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.2002年4月29日；157(3):455-68.
doi:10.1083/jcb.200109094。 Epub 2002年4月29日。

DAP激酶和DRP-1介导细胞程序性死亡过程中膜泡和自噬小泡的形成

博阿兹·因巴尔 1, 沙尼·比亚利克, 伊拉娜·萨巴奈, 吉迪·沙尼, 阿迪·泡菜
附属公司

DAP激酶和DRP-1介导细胞程序性死亡过程中膜泡和自噬小泡的形成

博阿兹·因巴尔等。 J细胞生物学. .

摘要

死亡相关蛋白激酶（DAPk）和DAPk-related protein kinase（DRP）-1蛋白是Ca+2/钙调素调节的Ser/Thre死亡激酶，其在程序性细胞死亡中的确切作用尚不清楚。在这项研究中，我们分析了这些激酶在细胞死亡过程中参与的亚细胞事件。这些DAPk亚家族成员中的每一个成员以其激活形式的表达触发了两个主要的细胞质事件：膜泡，这是几种类型细胞死亡的特征，以及广泛的自噬，这是自噬（II型）程序性细胞死亡的典型特征。这两种不同的细胞结果完全独立于半胱天冬酶活性。还发现DAPk或DRP-1显性阴性突变体在p55/肿瘤坏死因子受体1诱导的I型细胞凋亡过程中减少了膜泡，但不阻止核碎裂。此外，DRP-1或DAPk反义mRNA显性阴性突变体的表达降低了抗雌激素、氨基酸饥饿或注射干扰素-γ诱导的自噬。因此，内源性DAPk和DRP-1在这两种不同的细胞质事件中都具有速率限制功能。最后，免疫金染色显示DRP-1定位于自噬囊泡内，表明该激酶直接参与自噬过程。

