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.2005年11月21日；171(4):603-14.
doi:10.1083/jcb.200507002。 Epub 2005年11月14日。

p62/SQSTM1形成自噬降解的蛋白质聚集体，对亨廷顿蛋白诱导的细胞死亡具有保护作用

盖尔·比约克 1, 特隆·拉马克, 安德烈亚斯·布雷奇, 海蒂·欧琴, 玛丽亚·佩兰德, Aud Overvatn公司, 哈拉尔德·斯坦马克, 泰耶·约翰森
附属机构

p62/SQSTM1形成自噬降解的蛋白质聚集体，对亨廷顿蛋白诱导的细胞死亡具有保护作用

盖尔·比约克等。 J细胞生物学. .

摘要

泛素化蛋白聚集体的自噬降解对细胞生存很重要，但自噬机制如何识别这种聚集体尚不清楚。在这项研究中，我们报告了多泛素结合蛋白p62/SQSTM1的聚合产生的蛋白质体，要么游离于细胞质和细胞核中，要么出现在自噬体和溶酶体结构中。抑制自噬导致p62小体的大小和数量以及p62蛋白水平的增加。自噬标记轻链3（LC3）与p62小体共定位，与p62共免疫沉淀，表明这两种蛋白质参与相同的复合物。在饥饿条件下，p62的缺失抑制LC3向自噬体的募集。引人注目的是，p62和LC3在突变亨廷顿蛋白聚集体周围形成了一个外壳。p62蛋白水平的降低或对p62功能的干扰显著增加了突变体亨廷顿蛋白表达诱导的细胞死亡。我们认为p62可能通过LC3参与将多泛素化蛋白聚集体连接到自噬机制。

