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.2004年10月；15(10):4532-43.
doi:10.1091/mbc.e04-04-0348。 Epub 2004年7月28日。

Pur阻遏蛋白和Sp1/Smad辅活化因子动态相互作用介导转化生长因子β1激活的肌成纤维细胞中血管平滑肌α-actin基因转录的诱导

Sukanya V Subramanian苏卡尼亚五世 1, 约翰·波里坎多提斯, 小罗伯特·J·凯尔姆, 杰森·戴维, 查尔斯·奥罗斯兹（Charles G Orosz）, 亚瑟·R·斯特劳赫
附属公司

Pur阻遏蛋白和Sp1/Smad辅活化因子动态相互作用介导转化生长因子β1激活的肌成纤维细胞中血管平滑肌α-actin基因转录的诱导

Sukanya V Subramanian苏卡尼亚五世等。 摩尔生物细胞. 2004年10月.

摘要

小鼠血管平滑肌α-肌动蛋白（SMA）基因增强子通过转化生长因子β1（TGF-beta1）在成纤维细胞中激活，TGF-beta是肌成纤维细胞分化和伤口愈合的有效介质。SMA增强子包含Sp1转录激活蛋白和Puralpha及β阻遏蛋白的串联位点。我们研究了这些不同蛋白质之间的动态相互作用，以确定可能控制慢性炎症期间肌成纤维细胞分化的检查点。SMA增强子中的一个新元件SPUR负责成纤维细胞中的基础和TGF-β依赖性转录激活，并能够结合Sp1和Pur蛋白。当转化生长因子β1或Smad蛋白过度表达增加SMA增强子活性时，分离出一种新的Sp1:Pur:SPUR复合物。观察到Pur蛋白与Smad2/3的物理联系，即Smads与上游增强子区的结合，该增强子区域在TGF-beta1激活的肌成纤维细胞中经历DNA双重解链。TGF-beta1不能减轻SMA增强子的Purbeta阻遏作用，而Puralpha介导的阻遏部分被TGF-beta或Smad蛋白的过度表达所挽救。Pur阻遏物亚型与Sp1和Smad辅活化因子之间的相互作用可能在创伤修复和组织重塑期间调节TGF-beta1激活的肌成纤维细胞中的SMA增强子输出。

