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.2005年11月16日；24(22):3859-68.
doi:10.1038/sj.emboj.7600845。 Epub 2005年10月27日。

TRAF6介导的泛素化调节p75受体相互作用物NRIF的核转位

谢吉亚·吉萨 1, 拉贾帕·肯查帕, 玛丽·W·伍腾, 布鲁斯·D·卡特
附属公司

TRAF6介导的泛素化调节p75受体相互作用物NRIF的核转位

谢吉亚·吉萨等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

TRAF6是一种E3泛素连接酶，介导肿瘤坏死因子和Toll样受体超家族成员的信号传导，包括p75神经营养素受体。最近，TRAF6被证明与另一个p75细胞质相互作用物NRIF结合，并促进其核定位。在这里，我们证明NRIF是TRAF6介导的K63多泛素化的底物，并且这种修饰对其核转位是必要的。p75的激活导致NRIF多泛素化，与TRAF6相关，以及核定位。在体外和培养细胞中，NRIF被TRAF6多泛素化，这被NRIF氨基末端的K19突变所消除。K19R突变NRIF表现出减少TRAF6关联和神经营养素依赖性核定位。在traf6-/-小鼠的神经元中，NRIF未能在p75激活时进入细胞核，并且traf6-//-大脑中的多泛素化和核定位减弱。最后，与野生型NRIF不同，K19R NRIF未能重建NRIF-/-神经元中p75介导的凋亡。这些结果揭示了p75信号传导的独特机制以及K63连接的泛素链的新作用。