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数字

图1。
图1。
DAPk家族蛋白诱导的形态学变化。（A） 用荧光素酶、p55/TNFR1、DRP-1Δ73或DAPkΔCaM和GFP转染293细胞24小时后细胞死亡的定量。图中显示了GFP阳性细胞的百分比以及细胞形态的改变。（B） 与荧光素酶（1）、p55/TNFR1（2）、DRP-1Δ73（3）或DAPkΔCaM（4）共同转染的GFP阳性细胞的照片。（C） 显示转染GFP和荧光素酶（1）或GFP-DAPk（2和3）后24小时293细胞的GFP重叠和相位对比图像的照片；显示了起泡的GFP DAPk表达细胞（2，箭头表示起泡）和扩散的未转染细胞（3）。（D） 与GFP和DAPkΔCaM（1和4）、DRP-1Δ73（2和5）或p55/TNFR1（3和6）共转染60小时后，GFP阳性293细胞（1-3）的Hoechst染色（4-6）。箭头指向DRP-1Δ73或DAPkΔCaM转染产生的浓缩细胞核（4和5）。
图2。
图2。
DAPk家族蛋白不会通过线粒体途径诱导细胞死亡。（A） 线粒体膜电位评分损失(ΔΨm). 293个表达荧光素酶（黑色）、DRP-1Δ73（粉红色）、DAPkΔCaM（紫色）和Bax（绿色）的细胞在转染24 h后用TMRM荧光流式细胞术分析线粒体膜电位的损失。从三个实验中计算出的TMRM阴性细胞的比例如下图所示。激酶转染细胞中TMRM荧光的微小增加在统计学上并不显著。（B） 对线粒体中细胞色素C的释放进行评分。将293个细胞与荧光素酶（1和2）、Bax（3和6）、DRP-1Δ73（7和8）或DAPkΔCaM（9和10）和GFP构建物共转染24小时，并使用抗细胞色素C抗体进行免疫染色。观察细胞色素C（左）或GFP（右）荧光。显示Bax转染扩散（3和4）或气泡（5和6）细胞。在含有未转染细胞的区域，箭头指向GFP阳性细胞色素C染色细胞。（C） 评估Bcl-2和Bcl-X的影响L（左）293细胞与荧光素酶、DRP-1Δ73、DAPkΔCaM或Bax、Bcl-2或Bcl-X共转染L（左）与GFP一起。转染24小时后，荧光显微镜观察GFP阳性细胞，并对细胞死亡形态进行评分。细胞总死亡是指观察到的所有形态变化的总和。
图3。
图3。
DAPk家族蛋白诱导细胞死亡的高分辨率形态学。（A） 转染荧光素酶（1）p55/TNFR1（2a–2c）、DRP-1Δ73（3a和3b；图3b的一部分在其右侧放大）和DAPkΔCaM（4）的293细胞的透射电子显微照片。自噬发育的不同阶段描述如下：未成熟的自噬小泡（双箭头）、成熟的自吞噬小泡和自溶体（黑色箭头）和残体（虚线箭头）。空空泡（白色箭头）也显示出来。箭头显示染色质浓缩而破碎。m、 线粒体；g、 高尔基器械。棒材，1μm。（B） 转染荧光素酶（1）、p55/TNFR1（2a-2c）、DRP-1Δ73（3a和3b）和DAPkΔCaM（4）的MCF-7细胞的透射电镜照片。图中显示了未成熟自噬小泡（双箭头）、自噬小泡（黑色箭头）和残体（虚线箭头）。B、2b和2c中的插入物对应于空空泡，而B、3a和4中的插入体对应于自噬小泡。箭头显示染色质浓缩而破碎。m、 线粒体；dm，线粒体变暗；n、 细胞核；g、 高尔基体；v、 液泡；ly，溶酶体；内质网。
图4。
图4。
DRP-1在各种细胞系中诱导自噬。（A） 293和MCF-7细胞中自噬的定量。图中显示了荧光素酶或DRP-1Δ73转染产生的MDC阳性细胞的百分比（平均值±SD由每100个细胞的三倍计算得出；注意总细胞数包括转染细胞和未转染细胞）。这些实验重复了三次，结果可重复。（B） A。箭头所示的同一实验中MDC染色的MCF-7细胞照片指向MDC阳性细胞。转染：荧光素酶（1a和1b）和DRP-1Δ73（2a和2b），低（a）和高（b）放大倍数。
图5。
图5。
DAPk家族蛋白在不同细胞系中诱导caspase非依赖性细胞死亡。（A） 293个细胞死亡相关形态的量化。图表显示了在存在或不存在半胱氨酸蛋白酶抑制剂BD-fmk或z-VAD-fmk的情况下，荧光素酶、p55/TNFR1、DRP-1Δ73或DAPkΔCaM转染引起的所有形态变化光谱的细胞百分比（100μM；平均值±SD由每100个细胞的三倍计算）。该实验重复三次，结果可重复。（B） MCF-7细胞死亡相关形态的量化。在存在或不存在BD-fmk（100μM）的情况下，按照A中的方法执行实验条件。（C） 图中显示了荧光素酶、p55/TNFR1、DRP-1Δ73或DAPkΔCaM与半胱氨酸蛋白酶抑制剂crmA或控制荧光素素酶载体共同转染后发生的全谱死亡相关形态学变化的细胞百分比（平均值±SD，从每100个细胞的三倍计算）。免疫印迹显示转染HA标记的DAPk和DRP-1Δ73的表达水平，证实与crmA共转染不会改变死亡诱导蛋白的表达。（D） 转染p55/TNFR1（1）或DRP-1Δ73（2a和2b；部分图在右侧放大）并用caspase抑制剂BD-fmk（100μM）处理的293细胞的透射电镜照片。图中显示了未成熟的自噬小泡（双箭头）、自噬囊泡（黑色箭头）和自溶体（白色箭头）。m、 线粒体；g、 高尔基器械。（E） 从转染荧光素酶、p55/TNFR1、DRP-1Δ73或DAPkΔCaM和GFP的HeLa细胞制备的细胞裂解物的Western blot，并孵育24 h。Blot与抗PARP抗体、抗caspase-8抗体、抗caspase-3抗体、抗HA抗体反应DRP-1△73和DAPk△CaM检测，和抗β-微管蛋白抗体，以定量蛋白质负荷。
