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比较研究
。2003年4月；14(4):1583-96.
doi:10.1091/mbc.e02-07-0399。

人线粒体核仁的组成和动力学

努里亚·加里多 1, 洛伦娜·格里帕里克, 埃贾·约基塔洛, 乔玛·瓦蒂奥瓦拉, 亚历山大·范德布利克, 约翰内斯·斯佩尔布林克
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比较研究

人线粒体核仁的组成和动力学

努里亚·加里多等。 分子生物学细胞。 2003年4月。

摘要

在酿酒酵母中，被称为核仁的离散蛋白-DNA复合体中的多个线粒体DNA（mtDNA）分子的组织已被很好地研究。最近通过Twinkle-GFP融合蛋白与mtDNA的共定位，在人类细胞中观察到类似结构。然而，哺乳动物细胞中的类核特征很差，通常被认为是相对简单的结构，尽管有酵母的范例。在本文中，我们使用免疫细胞化学和生化分离程序来表征人类线粒体核仁的组成。结果表明，线粒体转录因子TFAM和线粒体单链DNA-结合蛋白通过溴脱氧尿苷的特异掺入与Twinkle在线粒体内病灶（定义为核仁）共定位。此外，mtDNA聚合酶POLG和其他各种尚未鉴定的蛋白质与mtDNA核仁通过生化分离程序进行共纯化，TFAM也是如此。结果表明，哺乳动物细胞中的mtDNA在线粒体网络中以离散的富含蛋白质的结构组织。类核的体内延时成像显示，它们是能够在线粒体网络中分裂和重新分布的动态结构，并表明类核是线粒体的遗传单位。类核不与线粒体裂变机制蛋白Drp1（dynamin-related protein 1，Drp1）共定位。

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数字

图1
图1
内源性TFAM和mtSSB在线粒体内病灶中的定位。143B骨肉瘤细胞在盖玻片上生长1-2天，用Mitotracker Red（B和E）染色。ICC使用多克隆兔抗体和次级荧光素标记抗体检测TFAM（A）和mtSSB（D）。（C；TFAM，F；SSB）合并荧光图像。（G） HEK293细胞线粒体中TFAM的免疫标记。七个金粒子沿着300 nm的线粒体聚集。线粒体（圆形）外的背景标记很少。（H） G中方框区域的放大，显示横切嵴（C）附近线粒体基质中的TFAM标签（箭头）。
图2
图2
用内源性TFAM、mtSSB和POLG2对Twinkle-EGFP进行染色。143B骨肉瘤细胞（或A549肺癌细胞）生长在盖玻片上，并转染Twinkle-EGFP构建物。转染ICC后1至2天进行TFAM、mtSSB或POLG2检测。二级抗体具有罗丹明或德克萨斯红荧光基团。（A、D和G）分别用于TFAM、mtSSB和POLG2的ICC。（B、E和H）与显示Twinkle-EGFP表达的A、D和G的细胞相同。（C、F和I）合并荧光图像，分别显示Twinkle-EGFP与TFAM、SSB和POLG2的共定位。如G和H中箭头所示，一些但并非所有含有明显最高POLG2浓度的病灶也含有Twinkle-EGFP，但总体POLG2荧光比TFAM或mtSSB荧光更均匀。
图3
图3
mtSSB或Twinkle阳性的线粒体内病灶是BrdU掺入的位点。将143B（TK−）细胞接种在低密度下24–48小时后，用BrdU标记MtDNA 24小时（A–C）或2小时（D–F）。BrdU特异性单克隆抗体（a和D）检测到BrdU掺入。随后处理A中显示的细胞用于mtSSB-ICC（B），而D中显示的在BrdU标记前24小时用Twinkle-MycHis构建物转染的细胞用于Twinkle-MycHis-ICC（E）。（C和F）分别是A+B和D+E的合并图像。结果显示，在大多数病灶中都有丰富而特异的BrdU标记，也对mtSSB或Twinkle进行了特异性染色，表明这些病灶是类核细胞。
图4
图4
内源性TFAM和mtSSB在rho-zero细胞中的分布和表达水平。（A） ICC用于A549 rho+和rho-zero（C）细胞内源性TFAM。（B） ICC用于A549 rho+和rho-zero（D）细胞内源性mtSSB。结果显示可检测的TFAM蛋白水平显著降低。请注意，C的曝光和图像增强与A中的不同，以便在每种情况下获得信息最丰富的图像。
图5
图5
从培养的人类细胞中生化分离类核。HEK 293细胞生长至～80%汇合处，并通过低速离心分离。线粒体分离程序和核仁分离程序的后续步骤如A所示。还指出了其他面板中使用的各种组分的缩写。（B） A.（C）中所示的各种纯化步骤的蔗糖梯度分析。使用针对线粒体蛋白质的各种特定抗体，对分离程序每个步骤的组分进行更彻底的分析。本例中使用的S1部分来自蔗糖梯度的顶部。请注意，观察到一种主要的交叉反应非POLG蛋白（用星号表示），其迁移率略高于POLG本身（用空心箭头表示）。交叉反应物种在组分mt、S0、P0和S1中突出，而在P1中仅微弱可见，在P2中不再可见。POLG在P0中非常微弱，而在P1和P2中更为显著，表明其富集。两个星号表示TFAM分解产品（有关进一步说明，请参阅正文）。（D） 与C使用的样品相同，但凝胶是考马斯胶，随后银染以显示所有蛋白质。右侧以kDa表示蛋白质标记。我们根据其分子量和丰度，通过比较凝胶与C和腺嘌呤核苷酸转运体（ANT）中显示的免疫印迹，初步确定了TFAM蛋白。还应注意，由于凝胶负载限制，最终P2组分中的总蛋白浓度显著低于P1组分，还应注意P2中的条带可能略有上移，这可能是因为不完全透析去除多余的蔗糖。
图6
图6
核仁和线粒体动力学。研究了MitoTracker红染色和Twinkle-GFP转染COS7细胞的类核动力学。Mitotracker显示为均匀的线粒体染色，而Twinkle-GFP显示为较亮的线粒体内斑点。（A） 细胞的一部分，有几个核仁分裂，用实心箭头表示。此外，它还显示了一个明显的核仁重新分布，移动到一个似乎即将分裂的子线粒体中（用开放箭头表示）。在A和B中，每隔15秒显示一帧，从左到右，从上到下。（B） 两次线粒体分裂事件（实心箭头），其中核仁的位置使每个子线粒体至少有一个新的核仁元素。尽管核仁在分裂后看起来接近尖端，但它们似乎并不积极参与分裂事件本身。
图7
图7
Drp1不与线粒体核仁共定位。为了进一步证明核仁被排除在线粒体分裂位点之外，我们观察了mtSSB ICC（A）染色的核仁在人类骨肉瘤细胞中与线粒体分裂蛋白Drp1（此处用作GFP融合蛋白（B））的共定位。合并图像（C）显示Drp1-GFP与mtSSB病灶普遍缺乏共定位。在C所示的细胞放大切片中，显示了一个含有Drp1-GFP的线粒体收缩位点，mtSSB位于这个推测的未来裂变位点的任一位点（实心箭头）。由开放箭头指示的是线粒体尖端的两个微弱的Drp1 GFP焦点，提示最近的分裂事件。
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