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数字

图1
图1
p75受体的激活诱导NRIF的多泛素化。用50 ng/mlΔ9/13突变NGF处理PC12细胞(A类)，100 ng/ml BDNF(B类)或20 ng/ml NGF(C类)对于指定的时间；然后在SDS裂解缓冲液中对细胞进行裂解，通过NRIF的IP测定NRIF泛素化，然后用抗泛素免疫印迹法进行免疫印迹（上面板）。通过用NRIF抗体探测印迹来验证相同印迹上NRIF的IP（下面板）。
图2
图2
p75受体的激活增加了NRIF与TRAF6和p62的关联。用50 ng/mlΔ9/13突变NGF处理PC12细胞0、5和15 min，然后使用Triton裂解缓冲液对细胞进行裂解。NRIF公司(A类)，第62页(B类)和TRAF6(C类)免疫沉淀，并对沉淀进行NRIF、p62或TRAF6蛋白印迹。(D类)同样的细胞裂解物（50μg）也进行NRIF、p62和TRAF6的免疫印迹以确认表达。
图3
图3
NRIF通过E3泛素连接酶TRAF6进行多泛素化。将HEK 293细胞与Flag NRIF、Flag-TRAF6或HA泛素共转染，然后在SDS裂解缓冲液中裂解，用抗NRIF免疫沉淀裂解物，然后用HA表位抗体进行免疫印迹以检测泛素偶联物（上图），或用NRIF抗体验证NRIF的IP（中图）。用抗NRIF和抗TRAF6免疫印迹相同的细胞裂解物（50μg），以验证NRIF与TRAF6的表达（下面板）。
图4
图4
NRIF多泛素化在肿瘤坏死因子受体相关分子6使鼠标无效。(A类)WT和traf公司6KO小鼠脑匀浆于SDS裂解缓冲液中，用抗NRIF免疫沉淀，用抗泛素免疫印迹法（上面板）或抗NRIF免疫印迹（下面板）。(B类)WT和肿瘤坏死因子受体相关分子6在Triton裂解缓冲液中均质KO小鼠大脑，免疫沉淀NRIF并用NRIF、TRAF6或p62抗血清进行Western blot，以检查它们的相互作用（上部面板）。同样的脑裂解物也用抗NRIF、TRAF6和p62进行蛋白质印迹，以确认这些蛋白质的表达（下面板）。
图5
图5
NRIF是K63多泛素化的。(A类)用Flag-NRIF和HA标记的WT泛素、K29R、K48R或K63R泛素点突变体转染HEK细胞。然后在SDS裂解缓冲液中裂解细胞，用NRIF抗体免疫沉淀等量的裂解物，并用抗Flag免疫印迹检测NRIF（上面板）或抗泛素（中面板）。用抗HA蛋白对裂解产物进行Western blot，以检测HA标记泛素突变体的表达（下表）。(B类)用HA标记的WT、K29R、K48R或K63R泛素突变体转染PC12细胞。用Δ9/13 NGF突变体处理细胞5 min，并用SDS裂解缓冲液进行裂解。免疫沉淀NRIF并用抗-HA蛋白印迹检测NRIF的泛素化（上面板）或抗-NRIF蛋白印迹（中面板），并用抗HA蛋白印迹裂解产物（下面板）。(C类)用Flag NRIF转染HEK 293细胞，细胞裂解，然后NRIF免疫沉淀在体外泛素化检测是在存在或不存在WT泛素的情况下进行的，WT是一种只有K63可用于形成泛素链（K63 Ub）的突变体，或K63R突变体泛素与E1、UbcH7（E2）和TRAF6（E3）一起。随后在结合缓冲液中向上述复合物中添加5μg GST-UBA；然后清洗NRIF珠并进行泛素、NRIF或GST的Western blot分析（如图所示）。请注意，GST-UBA仅与泛素化形式的NRIF一起沉淀(D类)用Flag-NRIF、myc-tagged WT p62、缺乏N末端229残基（p62-ΔN-term）的p62结构体或缺乏UBA结构域（p62/ΔUBA）的p62-突变株以及Flag-TRAF6或HA-Ub转染HEK 293细胞。然后在Triton裂解缓冲液中裂解细胞，进行NRIF免疫沉淀，并用NRIF、TRAF6或myc-tag抗体对沉淀进行免疫印迹，如图所示（上部面板）。用抗NRIF、抗TRAF6或抗myc对裂解物（50μg）进行蛋白质印迹分析，以验证NRIF、TRAF6和p62的表达水平（下图）。
图6
图6
赖氨酸19是NRIF中的一个多泛素化受体位点，是p75受体介导的NRIF核转位所必需的。(A类)用WT Flag-NRIF或其点突变K19R、Flag-TRAF6和HA标记泛素转染HEK 293细胞。然后用SDS裂解缓冲液裂解细胞，并通过用抗NRIF免疫沉淀裂解物和用抗泛素（上图）或抗NRIF（下图）进行蛋白质印迹来确定泛素化的程度。(B类)以（A）转染的HEK 293细胞也用Triton裂解缓冲液进行裂解，NRIF免疫沉淀，沉淀用NRIF或TRAF6抗血清进行免疫印迹。TRAF6的表达通过裂解物的Western blotting得到确认（下表）。(C类)用Flag-NRIF或K19R-NRIF以及myc-p75转染HEK 293细胞。然后用50 ng/ml NGF处理细胞5 min，进行分馏，用NRIF抗体免疫沉淀细胞溶质和核部分，并用NRIF-抗体对沉淀进行Western blot分析。对细胞核和细胞质部分进行CRM1和肌动蛋白免疫印迹，以确认细胞核和细胞溶质部分分离的纯度（上面板）。使用NRIF或Myc抗血清对总裂解产物进行Western blotting，以分别确认NRIF和p75的表达（下部面板）。
图7
图7
K63多泛素化NRIF被转运到细胞核。(A类)用Flag-NRIF、myc标记的p75以及HA-K48R或K63R泛素突变体转染HEK 293细胞。然后用50 ng/ml的NGF处理细胞5分钟，用NRIF抗体免疫沉淀细胞溶质和核部分，用NRIF抗体免疫印迹。还对细胞溶质和核部分进行CRM1和肌动蛋白的免疫印迹，以验证部分的纯度（左侧面板）。使用抗NRIF、p75或HA对总裂解产物进行Western blot，以确认NRIF，p75和泛素结构体的表达（右侧面板）。(B类)用HA标记的K48R或K63R泛素突变体转染PC12细胞，然后用Δ9/13 NGF（50 ng/ml）刺激5 min，分离细胞溶质和核部分。从这些组分中免疫沉淀NRIF，并用抗NRIF免疫印迹。细胞溶质和核组分也免疫印迹CRM1和肌动蛋白，以验证组分的纯度（左侧面板）。NRIF和HA标记泛素突变体的表达通过Western blot和抗NRIF及抗HA进行验证（右面板）。
图8
图8
TRAF6对于NRIF核定位是必要的体内.从出生后第2天开始分离整个大脑肿瘤坏死因子受体相关分子6WT和KO小鼠，在RIPA缓冲液中均质，然后NRIF免疫沉淀，沉淀用NRIF抗体进行免疫印迹（上图）。从这些组织中分离细胞核并进行NRIF免疫沉淀。然后使用NRIF抗体对沉淀物进行蛋白质印迹（中间面板）。注意NRIF在肿瘤坏死因子受体相关分子6相对于WT的−/−核。WT和KO小鼠大脑的核提取物（NE）和核后上清液（PNS）接受HDAC1 Western blot分析，以确认核的分离，并作为核提取物的负荷控制（下面板）。
图9
图9
p75介导的NRIF核转位需要TRAF6。交感神经元肿瘤坏死因子受体相关分子6+/+和−/−小鼠直接在成熟NGF（20 ng/ml）或原NGF（5 ng/ml）中培养20小时，然后固定神经元，并使用Alexa 488偶联的第二抗体（绿色）显示的亲和纯化的NRIF抗体检测NRIF。用碘化丙啶（红色）标记细胞核。然后用共焦显微镜对神经元成像。注意在proNGF存在的情况下NRIF和核染色的重叠肿瘤坏死因子受体相关分子6+/+神经元（橙色），但不在肿瘤坏死因子受体相关分子6−/−神经元。插图显示单个神经元增大。比例尺50μm。
图10
图10
p75介导的凋亡可以在nrif公司WT NRIF表达的−/−交感神经元，而非K19R NRIFnrif公司分离−/−小鼠，用GFP、GFP-NRIF或GFP-K19R-NRIF电穿孔，并在20 ng/ml NGF中培养2天。然后去除NGF，将神经元切换到含有抗NGF和12.5mM KCl的培养基中以促进存活，并用（黑条）或不用（空条）100ng/ml BDNF处理48小时。然后固定细胞，通过DAPI染色评估GFP阳性神经元的凋亡细胞核。所示为平均值±标准误差(n个=3;*P（P）<0.008).
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参考文献

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