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.2005年4月；25(7):2558-72.
doi:10.1128/MCB.25.72558-2572.2005。

mTOR下游的不同信号事件协同调节氨基酸和胰岛素对启动因子4E-结合蛋白的影响

王学敏 1, 安妮·贝格内特, 村上春美, 山中信雅, 克里斯托弗·普劳德
附属公司

mTOR下游的不同信号事件协同调节氨基酸和胰岛素对启动因子4E-结合蛋白的影响

王学敏等。 分子细胞生物学. 2005年4月.

摘要

雷帕霉素（mTOR）通过哺乳动物靶点发出信号，控制细胞大小和生长以及其他功能，是移植物排斥、某些癌症和以细胞或组织生长不当为特征的疾病的潜在治疗靶点。mTOR信号被激素或生长因子和氨基酸积极调节。mTOR信号调节几种蛋白质的磷酸化，最具特征的是控制mRNA翻译的蛋白质。真核起始因子4E-结合蛋白1（4E-BP1）在多个位点发生磷酸化。在这里，我们发现氨基酸通过RAIP基序以雷帕霉素不敏感的方式调节4E-BP1中的N-末端磷酸化位点。一些标准表明，这反映了mTOR的雷帕霉素敏感性输出。相反，C-末端位点Ser64/65的胰岛素刺激磷酸化通常对雷帕霉素敏感，mTOR信号的另一个特征明确的靶点S6K1的磷酸化也是如此。我们的数据表明，mTOR不太可能直接磷酸化4E-BP1中的Thr69/70。虽然4E-BP1和S6K1结合了mTOR伙伴猛禽，但我们的数据表明，mTOR到4E-BPl和S6K1.的输出是不同的。在细胞中，4E-BP1的有效磷酸化需要它能够与eIF4E结合，而体外mTOR对4E-BPl的磷酸化则没有这种偏好。这些数据对于理解mTOR下游的信号传导以及开发新的策略来削弱mTOR信号传导具有重要意义。

