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.2016年11月3日；64(3):549-564.
doi:10.1016/j.molcel.2016.09.013。 Epub 2016年10月13日。

SMAD3通过PCBP1直接调控选择性剪接对TGF-β的促肿瘤作用至关重要

维努·特里帕西 1, 凯瑟琳·M·西特 1, 邵建高 2, 徐宣 1, Jing Huang（黄晶） 三, 罗伯托·威格特 1, 明州 4, 张颖 5
附属公司

SMAD3通过PCBP1直接调控选择性剪接对TGF-β的促肿瘤作用至关重要

维努·特里帕西等。 分子电池. .

勘误表in

摘要

在癌症晚期，TGF-β与受体酪氨酸激酶途径的输入共同促进肿瘤进展。然而，支持信号合作和将TGF-β从有效的生长抑制剂转化为肿瘤促进剂的机制尚不完全清楚。我们在这里报道，TGF-β通过SMAD3介导的磷酸化T179与RNA-结合蛋白PCBP1的相互作用直接调节肿瘤干细胞标记CD44的选择性剪接。我们发现TGF-β和EGF分别诱导SMAD3和PCBP1在SC35阳性核斑点中共定位，这两种蛋白在CD44前体mRNA可变外显子区域相互作用，抑制剪接体组装，有利于在上皮亚型CD44E上表达间充质亚型CD44。我们进一步表明，SMAD3介导的选择性剪接对TGF-β的促肿瘤作用至关重要，并且对有助于上皮-间质转化和转移的基因的蛋白产物具有全局影响。