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数字

图1。
图1。
HeLa细胞细胞质中的p62小体是含泛素的蛋白质聚集体。（A） HeLa细胞固定后进行p62染色。p62在>200个细胞中的分布模式不同，表现为胞质小体、胞质大体和密集体、细胞核和细胞质染色相等以及细胞核富集。显示了各组中的细胞百分比。（B） GFP-p62在HeLa细胞中的表达水平（稳定表达GFP-p62S–GFP-p六十二）与内源性p62在母细胞HeLa中的水平相比。（C） 稳定表达GFP-p62的细胞显示与内源性p62类似的GFP-标记p62的细胞质间断定位。活细胞的视频显微镜显示，小而微弱的身体（细箭头）显示出定向迁移，而大多数较大而强烈的身体（粗箭头）则不迁移（视频1和2，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200507002/DC1). 此处显示视频1中的静态图像。（D） 含有内源性p62或瞬时或稳定转染的GFP-p62的体都含有多泛素。将HeLa细胞固定，分别用p62和多泛素（克隆FK1）单克隆抗体直接偶联AlexaFluor555（红色）和AlexaFluxor488（绿色）染色。表达GFP-p62的细胞只被染色为多泛素（红色）。棒材，20μm。
图2。
图2。
p62形成细胞质体需要PB1和UBA结构域。（A） 所示缺失结构是COOH末端与GFP融合，并在NIH3T3成纤维细胞中表达。星号分别表示PB1（D69A）和UBA（I431A）域中的点突变。（B） 用指示的myc标记的p62构建物瞬时转染S–GFP-p62细胞，固定并染色myc标记。棒材，20μm。
图3。
图3。
p62小体既可以作为无膜蛋白聚集体，也可以作为膜限制的自噬体和溶酶体结构。（A） 含有内源性p62或瞬时表达GFP-p62的小体相对于EEA1阳性早期内体的定位。用AlexaFluor488直接标记的p62抗体将内源性p62染成绿色，用AlexaFuor555直接标记的EEA1单克隆抗体将EEA1染成红色。或者，瞬时表达的GFP-p62在HeLa细胞中表达，EEA1用EEA1单克隆抗体染色为红色（底部）。方框区域以更高的放大率显示在右侧。（B） 在稳定表达GFP-p62的HeLa细胞中GFP-p82和CD63的染色（用单克隆抗体染色为红色）。（C） 用GFP pAb（10-nm金颗粒，箭头）和单克隆CD63（15-nm金颗粒、箭头）染色的S–GFP-p62的免疫电子显微照片。（D） 从LysoTracker阳性酸性细胞器中快速洗涤剂提取GFP-p62。用LysoTracker标记瞬时表达GFP-p62的HeLa细胞60分钟。在添加1%Triton X-100后，以15秒的时间间隔对洗涤剂提取液进行成像。盒状区域显示在底部两幅图像中，在提取洗涤剂之前和之后以较高的放大倍数显示。棒材（A、B和D），20μm。
图4。
图4。
p62既存在于自噬体中，也存在于细胞溶质聚集体/固定体中。（A） GFP-p62的免疫电镜。用兔抗GFP（Abcam）标记S-GFP-p62细胞，然后用蛋白A-金（15nm）标记。我们观察到无膜细胞溶质结构和固位体（箭头所示）以及内体（Endo）中的标记。（B） 用10μM PSI处理5 h的HeLa细胞的相关免疫荧光/EM显示典型的隔离体。插图显示了两个标记为1的隔离体放大图。（C） 含有p62的自噬体的代表性图像。转染GFP-p62的HeLa细胞被免疫金标记为A。注意GFP-阳性物质周围的池样膜（箭头）。箭头表示融合的内体。
图5。
图5。
p62小体被自噬降解。（A） 脉冲相位标记法对p62降解的比较35环己酰亚胺（CHX）处理后的S-蛋氨酸和免疫印迹。HeLa细胞经脉冲处理35S-蛋氨酸，并在非放射性介质中培养指定时间。免疫纯化后，用放射自显影法测定放射性p62的含量，用同一膜的免疫印迹法测定p62的总量。通过免疫印迹法测定不同时间10μg/ml环己酰亚胺处理后细胞总裂解物中的p62水平（底部）。（B） p62和LC3-II水平随着自噬活性的变化而变化。HeLa或S–GFP-p62细胞未经处理或添加雷帕霉素（10μg/ml）或巴非霉素A1（Baf.A1；10μg/ml）18小时。使用LC3、p62和肌动蛋白抗体依次检测免疫印迹。（C和D）定位于细胞质体的p62的数量随着自噬的抑制而增加。HeLa细胞或S–GFP-p62 HeLa电池未经处理或添加巴非霉素A1 18小时，固定细胞，使用p62 mAb（C）将p62染成红色或直接成像（D）。使用Draq5 DNA染色观察细胞核。处理细胞和未处理对照细胞的成像设置相同。（E） 大多数S–GFP-p62胞质体被识别瞬时表达LC3的抗体染色。用myc-LC3瞬时转染S–GFP-p62细胞。使用抗Myc标记单克隆抗体将Myc-LC3染成红色。方框区域表示以更高的放大率显示在左侧的单元格部分。棒材，5μm。
图6。
图6。
p62是HeLa细胞中GFP-LC3阳性间断结构形成所必需的。（A） 单独转染GFP-LC3的HeLa细胞，或与抗p62、HA-p62或HA-p62 D69A的siRNA共转染HeLa的细胞，要么留在正常培养基中，要么饥饿氨基酸1小时。固定细胞，用p62单克隆抗体对p62进行染色。对每种情况下随机选择的200多个细胞进行GFP-LC3细胞质模式评分，无论是弥散型还是间断型。右侧显示了具有点状定位的GFP-LC3阳性细胞的频率。（B） 内源性p62以及共表达myc标记的野生型p62或p62的UBA缺失突变，与HeLa细胞提取物中的GFP-LC3免疫沉淀。共转染指定的结构后，从总细胞提取物中免疫沉淀GFP或GFP-LC3。如图所示，细胞培养物要么未经处理，要么缺乏氨基酸1小时。使用p62单克隆抗体检测铜化内源性或外源性表达myc标记的p62结构体。棒材，20μm。
图7。
图7。
p62在亨廷顿蛋白聚集体周围形成一个外壳。（A） 瞬时表达标记NH的HeLa细胞2-亨廷顿蛋白的末端片段（氨基酸1–171），包含68聚谷氨酰胺扩展，Flag–N-HttQ68。48小时后，固定细胞，并使用Flag单克隆抗体将Flag–N-HttQ68染成绿色。使用p62 pAb将内源性p62染成红色。（B） 内源性p62在聚集的GFP–N-HttQ68周围形成外壳。转染48小时后固定瞬时转染的HeLa细胞，并使用p62 mAb（红色）检测内源性p62。（C和D）GFP–N-HttQ68周围的p62外壳独立于抗体的使用进行检测。（C） 将GFP–N-HttQ68和DsRed标记的p62共转染到HeLa细胞中，表达48小时后获得活细胞图像。左侧面板显示了具有代表性的GFP–N-HttQ68和DsRed-p62双正结构的一个共焦平面，右侧面板显示了平面的Z堆叠，侧面和顶部有骨料的侧视图。N、 核心。使用Draq5检测（A–C）Nuclei。（D） 将GFP–N-HttQ68和tdTomato标记的p62共转染到HeLa细胞中，表达24小时后获得活细胞图像。（E） 瞬时表达的Flag–N-HttQ68和myc-LC3在GFP-p62阳性结构中共定位。转染后48 h固定S–GFP-p62细胞，Flag–N-HttQ68用Flag标记单克隆抗体染色为红色，myc-LC3用鸡myc标记单克隆疫苗染色为远红色（蓝色）（上图）。底部面板显示了GFP–N-HttQ68聚集体的活细胞图像，该聚集体被一个包含tdTomato-LC3的外壳包围。棒材，5μm。
图8。
图8。
干扰p62蛋白水平或功能会增加突变亨廷顿蛋白诱导的细胞死亡。（A） 核Draq5染色显示GFP阳性细胞为活细胞或凋亡细胞。在表达48小时后，GFP阳性细胞以正常的核外观（开放箭头）附着在表面，并被记为活细胞，而圆形、部分脱落的细胞核浓缩或碎裂的细胞（箭头）被记为死细胞。在随机选择的显微镜视图中，对200多个GFP阳性细胞进行了评分。棒材，20μm。（B） 共表达p62反义结构体或缺失UBA结构域的p62缺失结构体对N-HttQ68诱导HeLa和SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞死亡的影响。
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