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.2001年5月28日；153（5）：1011-22。
doi:10.1083/jcb.153.5.1011。

GADD34介导的eIF2α去磷酸化对未折叠蛋白反应的反馈抑制

I诺沃亚 1, H曾, H P Harding公司, D罗恩
附属公司

GADD34介导的eIF2α去磷酸化对未折叠蛋白反应的反馈抑制

I诺沃亚等。 J细胞生物学. .

摘要

真核生物翻译起始因子2（eIF2alpha）α亚基在丝氨酸51上的磷酸化将一般翻译抑制与应激诱导基因（如ATF4、CHOP和BiP）在未折叠蛋白反应中的激活结合在一起。我们试图通过筛选重组逆转录病毒文库中抑制CHOP：：GFP报告基因表达的克隆来鉴定磷酸化eIF2alpha依赖性信号通路中的新基因。编码生长停滞和DNA损伤基因（GADD）COOH末端34的逆转录病毒，也称为MYD116（Fornace，A.J.，D.W.Neibert，M.C.Hollander，J.D.Luethy，M.Papathanasiou，J.Fragoli，and N.J.Holbrook.1989）。分子细胞。生物学：9:4196-4203；K.A.勋爵、B.霍夫曼-利伯曼和D.A.利伯曼。1990年。核酸研究18:2823）被分离出来，并发现通过内质网中的蛋白质畸形和氨基酸剥夺来减弱CHOP（也称为GADD153）的激活。尽管同源应激诱导的eIF2α激酶PERK（也称为PEK）和GCN2活性正常，但在GADD34过度表达细胞中磷酸化eIF2 alpha水平显著降低。GADD34与蛋白磷酸酶1催化亚基（PP1c）形成复合物，在体外特异性促进eIF2α的去磷酸化。干扰与PP1c相互作用的突变阻止了eIF2α的去磷酸化，并阻止了GADD34对CHOP的衰减。GADD34的表达具有应激依赖性，在PERK（-）/-和GCN2（-）/-细胞中不存在。这些发现表明，GADD34介导的eIF2α去磷酸化在负反馈回路中抑制应激诱导的基因表达，并可能促进未折叠蛋白反应中翻译抑制的恢复。

