Nephrocystin interacts with Pyk2, p130(Cas), and tensin and triggers phosphorylation of Pyk2

doi:10.1073/pnas.171269898

.2001年8月14日；98(17):9784-9.

doi:10.1073/pnas.171269898。 Epub 2001年8月7日。

肾胱氨酸与Pyk2、p130（Cas）和张力蛋白相互作用并触发Pyk1的磷酸化

T本兴¹, P Gerke先生, K Höpker公司, F希尔德布兰特, E金, G沃尔兹

附属公司

PMID： 11493697
预防性维修识别码： 5530菲律宾比索
内政部： 10.1073/第171269898页

肾胱氨酸与Pyk2、p130（Cas）和张力蛋白相互作用并触发Pyk1的磷酸化

T本兴等。美国国家科学院程序. 2001.

.2001年8月14日；98(17):9784-9.

doi:10.1073/pnas.171269898。 Epub 2001年8月7日。

作者

T本兴¹, P Gerke先生, K Höpker公司, F希尔德布兰特, E金, G沃尔兹

附属

¹德国弗莱堡79106弗莱堡大学医院肾脏科；以及德国弗莱堡79106弗莱堡大学儿童医院和分子医学。

PMID： 11493697
预防性维修识别码： 5530菲律宾比索
内政部： 10.1073/pnas.171269898

摘要

青少年1型肾病是由编码肾胱氨酸的基因NPHP1突变引起的。肾胱氨酸的功能目前尚不清楚，但Src同源3结构域的存在及其最近描述的与p130（Cas）的相互作用表明肾胱胺酸是局灶黏附信号复合体的一部分。我们制备了肾胱氨酸特异性抗血清，并分析了天然肾胱蛋白与内源性蛋白的相互作用。肾胱氨酸的免疫沉淀显示，肾胱胺酸与p130（Cas）、富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（Pyk2）和张力蛋白形成蛋白质复合物，表明这些蛋白质参与共同的信号通路。肾胱氨酸的表达导致酪氨酸402上Pyk2的磷酸化以及下游有丝分裂原活化蛋白激酶的激活，如ERK1和ERK2。我们的研究结果表明，肾胱氨酸有助于将Pyk2募集到细胞基质粘附中，从而启动Pyk2和Pyk2依赖性信号的磷酸化。功能性肾胱氨酸缺乏可能会损害肾上皮细胞亚群中的Pyk2信号传导。

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图1
肾胱氨酸与Pyk2相互作用。(A类)几个生成标记的肾胱氨酸截短片段，以分析与Pyk2的交互。肾胱氨酸含有几个假定的蛋白质-蛋白质相互作用基序，包括氨基末端线圈-线圈域（coil）和SH3域。(B)肾胱氨酸沉淀Pyk2。HA标记的Pyk2和Flag标记的肾胱氨酸结构物在HEK 293T细胞中表达用特异性抗体沉淀。Western blot分析为用HA特异性抗血清进行(顶部和中部). Pyk2与肾胱氨酸共沉淀，但不含有对照蛋白RGS3(顶部). 互动需要肾胱氨酸的N末端区域，包含SH3域。(中部)HA的表达水平。图中显示了Pyk2。(底部)标记的RGS3和显示了细胞裂解物中的肾胱氨酸结构。(C)Pyk2沉淀肾胱氨酸，但不沉淀对照蛋白GFP(左侧上部); Pyk2沉淀物是显示(左侧下部).(赖特)标记的肾胱氨酸和显示了细胞裂解物中的HA标记的Pyk2。

图2
内源性肾胱氨酸与Pyk2的相互作用。(A类和B)要生成肾胱氨酸特异性抗血清，用a重组MBP融合蛋白，含有肾胱氨酸。特异识别的亲和纯化抗血清融合GST的重组肾胱氨酸和HEK中表达的肾胱胺酸293T细胞，但未能结合重组控制蛋白或肾胱氨酸版本缺少用于免疫的区域。(C和D类)抗血清识别小鼠内源性组织中的肾胱氨酸。测试鼠标是否肾胱氨酸可在胚胎组织、小鼠胚胎中检测到肾脏和睾丸在不同发育阶段被溶解可溶性蛋白在10%SDS/PAGE上分离。西部免疫印迹分析表明，该抗血清能抗人肾胱氨酸检测小鼠肾胱氨酸。(E类)肾胱氨酸与胚胎组织中的Pyk2相互作用。肾胱氨酸用抗血清检测内源性相互作用在胚胎小鼠肾脏和睾丸中的Pyk2和肾胱氨酸之间。胚胎肾脏(赖特)和胚胎睾丸(左侧)收集并均质。裂解物是用对照抗血清或肾胱氨酸特异性抗血清。进行Western blot分析使用Pyk2特异性抗血清。

