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.2001年7月23日；154(2):459-68.
doi:10.1083/jcb.200103103。

表皮生长因子（EGF）样重复序列作为EGF受体配体的人腱素-C

C S Swindle公司 1, K T Tran公司, T D约翰逊, P班纳吉, A M梅耶斯, L格里菲斯, A威尔斯
附属公司

人tenascin-C作为EGF受体配体的表皮生长因子（EGF）样重复序列

C S Swindle公司等。 J细胞生物学. .

摘要

通过生长因子受体的信号传递控制着诸如增殖、迁移和分化等多种细胞功能。一个关键问题是如何调节这些受体的激活。这些受体的大多数已知配体（如果不是全部的话）是可溶性因子。然而，由于基质成分具有高度的组织特异性，并且在发育和病理过程中会发生变化，因此有人建议，选择性生长因子受体可能通过与基质成分结合而受到刺激。在此，我们描述了表皮生长因子（EGF）受体（EGFR）的一类新配体，该配体位于tenascin-C的EGF-like重复序列中，tenascin-C是一种在器官发生、发育和创伤修复过程中存在的抗粘附基质组分。以EGFR-依赖的方式选择tenascin-C诱导的有丝分裂和EGFR自磷酸化的EGF-like重复序列。微摩尔浓度的EGF-like重复序列诱导EGFR自磷酸化并激活细胞外信号调节、有丝分裂原激活的蛋白激酶，其水平与已知EGFR配体亚饱和水平诱导的水平相当。当配体被束缚在惰性珠上时，注意到EGFR依赖性粘附，模拟了tenascin-C作为六臂肌的生理相关表现，并表明亲和力的增加类似于整合素配体在表面结合时的亲和力的增加。通过免疫荧光检测与细胞结合的EGF-like重复序列并将EGFR与重复序列交联，进一步建立与EGFR的特异性结合。这两种相互作用在EGF竞争时被消除，并通过EGF样重复序列的二聚化而增强。这种低亲和力的行为对于基质-“系链”配体来说是意料之中的；也就是说，一种从基质起作用的配体，持续地呈现给细胞表面EGF受体，因为它既不能扩散也不能内化和降解。这些数据确定了一类新的“不溶性”生长因子配体和一种新的生长因子受体激活模式。

