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.2001年10月；12(10):3226-41.
doi:10.1091/mbc.12.10.3226。

保守的npl4蛋白复合物介导蛋白酶体依赖的膜结合转录因子激活

A L希区柯克 1, H克雷伯, S弗里茨, 阿林, M锁存器, P A银色
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保守的npl4蛋白复合物介导蛋白酶体依赖的膜结合转录因子激活

A L希区柯克等。 分子生物学细胞. 2001年10月.
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摘要

膜结合转录因子的蛋白水解激活已成为基因表达调控的重要机制。以这种方式调节的两种膜结合转录因子是酿酒酵母蛋白Mga2p和Spt23p，它们直接转录Delta9脂肪酸去饱和酶基因OLE1。我们现在发现，含有高度保守的Npl4p、Ufd1p和Cdc48p蛋白的膜相关复合物介导蛋白酶体调节的Mga2p和Spt23p的裂解。NPL4、UFD1和CDC48的突变导致Mga2p和Spt23p处理受阻，同时伴有OLE1表达缺失。综上所述，我们的数据表明，Npl4复合物可能将蛋白酶体靶向泛素化内质网膜结合蛋白Mga2p和Spt23p。鉴于最近发现NPL4与ERAD基因HRD4具有等位基因，我们进一步提出，NPL4的功能扩展到蛋白酶体的所有内质网-膜相关靶点。