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数字

图1。
图1。
氨基酸戒断和雷帕霉素对4E-BP1磷酸化有明显影响。（A） 该图描述了4E-BP1、eIF4E结合位点和此处研究的磷酸化位点中的调节性RAIP和TOS基序（显示了人类和啮齿动物之间的编号差异）。（B和C）HEK293（B）或CHO（C）细胞首先通宵饥饿血清，然后，如有指示，也饥饿氨基酸（−AA）1小时或用雷帕霉素和/或胰岛素治疗。在某些情况下（−AA/+AA），氨基酸被重新提供给被剥夺了60分钟的细胞。时间以分钟为单位。用所示4E-BP1（总BP1）抗血清、4E-BPl或S6K1中的特定磷酸化位点（多个箭头表示几个不同磷酸化物种已被分解）对细胞裂解物样品进行Western blotting分析或仅当S6K1在Thr389或Thr421和Ser424处磷酸化时才识别S6K1的抗体（这两条带对应于S6K1中的70-kDa和85-kDa物种）。（D） CHO细胞隔夜缺乏血清，如有指示，也缺乏氨基酸（显示时间为-AA）或再次补充氨基酸（显示次数为-AA/+AA）。在细胞溶解之前，添加雷帕霉素40分钟。（E） 如上所述，CHO细胞缺乏血清，在某些情况下也缺乏氨基酸（−AA），或再次补充氨基酸（-AA/+AA），在一些情况下（+）用胰岛素治疗。使用识别Erk1和Erk2磷酸化活性形式的抗（P）PKB（Thr308）或抗（P。
图2。
图2。
仓鼠4E-BP1.的序列和调控。（A） 大鼠氨基酸序列(褐家鼠[Rn]）和中国仓鼠(灰色圆线虫[Cg]）4E-BP1和大鼠4E-BP2（C）。RAIP和TOS基序下划线，eIF4E结合基序斜体化，4E-BP1中的磷酸化位点或4E-BP2中的相应残基以粗体显示。仓鼠4E-BP1中与大鼠蛋白质中不同的残留物也以粗体显示，并以箭头突出显示。（B） 用仓鼠4E-BP1或人4E-BPl的载体转染HEK293细胞，这两种载体均带有N末端his/myc标记，或带有C末端标记的大鼠4E-BP的载体。在隔夜血清饥饿后，用雷帕霉素和胰岛素处理细胞。使用抗myc（总4E-BP1）或指示的磷酸特异性抗血清，通过SDS-PAGE和Western blotting对裂解产物样品进行分析。（C） 按照指示处理CHO细胞（使用其他面板使用的符号），并对裂解产物样品进行亲和层析7GTP-Sepharose，然后使用所示抗血清通过SDS-PAGE和Western blotting分析结合材料。eIF4E的信号用作加载控制。
图3。
图3。
PI3-激酶抑制剂或PTEN对4E-BP1中特定位点磷酸化的影响。（A和B）CHO细胞缺乏血清，在某些情况下（−AA）也缺乏氨基酸（60分钟）。然后将氨基酸添加回一些平板中30分钟（−AA/+AA）。如有指示，用LY294002或沃特曼（WM）处理细胞（按指示的浓度，持续40分钟），如有指示则用胰岛素（Ins）处理。使用所示4E-BP1抗血清或4E-BPl（A）或（P）PKB（Thr308）或S6K1（B）中的特定磷酸化位点，通过Western blotting对裂解产物样品进行分析，如所示。（C） 用胰岛素或PI 3-激酶抑制剂处理血清饥饿的HEK293细胞，如CHO细胞的A组和B组所述。（D） 用编码大鼠4E-BP1的载体以及野生型PTEN、指示的PTEN点突变体或空载体（pcDNA）转染HEK293细胞。通过SDS-PAGE和Western blotting分析裂解物样品（20μg蛋白质），使用4E-BP1抗血清、4E-BPl、PTEN或磷酸化PKB中的特定位点，如图所示。
图4。
图4。
调节mTOR信号传导的蛋白质对4E-BP1磷酸化的影响。（A） 用大鼠4E-BP1和TSC1、TSC2、TSC1和TSC2的SATA突变体载体或相应的空载体转染HEK293细胞。细胞隔夜无血清，然后用胰岛素（Ins）处理。用SDS-PAGE和Western blotting对细胞裂解物样品进行分析，并使用所示抗血清（使用抗FLAG检测过度表达的TSC1和TSC2）。（B） 用大鼠4E-BP1载体和Rheb或相应的空载体转染HEK293细胞。细胞隔夜缺乏血清（S-St），缺乏氨基酸（−AA），或转移到用于氨基酸饥饿但含有氨基酸（+AA）的培养基中。用所示抗血清分析细胞裂解液样品（使用抗myc检测4E-BP1和Rheb）。S6（P）表示当rpS6在Ser235被磷酸化时检测rpS6的抗体。
图5：。
图5：。
损害mTOR信号的方法。（A） 用针对mTOR（mTOR-1）的60 nM siRNA转染HeLa细胞或进行模拟转染。首次转染48小时后，细胞被血清饥饿4小时，在某些情况下，随后用胰岛素（Ins）处理（100 nM，30分钟）。然后通过SDS-PAGE和Western blotting分析裂解产物中的肌动蛋白（标准化对照）、mTOR、S6K1、总4E-BP1或4E-BPl中指示的磷酸化位点。（B） 用编码野生型或激酶头FLAG-mTOR的载体以及大鼠4E-BP1转染HEK293细胞。24小时后，细胞在一夜之间缺乏血清，在某些情况下，然后用胰岛素（100nM，30分钟）处理。如图A所述分析裂解物（但此处不分析肌动蛋白水平）。（C） 靶向ES细胞（53）用HTNC或（作为阴性对照）磷酸盐缓冲液（PBS）处理。在指定的时间后，制备裂解产物，并使用指定的抗血清通过SDS-PAGE和Western blotting进行分析。
图6。
图6。
体内有效磷酸化需要4E-BP2和4E-BP1的特性。（A） 用野生型4E-BP2载体或RAIP基序改变为AAAP的突变体转染HEK293细胞。细胞隔夜缺乏血清，有时也缺乏氨基酸（60分钟）。如有指示，用雷帕霉素或胰岛素处理细胞。使用抗myc（检测4E-BP2）或抗4E-BP1（Thr36/45磷酸特异性抗体）通过SDS-PAGE和Western blotting分析样品。（B和C）用WT 4E-BP1或LM/AA突变体的载体转染HEK293细胞，每个载体都作为N-末端his/myc标记的蛋白质。在血清饥饿过夜后，按照指示用雷帕霉素或胰岛素处理细胞。（B） 裂解物样品在m上进行亲和层析7GTP-Sepharose，然后使用所示抗血清通过SDS-PAGE和Western blotting分析结合材料。（C） 通过SDS-PAGE和Western blotting，使用抗myc和指示的4E-BP1磷酸特异性抗血清对裂解产物样品进行分析。对于（P）Ser64，可以看到内源性（endog.；用作阳性对照）和重组（his/myc）4E-BP1蛋白。用编码FLAG标记的mTOR和myc-raptor的载体转染（D至F）HEK293细胞。（D） Western blot证明mTOR和myc-raptor有效表达。（E） 将GST-4E-BP1和eIF4E混合并在谷胱甘肽-Sepharose上拉下（拉下），结合物通过SDS-PAGE和Western blotting使用eIF4E和4E-BPl抗血清进行分析。净化eIF4E和GST-4E-BP1（输入）作为对照运行。（F） 重组4E-BP1与免疫沉淀mTOR/猛禽在[γ-32P] 三磷酸腺苷，氯化锰2以及重组eIF4E和/或GST-FKBP12加雷帕霉素。
图7。
图7。
4E-BP1磷酸化调控模型，结合本报告的研究结果。我们的数据与mTOR直接磷酸化Thr37/46一致。这需要4E-BP1中的RAIP基序，该基序可能与（假定的）伴侣蛋白X相互作用，也可能将mTOR招募到4E-BP1。作用于Thr70的激酶尚不清楚，但似乎不太可能是mTOR本身，因为它对LY294002不敏感，并且mTOR的大多数C末端残基缺乏缺失作用。作用于Ser65的激酶的身份也不清楚，但这种磷酸化事件由胰岛素（Ins）刺激，并被雷帕霉素（rapa）阻断。激酶可能是mTOR本身。在缺乏血清的条件下，Thr70的磷酸化水平较低，并且受到胰岛素刺激的细胞中，这种作用也被雷帕霉素阻断。这表明雷帕霉素可能干扰mTOR到4E-BP1的信号传导，而不是通过mTOR直接磷酸化。氨基酸主要影响Thr37/46的磷酸化。为了清楚起见，未显示4E-BP1与eIF4E结合以实现体内高效磷酸化的要求。
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