图6。
图6。
DRP-1和DAPk显性阴性突变体减少了293细胞中p55/TNFR1转染引起的膜泡。（A） 用p55/TNFR1与融合到GFP或DRP-1 K42A和pEGFP-N1载体的DAPk死亡域联合转染293细胞。还使用了控制荧光素酶载体。荧光显微镜下观察GFP阳性细胞，并对转染24小时后出现的膜泡进行评分。（B） 各种类型的p55/TNFR1转染293细胞的照片：扩散细胞（1）、气泡细胞（2）、浓缩细胞（3）、细胞质碎片细胞（4）以及在非凝聚细胞质中携带碎片细胞核的细胞（5）。（C） 转染GFP、p55/TNFR1和荧光素酶或DRP-1 K42A后24小时观察到的每个死亡形态的量化。
图7。
图7。
DRP-1 K42A可防止类固醇戒断和氨基酸饥饿诱导的自噬。（A和B）。MCF-7细胞自噬的量化。用荧光素酶或FLAG–DRP-1 K42A转染MCF-7细胞，然后停药（血清饥饿加10−6三苯氧胺治疗）（A）或通过血清和氨基酸饥饿（B）（平均值±SD，根据每100个细胞的三倍计算）。将这些实验重复三次，得到可重复的结果。从转染细胞中提取的蛋白质用抗FLAG和抗β-微管蛋白抗体进行Western blot分析。（C） 从相同实验中获得的MDC染色类固醇提取MCF-7细胞的照片，如A所示。转染：荧光素酶（1a和1b）和DRP-1 K42A（2a和2b），低（A）和高（b）放大倍数。
图8。
图8。
类固醇戒断或氨基酸饥饿诱导的自噬对半胱氨酸蛋白酶抑制剂不敏感。（A） MDC染色的MCF-7细胞照片。（上图）类固醇提取。细胞生长在完全培养基（1）、去类固醇培养基（2）或去类固酮培养基（3）中，在广泛半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂BD-fmk（100μM）的存在下培养3d（底部）氨基酸饥饿。细胞生长在完全培养基（1-3）或氨基酸饥饿条件（4-6）下，无（1和4）或（2和5）存在广泛半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂BD-fmk（100μM）或自噬通用抑制剂3-甲基腺嘌呤（10 mM）（3和6），在MCF-7饥饿细胞中进行3d（B）PARP裂解。用抗PARP抗体对从4-d甾体缺失（左）或12-h TNF–α处理（100 ng/ml）细胞（右）中提取的蛋白质进行Western blot分析。这些蛋白质是从A.（C）图中所示的相同实验中制备的，该图显示了在有或无所示半胱天冬酶抑制剂（25μM）的情况下，三苯氧胺处理（填充）或未处理（未填充）培养物中死亡（收缩和分离）MCF-7细胞的累积相显微镜分数。
图9。
图9。
DAPk反义RNA对干扰素的保护作用-γ–诱导HeLa细胞自噬。（A） HeLa细胞自噬定量。细胞在完全培养基（1）中生长，用IFN-γ（1000 U/ml）处理（2），或在广泛半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂BD-fmk（100μM）（3）存在下用IFN-β处理3 d，和干扰素-γ（1000 U/ml）+BD-fmk（3）。（C） HeLa IFN-γ处理细胞中的PARP裂解。用抗PARP抗体对从IFN-γ处理（左）或TNF-α处理（100 ng/ml）细胞（右）中提取的蛋白质进行Western blot分析。这些蛋白质是根据未处理（顶部）和IFN-γ处理（底部）HeLa细胞的A.（D）透射电子显微照片中显示的相同实验制备的。箭头指向自噬囊泡。（E） 在存在或不存在IFN-γ（1000 U/ml）和BD-fmk（50μM）的情况下，用潮霉素B（200μg/ml）培养DAPk反义转染和对照DHFR-转染HeLa细胞的多克隆群体。2天后使用MDC染料检测自噬囊泡。图中表示MDC-阳性细胞的平均值±SD，由每100个细胞的三倍计算得出。
图10。
图10。
DRP-1定位于自噬小泡的管腔内。对表达HA–DRP-1的293个细胞进行免疫金染色，发现DRP-1在含有细胞质物质（a和B）的双膜自噬体内腔、含有细胞器和空泡（C）的自噬体内以及含有消化物（D）的自溶体体内特异染色。金颗粒与C中吞噬的细胞器或D中的溶酶体不重叠。
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