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数字

图1。
图1。
Tenascin-C EGF样重复序列刺激细胞有丝分裂。（A） WT（黑色）或M（开放）NR6细胞暴露于EGF-like重复蛋白，并且三评估H-胸腺嘧啶掺入。EGF（1 nM）和血清（1%）作为阳性对照（分别用于WT和M NR6细胞）。在以下浓度下使用EGF-like重复蛋白：左栏为2 uM，占1/2；9/10为1 uM；2013年11月12日为4 uM；14分为3微克，每种浓度为该水平的10%和1%（中间和右边的酒吧）。（B） 如前所述，在无血清培养基中对WT NR6细胞进行有丝分裂试验，降低Ten14的浓度。无tx表示未接触配体的细胞。数值为代表三个实验的一个实验的平均值±SD（一式三份）。
图1。
图1。
Tenascin-C EGF样重复序列刺激细胞有丝分裂。（A） WT（黑色）或M（开放）NR6细胞暴露于EGF-like重复蛋白，并且三评估H-胸腺嘧啶掺入。EGF（1 nM）和血清（1%）作为阳性对照（分别用于WT和M NR6细胞）。在以下浓度下使用EGF-like重复蛋白：左栏为2 uM，占1/2；9/10为1 uM；2013年11月12日为4 uM；14分为3微克，每种浓度为该水平的10%和1%（中间和右边的酒吧）。（B） 如前所述，在无血清培养基中对WT NR6细胞进行有丝分裂试验，降低Ten14的浓度。无tx表示未接触配体的细胞。数值为代表三个实验的一个实验的平均值±SD（一式三份）。
图2。
图2。
Tenascin EGF样重复序列激活EGFR激酶级联。用EGF样重复蛋白处理WT（顶部）和M（底部）NR6细胞，并评估EGFR信号传导的激活。（A） 用EGF或EGF-like repeats 1/2（5 uM）、11/12/13（1 uM）或14（6 uM）处理后，通过免疫沉淀EGFR的抗磷酸酪氨酸免疫印迹法测定EGFR的自身磷酸化。用EGFR抗体进行的免疫印迹显示载量相等（数据未显示）。（B） 通过免疫印迹法对双磷酸化p44/p42 ERK的ERK MAP激酶激活进行评估，表明ERK激活。用不同浓度的EGF-like重复序列（5 uM用于1/2；2 uM用于9/10；1 uM用于11/12/13；6 uM用于14）以及这些水平的50和10%处理细胞。EGF和血清被用作阳性对照（分别用于WT和M NR6细胞）。泳道下方的数字表示通过密度计测定的该实验的每个泳道中pEGFR或p42的强度的相对值。在这两个面板中，显示了至少三次测定的代表性实验。
图3。
图3。
EGFR激酶级联激活的差异检测。（A和B）WT NR6细胞在降低高亲和力（EGF，kd～2 nM；左）或低亲和力（Y13G-EGF，kd￣100 nM；右；Reddy等人，1996a）EGFR配体浓度的情况下处理5分钟。用175kD（A）的PY20抗磷酪氨酸抗体免疫印迹法测定EGFR的激活状态，用双磷酸化p44/p42 ERK的免疫印迹评估ERK MAP激酶的激活，表明ERK（B）激活。no-tx表示未接触配体的细胞。（C） 在静止培养基或无血清培养基中用不同浓度EGF或2 uM tenascin 14片段处理WT NR6细胞。两种不同浓度的Ten14来自不同的制剂。ERK MAP激酶活化按B进行评估。在A–C中，显示用于治疗的EGFR配体的浓度（nM）。（D和E）通过降低WT NR6细胞中的衰减机制增强EGFR磷酸化。（D） 在0.1 mM钒酸钠存在下，用EGF（0.1或0.01 nM）或tenascin 14片段（2 uM）处理WT NR6细胞30分钟；EGFR活化状态如A所示。（E）将EGFR配体连接到PEO胶乳上，并测试其诱导EGFR磷酸化的能力。将WT NR6细胞暴露于EGF（10或1 nM下5分钟）、含有tenascin 14片段的珠子复合物（30、120和240分钟）、含EGF的珠子复合体（20和5 ul珠子的30分钟）或对照珠子（30分钟）；EGFR激活状态如A所示进行测定。泳道下方的数字表示通过密度计测定的该实验的每个泳道中pEGFR或p42的强度的相对值。在所有面板中，显示了至少三次测定的代表性实验。
图3。
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EGFR激酶级联激活的差异检测。（A和B）WT NR6细胞在降低高亲和力（EGF，kd～2 nM；左）或低亲和力（Y13G-EGF，kd￣100 nM；右；Reddy等人，1996a）EGFR配体浓度的情况下处理5分钟。用175kD（A）的PY20抗磷酪氨酸抗体免疫印迹法测定EGFR的激活状态，用双磷酸化p44/p42 ERK的免疫印迹评估ERK MAP激酶的激活，表明ERK（B）激活。no-tx表示未接触配体的细胞。（C） 在静止培养基或无血清培养基中用不同浓度EGF或2 uM tenascin 14片段处理WT NR6细胞。两种不同浓度的Ten14来自不同的制剂。ERK MAP激酶活化如B所示。在A–C中，用于治疗的EGFR配体的浓度为nM。（D和E）通过降低WT NR6细胞中的衰减机制增强EGFR磷酸化。（D） 在0.1 mM钒酸钠存在下，用EGF（0.1或0.01 nM）或tenascin 14片段（2 uM）处理WT NR6细胞30分钟；EGFR活化状态如A所示。（E）将EGFR配体连接到PEO胶乳上，并测试其诱导EGFR磷酸化的能力。将WT NR6细胞暴露于EGF（10或1 nM下5分钟）、含有tenascin 14片段的珠子复合物（30、120和240分钟）、含EGF的珠子复合体（20和5 ul珠子的30分钟）或对照珠子（30分钟）；EGFR激活状态如图A所示。车道下方的数字表示通过密度测定法确定的每个车道中pEGFR或p42的相对强度值。在所有面板中，显示了至少三次测定的代表性实验。
图4。
图4。