图3
Pyk2的亚细胞定位及其相互作用肾胱氨酸和Pyk2富含脯氨酸（PR）的区域。(A类)肾胱氨酸调节亚细胞定位Pyk2的。肾小管上皮细胞系IMCD感染了逆转录病毒，指导肾胱氨酸的表达或对照逆转录病毒。肾胱氨酸增加膜相关部分（P100）和降低Pyk2的细胞质分数（S100）。(B)GST和GST。Pyk2 PR固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠，与MBP孵育。NPHP1（1）。NPHP1与GST结合。Pyk2-PR，但不适用于GST。(C)PRNK的共免疫沉淀，一种天然存在的剪接变异体Pyk2，带有全长肾胱氨酸（NPHP1 WT）或C末端截断版本[NPHP1（1）]。(上部)突变Pyk2中的脯氨酸残基859消除了与肾胱氨酸。(下部)野生型和显示了突变的PRNK。

图4
肾胱氨酸触发Pyk2酪氨酸402的磷酸化。(A类)用HA标记的Pyk2转染HEK 293T细胞结合载体控制、肾胱氨酸、SH3含有结构域的适配器蛋白CD2AP，或阳性对照v-Src。哈。Pyk2是用抗HA抗体从血清饥饿的细胞中免疫沉淀出来的抗体；用抗血清检测沉淀物Pyk2的磷酸酪氨酸402(顶部)或者用抗血清揭示了Pyk2的总量(中部).(底部)HA的表达。裂解物中的Pyk2。(B)Pyk2在酪氨酸402上磷酸化表达肾胱氨酸的IMCD细胞。IMCD细胞被感染对照组或表达肾胱氨酸的逆转录病毒。肾胱氨酸诱导内源性Pyk2的酪氨酸402磷酸化IMCD单元(上部)但不影响表达Pyk2水平(下部). (C)全长肾胱氨酸需要触发酪氨酸402的磷酸化表达肾胱氨酸截短的逆转录病毒载体用于感染IMCD细胞。氨基末端缺失[NPHP1（206）]和羧基末端缺失[NPHP1]（1） ]肾胱氨酸未能介导酪氨酸402Pyk2的磷酸化(上部). (下部)显示了Pyk2表达式的级别。(D类)肾胱氨酸激活ERK1/2。双磷酸化ERK1和ERK2在IMCD细胞中可见，用对照载体或用磷酸特异性编码肾胱氨酸的逆转录病毒载体抗血清(上部). 污渍被重新涂上检测ERK1和ERK2总量的抗血清肾胱氨酸特异性抗血清。

图5
肾胱氨酸与p130结合^Cas公司和张力。(A类)为了鉴定肾胱氨酸相互作用蛋白，HEK将293T细胞用对照蛋白GFP、肾胱氨酸、白细胞介素转染，或肾胱氨酸截短NPHP1（1）。之后肾胱氨酸免疫沉淀，分离免疫沉淀在10%SDS/PAGE上，用单克隆抗体染色抗磷酸酪氨酸抗体4G10(左上)，或抗旗帜抗体(左下). A类分子量约为肾胱氨酸沉淀物中检测到220kDa（pp220）。Flag标记的GFP和肾胱氨酸截短的表达水平证明了裂解产物(赖特). HEK 293T细胞缺乏内源性Pyk2，因此Pyk1不是在4G10-标记的沉淀物中可检测到。(B)张力蛋白和p130的共沉淀^Cas公司使用本机胚胎组织中的肾胱氨酸。胚胎肾脏(上部)和胚胎睾丸(下部)是收集并均质。用免疫沉淀法对裂解产物进行沉淀对照或肾胱氨酸特异性抗血清，分离10%SDS/PAGE。Tensin和p130^Cas公司在中检测到使用张力蛋白或第130页^Cas公司-特异性抗体。

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