关键词：CD44；EMT；PCBP1；SMAD3；转化生长因子-β；选择性拼接；转移。

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数字

图1
图1。转化生长因子β介导的侵袭需要SMAD3 T179磷酸化
A： 正常乳腺上皮细胞MCF-10A和各种癌细胞中SMAD3的磷酸化。SMAD3 pT179抗体识别SMAD2 pT220（上带）和SMAD3 p T179（下带）。B： 生成稳定的SMAD3敲低HeLa细胞和SMAD3表达被shSMAD3耐药、F-SMAD3（WT）或F-SMAD2（TV）结构挽救的细胞。C： HeLa细胞中p21、MYC、Vimentin和TWIST mRNA的qRT-PCR分析。未处理细胞的相对表达水平标准化。数据显示为平均值±S.D.（n=3），并显示shNS细胞的统计显著性。*，p<0.02；**，p<0.002。D： 携带各种SMAD3载体的HeLa细胞的侵袭检测。定量数据显示为平均值±S.D.（n=3）。经处理与未经处理的样品（黑色*）以及经TGF-β和EGF处理的样品与仅经TGF--β的样品（红色*）的统计显著性（p<0.02）。E： TGF-β和EGF治疗3天后，携带各种SMAD3载体的MCF10A细胞中E-Cadherin和N-Cadherin的表达。F： TGF-β和EGF处理4天后，MCF10A细胞F-肌动蛋白（指骨样蛋白）和E-Cadherin的免疫荧光染色。棒材=20µm。G： 尾静脉注射各种HeLa细胞的裸鼠肺切片的H&E染色。横条=5 mm。右侧显示了每只动物的肺转移结节数，表示为平均值±标准偏差（n=10）。另请参见图S1。
图2
图2。SMAD3和PCBP1之间的磷酸化依赖相互作用
A： SMAD3和PCBP1在用指示生长因子处理2小时的HeLa细胞中的核和胞浆分布。GAPDH和Lamin B分别用作细胞质（C）和核（N）特异性蛋白标记物。B： 使用固定化SMAD3 T179或pT179肽对从HeLa细胞核提取物中分离的PCBP1进行Western blot。C： 经TGF-β和/或EGF处理2小时的HeLa细胞全细胞提取物（WCE）中SMAD3免疫沉淀（IP）后SMAD3和PCBP1的蛋白质印迹。E:用TGF-β或TGF-？和EGF处理HeLa细胞2小时后，SMAD3和PCBP1的免疫荧光染色。黄色表示共定位。棒材=10µm。F： SMAD3与（E）中PCBP1共定位系数的散点图。数据显示为平均值±SD（n=25）。G HeLa细胞细胞核中SMAD3和PCBP1的邻近连接分析（PLA）。TGFβ或TGFβ和EGF联合处理2小时。Bar=20µm。H： TGF-β和EGF处理2小时后，对各种标记SMAD3突变体进行IP-Western分析，以结合HeLa细胞中的内源性PCBP1这足以阻止GSK3β磷酸化（顶部）降低经TGF-β和EGF处理2小时的HeLa细胞中SMAD3对PCBP1的亲和力（底部）。另请参见图S2。
图3
图3。PCBP1和SMAD3依赖的CD44亚型在TGF-β和/或EGF治疗后转换
A： 使用一对引物在单个RT-PCR反应中检测HeLa细胞中的CD44E和CD44s。生长因子治疗24小时。B:qRT-PCR分析使用特定引物对HeLa细胞中的CD44总mRNA、前mRNA、CD44s或CD44E mRNA。C： HeLa细胞CD44可变外显子使用的qRT-PCR分析。D： Western blot显示HeLa细胞中PCBP1下调。E： RT-PCR检测A.HeLa细胞中的CD44s和CD44E，如TGF-β和EGF处理72小时。F:qRT-PCR分析TGF-。G： 经TGF-β和EGF处理的HeLa细胞CD44可变外显子使用的qRT-PCR分析。H： TGF-β和EGF-Ⅰ处理的HeLa细胞中不同CD44 RNA的qRT-PCR分析：TGF-。J： HeLa细胞CD44亚型细胞表面表达的FACS分析。用TGF-β和EGF处理细胞72小时。对于qRT-PCR，相对表达水平归一化为未处理细胞（Un）；可变外显子用法定义为可变外显基因与标准外显基因2的比值。所有条显示为平均值±SD（n=3）。黑色*表示处理和未处理样本之间的统计显著性（p<0.02）；红色*表示用TGF-β和EGF或EGF处理的样品与仅用TGF--β处理的样品（B）的统计显著性（p<0.02），或表达shPCBP1的样品与表达shNS（F）的样品，或表达SMAD3 WT或TV的样品与表示shSMAD3（H）的样品的统计学显著性。另请参见图S3。
图4
图4。CD44选择性剪接的SMAD3调节与其转录活性无关
A-D：实时分析DRB-同步化HeLa细胞选择性CD44外显子的新生RNA转录（蓝线）和剪接（红线）。数据显示为平均值±标准差（n=3），*表示转录和剪接之间的统计学显著性（p＜0.02）。E-F:ChIP分析用TGF-β处理2小时的HeLa细胞中不同CD44基因组区域的RNAPII（E）或SMAD3（F）结合。数据显示为平均值±SD（n=3）。SMAD7启动子被用作SMAD3与DNA结合的阳性对照。G： Western blot显示HeLa细胞中SMAD4敲除。H： TGF-β和EGF处理的shSMAD4表达HeLa细胞中不同CD44 RNA的qRT-PCR分析。数据如图3所示。一： 经TGF-β和EGF处理的shSMAD4-表达HeLa细胞CD44可变外显子使用的qRT-PCR分析。数据如图3所示。另请参见图S4。
图5
图5。CD44前体mRNA可变外显子区SMAD3和PCBP1复合物的形成阻止了剪接体组装
A： 生长因子处理2小时后，RIP测定HeLa细胞中SMAD3和PCBP1与CD44前体mRNA结合。B-C:qRT-PCR分析HeLa电池中SMAD3B和PCBP1C的RIP测定。D-E:qRT-PCR分析CLIP分析HeLa细胞中CD44前mRNA的SMAD3（D）或PCBP1（E）与内含子-外显子连接（红色表示可变内含子-内显子连接）的结合。F： CLIP分析用于控制HeLa细胞中CD44前mRNA的非特异性IgG以及与内含子-外显子连接（红色表示可变内含子-内显子连接）结合的U2AF2或PRP6。G： 表达不同载体并经生长因子处理2小时的HeLa细胞全细胞提取物（WCE）中U2AF2的IP-Western分析。所有条显示为平均值±SD（n=3）。经治疗（2小时）与未经治疗的样品（黑色*）以及经TGF-β和EGF治疗的样品与单独使用TGF-？的样品（红色*）的统计显著性（p<0.02）。另请参见图S5。
图6
图6。间充质CD44s亚型是细胞侵袭和转移所必需的
A： FACS分析携带不同CD44表达载体的HeLa细胞中不同CD44亚型的细胞表面表达。RFI：平均相对荧光强度。B： 携带不同CD44表达载体的HeLa细胞的侵袭试验。量化数据显示为平均值±S.D.（n=3），*表示对应shNS对照细胞的统计显著性（p<0.02）。C： Western分析携带各种CD44表达载体的HeLa细胞中的间充质标志物波形蛋白、CTGF和MMP2。用TGF-β和EGF处理细胞3天。D： 裸鼠尾静脉注射携带各种CD44表达载体的HeLa细胞的肺切片的H&E染色。Bar=10 mm。右侧显示了每只动物的肺转移结节数，为平均值±SD（n=10）。另请参见图S6。
图7
图7。HeLa细胞全基因组选择性剪接（AS）事件的鉴定
A： 未处理细胞与TGF-β和EGF处理细胞（72小时）之间差异调节AS事件的饼图，总计384例（FDR≤5%，Δψ≥15%，n=3）。SE：跳过外显子；RI：保留内含子；MXE：相互排斥的外显子；A5SS：备选5'拼接位置；A3SS：备选3'拼接位置。还列出了外显子包含和外显子跳过SE事件的数量。B： 在A.中确定的受影响基因的灵巧途径分析显著丰富了与EMT和细胞运动相关的信号途径。P值（-log10）显示在X轴上。切断(p≤0.02)在图表中以虚线显示。C： TGF-β和EGF联合治疗和TWIST过度表达诱导的重叠跳跃外显子（SE）事件的文氏图。163例SE事件（Shapiro等人，2011年）被用于比较，因为使用我们的分析管道分析原始RNA-seq数据得出的SE事件数量要少得多。D： 代表性RNA-seq在CD44位点读取。T+E：TGF-β和EGF处理细胞72小时。橙色矩形标记可变外显子区域的位置。E： TGF-β和EGF处理在稳定表达shNS、shPCBP1或shSMAD3载体的HeLa细胞中诱导的差异调节AS事件数。F： 九个SE事件的qRT-PCR验证。单个基因的可选外显子与恒定外显子的比率显示为平均值±S.D.（n=3），*表示治疗（72小时）和未治疗样本之间的统计显著性（p<0.02）。另请参见图S7。
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