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数字

图1
图1
Npl4蛋白在进化中保守的。序列同源性酿酒酵母Npl4p蛋白（ScNpl4p）（登录号CAA85131），美国。蓬贝预测蛋白SPBC1711.10c（SpNpl4）（登录号CAB88240），秀丽线虫蛋白质F59E12.4（CeNpl4[1]）（加入编号AAB54254）和F59E12.5（CeNpl4[2]）（加入编号AAB54255），D.黑腹果蝇预测蛋白质CG4673（DmNpl4）（加入号AAF56480），R。褐家鼠（大鼠）Npl4（Meyer等。，2000），以及预测智人（人类）蛋白FLJ20657（HsNpl4）（登录号NP 060391）以示意图的形式描述。这个D.黑腹果蝇Npl4蛋白含有大量氨基酸从该对齐中省略了插入。十个绝对保守N端的半胱氨酸和组氨酸残基可能构成新型锌2+-手指区域。更高的C端子扩展真核生物Npl4同源物编码预测的Nup153样锌指RanGDP-绑定域。受突变影响的残基的位置在中酿酒酵母npl4-1和npl4-2号机组指出了突变体。这个npl4-1号机组等位基因替代物323位保守甘氨酸的丝氨酸，以及npl4-2号机组突变导致截短缺乏C末端12个氨基酸的蛋白质。
图2
图2
Npl4p-GFP定位于内质网/核膜。（A）全细胞的抗-Npl4（左）和抗GFP（右）蛋白印迹从表达内源性Npl4p的菌株中提取的提取物（通道1和4） 、一个基因组标记的Npl4p-GFP（第2和第5道）和一个基因组标记的Npl4p-蛋白A（pA）（通道3和6）。抗Npl4斑点显示用两种不同的基因精确替换内源性Npl4pC末端标记的蛋白质（将通道2和3与通道1进行比较）。这个抗Npl4与Npl4-pA（车道3）的强大反应性是以下因素的结果抗体与Npl4p表位以及IgG结合pA的相互作用标签。兔抗GFP印迹可识别Npl4p-GFP和Npl4p-pA（分别为第5和第6车道）。不同蛋白质的特性由箭头指示。星号表示身份不明交叉反应蛋白。（B） 观察到的Npl4p-GFP定位荧光显微镜。在中期观察活细胞。定位主要是细胞核（白色箭头）和细胞质核周膜上的明显浓度。白色箭头显示了Npl4p-GFP定位到外周膜的示例。右侧显示了细胞的Nomarski图像。（C） 中性粒细胞4p-GFP与DAPI染色的核DNA共定位。细胞被固定在甲醛，用Triton X-100渗透，DAPI染色荧光显微镜。大多数Npl4p-GFP定位于DAPI观察到的与核重叠和围绕核的区域染色。右侧显示了细胞的Nomarski图像。（D）荧光显微镜观察Npl4p-GFP的表达DeltaVision平台。连续0.1μm荧光图像通过表达Npl4p-GFP的二倍体酵母菌株NPL4号机组并经历了五轮反褶积。所呈现的图像代表了未卷积数据的中心平面。白色箭头表示Npl4p-GFP在核周膜。白色箭头表示Npl4p-GFP示例定位于外周膜。
图3
图3
Npl4p定位的生化特征以及相互作用。（A） Npl4p存在于可溶性和膜结合中分数。粗全细胞提取物中的同等蛋白质（1号通道），纯化微粒体（通道2）和ER/核膜清除提取物（lane 3）从野生型酵母菌株中分离得到SDS-PAGE和免疫印迹抗Npl4抗体。乐队表示对应于Npl4p，星号表示未识别交叉反应蛋白。（B） Npl4p的微粒体分数为紧密的膜结合。从野生型酵母中纯化的微粒体菌株单独用缓冲液清洗（1号和2号通道），1 M KOAc（3和4车道），2 M KOAc（5和6车道），3 M尿素（7和8车道），0.1M钠2一氧化碳三pH 11（9和10车道），或1%Triton®声波风廓线仪X-100（11号和12号车道）。然后将样品分离成颗粒（P；膜相关；奇数泳道）或可溶性（S；偶数泳道）组分并用抗Npl4进行SDS-PAGE和Western印迹和抗Cdc48抗体。外围ER的提取轮廓膜蛋白Sec17p和内质网膜蛋白Sec62p用抗Sec17和抗Sec62蛋白免疫印迹法测定抗体作为对照。（C） Npl4p-蛋白A（pA）与Cdc48p共纯化和Ufd1p。来自任一菌株的酵母全细胞提取物培养表达未标记Npl4p（通道1）或Npl4p-pA（通道2）的细胞带有IgG-Sepharose珠。经过大量洗涤后，蛋白质与用酸洗脱珠子，并通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色。切除蛋白质的质谱分析谱带显示了Npl4p-pA铜化p100和p43的特性蛋白质分别为Cdc48p和Ufd1p。
图4
图4
酵母npl4号机组变种人被监管机构拯救UFA途径和蛋白酶体。（A） 抑制npl4-1号机组和npl4-2号机组温度灵敏度通过高拷贝表达有机发光二极管1,SPT23标准,MGA2公司、和RPN4.npl4-1（PSY2340，顶部）和npl4-2号机组（PSY2341，底部）菌株转化为空向量，或2μ向量包含NPL4号机组,有机发光二极管1,MGA2公司（aa1-914），MGA2公司,SPT23标准，或RPN4号机组被连续稀释到YEPD媒体。显示每个稀释液中发现的细胞数在底部。将培养皿在指定温度下培养24–48小时（B）npl4-1号机组拉紧被转座子插入等位基因外源性抑制SPT23标准野生型增长（WT；FY23），npl4-1号机组（PSY2373），以及npl4-1 SPT23：：Tn3:：LEU2Leu上的（PSY2377）菌株−指示温度下的板。FY23和PSY2373菌株转换为空LEU2级允许增长的向量卢−脱落板。（C） 的示意图美国。酿酒Mga2p和Spt23p蛋白。这些部分冗余因素有38%相同，54%相似。序列特征包括假定的基本核定位信号（NLS），假定的富含亮氨酸的核输出信号（NES）和两个锚蛋白重复序列。这个TIG结构域是一种存在于细胞表面的类Ig折叠结构域受体和包括NF-κB在内的细胞内转录因子。显示C末端跨膜结构域（TM）。坚固的块没有指定或预测功能的氨基酸保存用白色方框表示。隔震层中的截断位置MGA2公司显示高拷贝抑制克隆（pPS2019）由Mga2p示意图中的箭头指示。转座子的位置（电话：：LEU2级)插入npl4-1号机组基因外抑制等位基因SPT23标准（PSY2377）如Spt23p示意图所示。（D） 酵母的温度敏感性npl4号机组突变体是通过用UFA补充生长培养基，部分得到拯救。野生型（重量），机油1Δ,npl4-1号机组、和npl4-2号机组YEPD板上出现应变未补充（左侧）或补充（右侧）0.5 mM UFA（0.25 mM棕榈油酸[16:1]，0.25 mM油酸[18:1]，1%特吉醇）。将平板在指定温度下孵育48小时。
图5
图5
需要NPL4功能有机发光二极管1转录。Northern分析是在总RNA分离自机油1Δ（车道1），野生型（WT；车道2–4），npl4-1号机组（泳道5-7），npl4-2号机组（8–10车道），cdc48-3型（11–13车道），ufd1-1型（14-16车道），以及转速4Δ细胞（17–19车道）有机发光二极管1-和行动1-特定DNA探针。细胞在YEPD中生长介质温度为25°C，添加或不添加UFA。对于野生型细胞，温度敏感菌株npl4-1号机组,npl4-2号机组、和cdc48-3型、和非温度敏感性菌株ufd1-1型和转速4Δ，在轮班到37°C持续60分钟。A标准化有机发光二极管1/行动1计算每个样品与允许量化中的相对变化有机发光二极管1样本之间的表达。
图6
图6
NPL4是高效处理泛素化Mga2p和Spt23p融合蛋白。（A） 诱导野生型GFP-Mga2p融合蛋白（WT；泳道1-4），npl4-1号机组（泳道5-7），npl4-2号机组（车道8–10),cdc48-2型（11–13车道），ufd1-1型（14-16车道），以及转速4Δ（17–19车道）小区25°C。收集细胞进行抗GFP Western blot分析指示的时间点为半乳糖诱导。星号表示更高分子量的GFP-Mga2p蛋白。（B） GFP-Spt23p的诱导野生型融合蛋白（WT；1-4通道），npl4-1号机组（泳道5-7），npl4-2号机组（8–10车道），cdc48-2型（11–13车道），ufd1-1型（车道14-16），以及转速4Δ（17–19车道）单元温度为25°C。收集细胞，在指示半乳糖诱导的时间点。星号表示高分子量GFP-Spt23p蛋白。（C） 亚细胞的GFP-Spt23p在野生型（WT）中的定位，npl4-1号机组,npl4-2号机组,cdc48-2型,ufd1-1型,和转速4Δ120分钟半乳糖诱导后的细胞25°C。GFP-Spt23p信号在野生型细胞中主要是核质信号，而在突变体中大部分保留ER/核膜菌株。（D） GFP-Spt23p（左）和GFP-Mga2p（右）分别为野生型（WT）免疫沉淀（IP）或npl4-1号机组表达Myc-tagged泛素的酵母全细胞提取物。表达式GFP-Spt23p和GFP-Mga2p的半乳糖（通道2、4、6、8、10、12、14和16），或用之前添加葡萄糖（通道1、3、5、7、9、11、13和15免疫沉淀。在同一凝胶上运行的样品通过以下方法进行分析抗GFP（1-4和9-12车道）或抗Myc（5-8和13-16车道）蛋白质印迹。
图7
图7
中Npl4函数的模型内质网膜结合转录的蛋白酶体依赖性处理因子Mga2p和Spt23p。详情见正文。
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