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.2002年10月15日；99(21):13571-6.
doi:10.1073/pnas.202476899。 Epub 2002年9月23日。

结节性硬化复合物-1和-2基因产物共同抑制雷帕霉素（mTOR）介导的哺乳动物靶向下游信号传导

Andrew R T恤 1, 黛安·芬加, 布伦丹·D·曼宁, 大卫·J·奎亚特科夫斯基, 刘易斯·坎特利, 约翰·布莱尼斯
附属公司

结节性硬化复合物-1和-2基因产物共同抑制雷帕霉素（mTOR）介导的哺乳动物靶向下游信号传导

Andrew R T恤等。 美国国家科学院程序. .

中的勘误表

摘要

结节性硬化综合征（TSC）是一种常染色体显性遗传病，发生于TSC1或TSC2基因突变时，其分别编码蛋白质产物hamartin和tuberin。在这里，我们证明了hamartin和tubin共同作用，抑制雷帕霉素（mTOR）介导的哺乳动物靶向真核生物起始因子4E-结合蛋白1（4E-BP1）和核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）的信号传导。首先，hamartin和tubin的共表达抑制了4E-BP1的磷酸化，导致4E-BPl与eIF4E的结合增加；重要的是，来源于TSC患者的TSC2突变体在抑制4E-BP1的磷酸化方面存在缺陷。其次，hamartin和tubin共表达抑制了S6K1的活性，但不影响S6K1雷帕霉素耐药突变体的活性，这表明mTOR参与TSC介导的S6K1抑制作用。第三，hamartin和tubin阻断了氨基酸在缺乏营养的细胞内激活S6K1的能力，这一过程依赖于mTOR。这些发现强烈暗示了tuberin-hamartin肿瘤抑制复合物是mTOR的抑制剂，并提示TSC患者肿瘤的形成可能是由于向下游靶点异常高水平的mTOR介导的信号传导所致。

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数字

图1
图1
哈马丁和块茎蛋白抑制PI3K依赖的4E-BP1磷酸化。将共表达标记hamartin（Ham）和tubin（Tub）的HEK293E细胞与标记HA-的4E-BP1进行血清饥饿处理，并用20 nM雷帕霉素（rap）预处理30分钟，然后用胰岛素（100 nM）或PMA（100 ng/ml）刺激30分钟。(A类)测定Akt的水平和Thr-308磷酸化以及MAPK亚型（p44和p42）的水平和磷酸化。(B类)从细胞裂解物（Sol）和不溶性部分（Non-Sol）中获取火腿蛋白和块茎蛋白水平，如材料和方法使用抗Flag抗体。使用块茎蛋白Thr-1462磷酸特异性抗体分析了Thr-1452块茎蛋白磷酸化。(C类)如图所示，外源性4E-BP1的磷酸化通过抗HA抗体和4E-BP1-Thr-37和/或46、Ser-65和Thr-70的磷酸特异性抗体进行测定。相应地标记4E-BP1的α、β和γ物种。(天)细胞提取物在m7GTP-Sepharose，如中所述材料和方法测定了经铜纯化的eIF4E和外源4E-BP1的水平。
图2
图2
火腿草素和块茎素抑制增殖细胞内4E-BP1磷酸化和S6K1活性。U20S细胞过度表达4E-BP1(A类)或S6K1(B类)如图所示，在血清中培养含有或不含有hamartin（Ham）和tubin（Tub）的细胞，并用20 nM雷帕霉素（Rap）处理30分钟。Hamartin、tubin和MAPK亚型（作为负荷控制）蛋白质水平显示。相应地标记4E-BP1的α、β和γ物种。S6K1激酶检测按照材料和方法显示了S6K1的总电平。成立32对GST-S6中的P标记进行了评估，并给出了凝胶的放射自显影图。比率32将纳入GST-S6的P标签与空载体（pRK7）进行标准化。所提供的数据代表了至少三个实验。(C类)HEK293E细胞过度表达4E-BP1（含或不含hamartin（Ham）、tubin（Tub）和tubin K599M突变体[Tub（K599M）]，如有指示，则对其进行血清饥饿处理，然后用100 nM胰岛素刺激30分钟（如有指示）。如图1所示，分析了Hamartin和tubin的表达以及4E-BP1的磷酸化程度C类.
图3
图3
Tuberin-hamartin对S6K1的抑制作用依赖于mTOR。(A类)S6K1构造的图示。(B类)对过度表达这些S6K1蛋白的HEK293E细胞（含或不含hamartin（Ham）和tubin（Tub））进行血清饥饿处理，用20 nM雷帕霉素预处理30 min，然后用100 nM胰岛素刺激30 min，如有指示。测定Thr-308处hamartin、tubin的表达以及Akt磷酸化的蛋白水平和程度。S6K1激酶测定如图2所示进行。图表显示了S6K1的活性，对于每种S6K1结构体的胰岛素处理样品，S6K1活性标准化为1。这些数据代表了三个单独的实验。
图4
图4
哈马丁和块茎素通过mTOR抑制氨基酸介导的信号传导至S6K1。U20S系列(A类)和HEK293E(B类)S6K1过度表达hamartin（Ham）和tubin（Tub）的细胞缺乏营养（D-PBS），如材料和方法细胞用20 nM雷帕霉素或100 nM沃特曼肽预处理30 min，然后在持续存在抑制剂的情况下重新添加氨基酸。如图所示，用100 nM胰岛素处理HEK293E细胞30分钟。hamartin、tubin和Akt水平，以及Thr-308处Akt的磷酸化（如确定）。按照图2进行S6K1激酶分析。对于仅提取氨基酸的样品，S6K1的活性标准化为1。这里提供的数据代表了三个单独的实验。
图5
图5
哈马丁和块茎蛋白抑制独立于PI3K信号传导的S6K1活性。对过度表达野生型或F5A-ΔCT S6K1的HEK293E细胞（含或不含hamartin（Ham）和tubin（Tub））进行血清饥饿处理，用20 nM雷帕霉素或100 nM沃特曼素预处理30 min，然后用100 nM胰岛素刺激30 min，如有指示。测定了hamartin和tubin的表达以及Thr-308处Akt的蛋白水平和磷酸化程度。按照图2进行S6K1激酶分析。这些图表显示了S6K1的活性，对于每个S6K1构建体的胰岛素模拟样本，该活性标准化为1。
图6
图6
模型显示，块茎蛋白-哈马丁复合物通过mTOR调节4E-BP1和S6K1的PI3K依赖性信号。PI3K的激活通过Akt介导的Ser-939和Thr-1462处的块茎蛋白磷酸化导致块茎蛋白-错构瘤蛋白复合物失活（8）。块茎蛋白-哈马丁复合物的失活释放了对mTOR的抑制，并允许mTOR向S6K1和4E-BP1-eIF4E复合物发出营养依赖性信号。因此，cap依赖性和5′末端寡嘧啶束（5′-TOP）mRNA介导的翻译增加。虚线箭头描述了Akt磷酸化mTOR（32）的发现。
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