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数字

图1
图1
A1是GSE衰减CHOP公司内质网应激和氨基酸剥夺表达。（A） 用FACS分析GFP表达水平®作为父母CHOP：：GFP-包含CHO细胞和在由A1逆转录病毒克隆转导的细胞中。细胞未经处理并在完整培养基（UT）中培养，在缺乏亮氨酸（−Leu）的培养基中培养16 h，或暴露于衣霉素（2μg/ml）中16 h（Tm）。与未经处理的细胞相比，GFP增加了一倍。（B） 暴露于衣霉素（2μg/ml）或无亮氨酸培养基（上面板）后，亲代和A1转导细胞中内源性CHOP的免疫印迹。同一膜的抗-eIF2α免疫印迹可作为蛋白质负荷的控制（下面板）。
图2
图2
A1 GSE干扰激活商业保险和自动变速箱4在UPR中。（A） 衣霉素处理的亲代和A1转导的CHO细胞中ATF4的免疫印迹（上面板）。同一膜的抗-eIF2α免疫印迹可作为蛋白质负荷的控制（下面板）。（B） 衣霉素处理的亲代和A1转导的CHO细胞RNA的Northern印迹。将该印迹依次与商业保险A1逆转录病毒的插入物，以及GAPDH公司放射性标记探针。
图3
图3
A1 GSE干扰eIF2α磷酸化和下游信号传导，但不阻断eIF2β激酶PERK和GCN2的应激激活。（A） 用衣霉素（2μg/ml，Tm）或他吡加金（100 nM，Tg）处理后，从亲代细胞和A1转导细胞中沉淀的PERK免疫印迹（上图）。蛋白质（PERK）的高迁移率、非活性形式的位置0)蛋白质的磷酸化活性形式（P-PERK）流动性较低。用抗血清检测丝氨酸51（P-eIF2α）磷酸化eIF2β或总eIF2γ的同一裂解物的免疫印迹。（B） GCN2免疫印迹从在缺乏亮氨酸的培养基（−Leu）中培养的亲代细胞和A1转导细胞中沉淀。GCN2通过免疫印迹法显示，抗血清检测磷酸化的活性形式的激酶（P-GCN2），或与所有形式的激酶反应的抗血清（GCN2，上部面板）。使用与A中相同的eIF2α抗血清对相同的裂解物进行免疫印迹（下面板）。（C） 用DTT（2 mM）处理指定时间段以快速诱导内质网应激的亲代和A1-转导CHO细胞的全细胞裂解物SDS-PAGE凝胶的放射自显影术[35S] 蛋氨酸。下图显示了相同凝胶的考马斯蓝染色，以控制泳道的相等负载。（D） 传真®A1转导或亲代GFP活性分析CHOP：：GFPCHO细胞模拟转染或转染表达质粒，表达质粒仅编码CD2细胞表面标记、CD2和野生型eIF2α（eIF2重量)或CD2和S51D突变型eIF2α（eIF2S51D系列). 注意双阳性（CD2）人群+和GFP+)细胞仅存在于用突变体eIF2α转染的池中（矩形）。
图4
图4
GADD34抑制UPR中CHOP的激活。（A） FACS公司®CHO细胞表达CHOP：：GFP报告人和转染CD2表达质粒，该质粒可与小鼠GADD34的指定衍生物、A1 GSE或无其他蛋白共存。用衣霉素（2μg/ml，16 h）处理细胞以激活CHOP：：GFP注意，转染A1、野生型GADD34和GADD34ΔN的细胞池中存在CD2-阳性和GFP-阴性细胞（矩形）。（B） 用编码FLAG-tagged A1或GADD34的表达载体转染小鼠胚胎成纤维细胞，以及GADD34指示缺失突变体进行免疫染色。用衣霉素（2μg/ml，8 h）处理细胞，并用检测重组蛋白的FLAG抗体和检测内源性CHOP的CHOP抗血清进行免疫染色。亲核染料H33258可将田里所有细胞的细胞核染色。箭头标记了表达重组GADD34蛋白的细胞。（C） 表达全长小鼠GADD34或ΔN缺失的转染细胞的高倍（60倍）视图。通过FLAG表位标签的免疫染色显示重组蛋白。
图5
图5
表达GADD34的细胞增加了指向eIF2α的磷酸酶活性。（A） 通过表达A1 GSE或小鼠GADD34 COOH末端片段（GADD34ΔN）的细胞裂解物显示放射性标记eIF2α的体外去磷酸化。用GST-PERK在丝氨酸51上对兔网织红细胞裂解物中的eIF2α进行体外放射标记，并与表达所示GADD34衍生物的CHO细胞裂解物孵育指定时间。在SDS-PAGE上显示了放射性标记的eIF2α（P-eIF2 a）、GST-PERK（P-PERK）和网织红细胞裂解物（P-p110）中存在的一种未识别的110 kD磷酸蛋白的位置。后两者用作eIF2α去磷酸化活性特异性的对照。与eIF2α相关的放射性信号以任意单位量化（eIF232P计数）。（B） 放射性标记eIF2α的体外去磷酸化的自体放射自显影图，由转染表位标记的全长小鼠GADD34（FLAG-GADD34）或A1 GSE（FLAG-A1 GSE）或模拟转染细胞（mock Tx）的293T细胞免疫沉淀复合物显示。在不存在或存在磷酸酶抑制剂（2μM冈田酸，+OA）的情况下进行体外去磷酸化测定。
图6
图6
GADD34抑制CHOP表达需要与PP1相互作用。（A） 小鼠GADD34的结构。保守的重复基序被孵化，COOH末端区域与HSV序列相似γ134.5为黑色，并且推测与PP1c相互作用的肽基序为灰色。（B） FACS公司®CHO细胞表达CHOP：：GFP报告人和转染CD2表达质粒，该质粒可与小鼠GADD34的指定衍生物、A1 GSE或无其他蛋白共存。用衣霉素（2μg/ml，16 h）处理细胞以激活CHOP：：GFP注意，转染A1、GADD34、GADD34-ΔN和GADD34（aa 485-657）的细胞池中存在CD2-阳性、GFP-阴性细胞（矩形），但GADD34的COOH末端缺失（aa 1-536、241-562、241-536）或V549E突变形式中没有。（C）抗-FLAG免疫沉淀，然后对转染有FLAG标记的GADD34和B中所示衍生物的细胞裂解液中的蛋白质进行免疫印迹。免疫沉淀中的重组蛋白质用FLAG表位抗体进行免疫印记检测（上图），用特异性多克隆血清检测共免疫沉淀内源性PP1c。沉淀免疫球蛋白重链和轻链以及PP1c带的位置用箭头表示。（D） 体外磷酸化eIF2α的自身放射图32丝氨酸51上的P（P-eIF2α）与转染细胞的裂解物孵育15分钟后，如C中所示（上面板）。标有“-lysate”的车道报告32P–eIF2α信号来自在没有裂解物的情况下在相同条件下培养的样品。The radioactivity signal of the32PeIF2α以以下任意单位量化（eIF2α32P计数）。来自的信号的自动射线图32PGST-PERK和在制备32PeIF2α和用作磷酸酶活性的对照底物（下面板）。
图7
图7
GADD34的表达依赖于应激诱导的eIF2α激酶。野生型细胞GADD34和GAPDH mRNA的Northern blot分析PERK公司负极/负极电池，以及（C）GCN2−/−细胞。将细胞暴露于衣霉素（Tm，2μg/ml）、烷基化剂MMS（100μg/ml。
图8
图8
描述GADD34通过整合应激反应途径抑制信号传导的作用的模型。GADD34由eIF2α激酶PERK和GCN2转录诱导。它与PP1c结合，降低eIF2α磷酸化水平，并在途径上负反馈。ATF4是一种通过eIF2α磷酸化翻译激活的转录因子，在整合应激反应中CHOP的转录激活中发挥作用（Harding等人2000a）。我们不知道它是否在GADD34公司激活，因此它由阴影字体显示。
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