，H.T.和Zoghbi，H.Y.（2007）《年度报告》。神经科学版。30 575-621-公共医学
    1. Leavitt，B.R.、van Raamsdonk，J.M.、Shehadeh，J.、Fernandes，H.、Murphy，Z.、Graham，R.K.、Wellington，C.L.、Raymond，L.A.和Hayden，M.R.（2006）《神经化学杂志》。96 1121-1129-公共医学
    1. Davies，S.W.、Turmaine，M.、Cozens，B.A.、DiFiglia，M.，Sharp，A.H.、Ross，C.A.、Scherzinger，E.、Wanker，E.E.、Mangiarini，L.和Bates，G.P.（1997）Cell 90 537-548-公共医学

出版物类型

MeSH术语

物质