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数字

图1。
图1。
EMSA描述了新生小鼠心室（左侧和中部）和血清处理的AKR-2B成纤维细胞（右侧）提取物中天然Sp1、Sp3和Pur蛋白与来自SMA增强子不同区域的双链SPUR探针（dsSPUR）或单链探针（ssMCAT）的相互作用包含Pur蛋白结合位点，但不包含其他蛋白质。EMSA反应使用针对Sp1、Sp3、Purβ、SRF和TEF1的抗体进行处理，以改变包含同源转录因子的DNA：蛋白质复合物的大小（大小变化复合物位于标有星号的括号内）。Sp1、Sp3和Pur蛋白的大小都独立地由其相应的抗体改变，而不是由无关的SRF或TEF1抗体改变。
图2。
图2。
（A） 使用双链和单链SMA增强子探针对成纤维细胞核提取物进行DBA。DBA探头显示在顶部边缘。用于亲和性分离蛋白的Western blot分析的抗体如左图所示。ds，双链DBA探针；ss，单线DBA探头。dsSPUR结合Pur、Sp1和Sp3蛋白质。（B） 使用突变SPUR探针对成纤维细胞核提取物进行DBA。双链情况下的SPUR突变消除了Pur结合，但对与单链探针的结合没有不利影响。wt，野生型上下文；m1，m2，突变上下文（表1）；ns，非特异性物种。DBA Western blots的抗体显示在左侧。
图3。
图3。
TGFβ1激活的肌成纤维细胞制备的核提取物的DBA。用于免疫印迹的抗体显示在每个面板的左侧。在TGFβ1暴露6小时后，与dsSPUR探针结合的Pur蛋白减少了四倍。
图4。
图4。
来自成纤维细胞的Sp1:Pur蛋白复合物的免疫沉淀。（A） 从无血清（对照）AKR-2B成纤维细胞核提取物中分离出的Sp1免疫沉淀物含有显著的Purα和Purβ带，通过使用泛特异性抗Pur抗体的Western blot分析显示。在TGFβ1暴露6小时期间，肌成纤维细胞分化伴随着Sp1:Pur蛋白相互作用的减少。暴露于TGFβ1对核提取物中Pur蛋白亚型水平无明显影响（下图）。（B） 用Sp1特异性抗体对转染空表达质粒（-）或含有编码Smad 2、3和4（+）cDNA的等摩尔质粒混合物的COS7成纤维细胞分离的Pur蛋白免疫沉淀进行Western blot处理。转染Smad表达质粒不会影响Sp1蛋白的净表达（底部），但会显著削弱Sp1:Pur蛋白的相互作用（顶部）。
图5。
图5。
Pur蛋白作为转染COS7成纤维细胞中SMA增强活性的双峰介质。（A） 两种Pur蛋白都能抑制Sp1介导的SMA增强子激活。（B） Smad蛋白是SMA增强子的强效激活剂，可以中和Purα介导的抑制，无论是否含有Sp1。（C） Purβ表现为显性阴性型阻遏物，不受Smad或Sp1蛋白过度表达的影响。对于A到C，单个转染中包含的表达质粒用（+）表示。（D） 通过使用Pur蛋白特异性多克隆抗体进行Western blot分析，验证转染COS7成纤维细胞中的蛋白过度表达（top）；Smad 2、3和4（中间）；或Sp1（底部）。1号通道（所有面板），非转染COS7成纤维细胞提取物；通道2–4，COS7成纤维细胞的提取物，转染了Purα单独表达质粒（通道2，顶部）、Smad2/3/4（通道2中，中间）、Sp1（通道2、底部）、Purβ单独表达载体（通道3，顶部）或Purα和Purβ两者（通道4，顶部）。
图6。
图6。
在AKR-2B成纤维细胞中Pur蛋白的过度表达减弱了TGFβ1或Smad蛋白对SMA增强子和全长启动子的激活。（A） 通过TGFβ1、Smad2/3/4或两者的组合转染的成纤维细胞中的VSMP4增强子活化被Purα过度表达显著抑制，并被Purβ完全抑制。将通道2、3和4与通道5、6和7（Purα介导的抑制）或通道8、9和10（Purβ介导的阻遏）进行比较。（B） Smad介导的AKR-2B成纤维细胞中全长VSMP8启动子的激活被Purα和Purβ显著抑制。将泳道5与泳道6（Purα介导的抑制）或泳道7（Purβ介导的抑制）进行比较。VSMP8启动子通常在成纤维细胞中转录沉默，但被TGFβ1或Smad信号转导中间蛋白激活（比较通道1和5）。对于A和B，用于每次转染的各种处理和/或表达质粒组合显示在底部。
图7。
图7。
转染COS7成纤维细胞中Smad 2/3:Pur蛋白复合物的证据。从过度表达Sp1（1-4道）或Smad 2/3/4（5-8道）的COS7成纤维细胞制备的核蛋白提取物用Sp1或Smad特异性抗体进行IPed（如每个面板底部所示），并使用左侧所示抗体进行Western blot（WB）处理。Sp1（IP:Sp1）和Smad（IP:Flg-Smad）免疫沉淀都含有Purα和Purβ，但用Smad 7阴性对照抗体处理的样品不含有（IP:Smad 7）。所有过度表达的蛋白都没有表现出与亲和分离珠的非特异性结合（无IP）。如底部两个面板所示，通过核蛋白提取物的Western blot分析验证蛋白质过度表达。标记为“ns”的带没有详细研究，但可能代表共价修饰的Pur蛋白亚型（未公布的数据）。
图8。
图8。
肌成纤维细胞中的SMA增强子激活蛋白具有不同的亚细胞定位和增强子结合特异性。左，暴露于TGFβ1 24小时后，从AKR-2B成纤维细胞制备的核蛋白提取物的Smad和Sp1蛋白印迹。Smad 2和3在TGFβ1处理后1 h内进入细胞核，而细胞核Sp1水平则一致较高。对，DBA使用TGFβ1激活的肌成纤维细胞的核提取物和来自SMA增强子的各种dsDNA探针（见顶部）。Smad和Sp1增强子激活蛋白结合到SMA增强子的不同区域。
图9。
图9。
心脏重塑伴随着Pur蛋白亚型含量和SMA表达的变化。使用Pur-和SMA特异性抗体通过Western blot评估从新生儿（产后第4、6、9和13天）和成年小鼠心室以及从移植的同种异体（同种异体）心脏移植物（移植后30天）心室制备的蛋白提取物。出生后发育期的特点是Purβ亚型占主导地位，SMA表达减少，而慢性排斥的同种异体心脏表达更多Purα和SMA蛋白，而非移植受体的本地心脏表达更多。标记为“ns”的带没有详细研究，但可能代表共价修饰的Pur蛋白亚型（未公布的数据）。
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