抑制EGFR激活可阻止EGF样重复的信号传递。（A） 用tenascin EGF样重复序列以激活ERK MAP激酶的浓度（5μM用于1/2；1μM用于11/12/13；6μM用于14）处理WT NR6细胞。在缺乏（−）或存在（+）EGFR-特异性药物抑制剂PD153035的情况下，用EGF-like重复蛋白处理细胞。没有tx代表没有配体。（B） 在无血清条件下，使用Ten14（1 uM）或EGF（0.01 nM）在存在（+）或不存在（−）EGFR胞外区特异性抗体（克隆528；钙生物化学）的情况下处理WT NR6细胞。（C） 在无血清条件下，用tenascin 14重复序列（2 uM）对表达WT EGFR的B82细胞进行攻击。车道下方的数字表示通过密度测定法确定的每个车道中p42的相对强度值。所示为三个实验之一。
图5。
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呈现栓系tenascin 14片段的珠与EGFR结合。用tenascin 14或EGF或对照珠栓接的珠在37°C下处理WT NR6细胞4小时。细胞用冰冻PBS清洗三次，并用相控显微镜观察（上图）。同时，用5 ug/ml抗EGFR抗体（克隆528；Sunada等人，1986；Turner等人，1996）处理细胞15分钟，然后添加珠子并持续4小时（底部）。珠子主要在细胞平面上方呈现为明亮、折射和半透明的球体。所示为三个实验之一。
图6。
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Tenascin 14与EGFR-表达的WT NR6细胞结合。（A） 将WT NR6细胞静止24小时，并暴露于不同浓度的单体或二聚配体中，以观察与EGFR的结合。将从与Ten14相同的载体（pRSETA；Invitrogen）中表达的Ten14和mEGF-His6与识别NH的单克隆抗HisG（Invitrogen）抗体孵育过夜以进行二聚反应2-mEGF-His6和Ten14的末端多聚His表位。mEGF-His6和单克隆抗HisG抗体的浓度分别为50 nM和25 nM，以及2 uM Ten14和0.63 uM抗体（Ab），以增加与受体的亲和力。在固定之前，配体在室温下孵育10分钟。将与俄勒冈州绿结合的1:500的山羊抗鼠抗体用作二级抗体，然后用荧光显微镜进行观察，并用SPOT II CCD相机在恒定曝光下进行拍摄。a、 mEGF-His6（50 nM）；b、 mEGF-His6（50 nM）与一抗二聚体（25 nM）；c、 细胞与EGF（100 nM）预孵育5分钟，以与抗体（25 nM）二聚化的mEGF-His6（50 nM）竞争EGFR；d、 Ten14（2μM）；e、 Ten14（2 uM）与一抗二聚体（0.63 uM）；f、 用EGF（100 nM）预孵育细胞5分钟，用Ten14（2 uM）预培养细胞，随后添加0.63 uM抗体。（B） 对四个随机选择的区域中的每个细胞进行概述，并测量其亮度，与背景进行比较。数据是每个实验条件下平均>25个细胞的平均±SE。通过Student’s进行统计分析吨测试。双星号表示P（P）< 0.01. 所示为两组实验中的一个代表。
图6。
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Tenascin 14与EGFR-表达的WT NR6细胞结合。（A） 将WT NR6细胞静止24小时，并暴露于不同浓度的单体或二聚配体中，以观察与EGFR的结合。将从与Ten14相同的载体（pRSETA；Invitrogen）中表达的Ten14和mEGF-His6与识别NH的单克隆抗HisG（Invitrogen）抗体孵育过夜以进行二聚反应2-mEGF-His6和Ten14的末端多聚His表位。mEGF-His6和单克隆抗HisG抗体的浓度分别为50 nM和25 nM，以及2 uM Ten14和0.63 uM抗体（Ab），以增加与受体的亲和力。在固定之前，配体在室温下孵育10分钟。在通过荧光显微镜进行可视化之前，使用与俄勒冈绿缀合的1:500山羊抗小鼠抗体作为第二抗体，并通过SPOT II CCD相机在恒定曝光下捕获。a、 mEGF-His6（50 nM）；b、 mEGF-His6（50 nM）与一抗二聚体（25 nM）；c、 细胞与EGF（100 nM）预孵育5分钟，以与抗体（25 nM）二聚化的mEGF-His6（50 nM）竞争EGFR；d、 2014年10月（2 uM）；e、 Ten14（2 uM）与一抗二聚体（0.63 uM）；f、 用EGF（100 nM）预孵育细胞5分钟，用Ten14（2 uM）预培养细胞，随后添加0.63 uM抗体。（B） 对四个随机选择的区域中的每个细胞进行概述，并测量其亮度，与背景进行比较。数据是每个实验条件下平均>25个细胞的平均±SE。通过Student’s进行统计分析吨测试。双星号表示P（P）< 0.01. 所示为两组实验中的一个代表。
图7。
图7。
Tenascin 14可以交联到EGFR。将Ten14（2 uM）和mEGF（mEGF-His6；10 nM）结合并化学交联至静止的WT NR6成纤维细胞，并从随后的含有抗-HisG的裂解液中进行免疫沉淀。用各自的抗体通过免疫印迹来评估EGFR（A）或胰岛素受体β链的存在。在通道1和通道2中，细胞与100 nM EGF预孵育5分钟，并在整个交联过程中作为竞争性配体。在通道5中，细胞暴露于抗体并与抗体交联，裂解物被免疫沉淀。从左到右：1，EGF/mEGF-His6（用EGF预处理并添加mEGF-His配体）；2、EGF/Ten14（用EGF预处理并添加Ten14配体）；3，mEGF-His6（10nM）；4、2014年10月（2 uM）；5、IgG（抗HisG抗体）；6、无tx（无配体处理）；和7，细胞裂解物（WT NR6裂解物）。所示为两个实验的代表。
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