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.2005年6月1日；25(22):5455-63.
doi:10.1523/JNEUROSCI.5123-04.2005。

ProBDNF通过激活p75NTR和sortilin的受体复合物诱导神经元凋亡

亨利·K·滕 1, 肯尼思·邓, 拉米·李, 桑德琳·赖特, Seema Tevar公司, 拉米罗·D·阿尔梅达, Pouneh Kermani公司, 里萨·托金, 陈哲余, 弗朗西斯·S·李, 罗斯玛丽·T·克莱默, 安德斯·尼克贾尔, 芭芭拉·L·亨普斯特德
附属公司

ProBDNF通过激活p75NTR和sortilin的受体复合物诱导神经元凋亡

亨利·滕等。 神经科学. .

摘要

脑源性神经营养因子（BDNF）在TrkB受体酪氨酸激酶介导的神经元存活、分化和突触调制中发挥着关键作用。BDNF通过激活p75NTR也被证明具有发育调节性死亡信号。由于最近的研究表明，NGF的前体形式proNGF在与p75NTR和辅助受体sortilin结合后，在诱导细胞凋亡方面比成熟NGF更活跃，我们询问BDNF的前体（proBDNF）是否也是神经系统中的促凋亡配体。proBDNF由培养的神经元分泌，重组的proBDNF-与sortilin结合。在同时表达sortilin和p75NTR的交感神经元中，我们发现proBDNF是一种凋亡配体，在亚毫摩尔浓度下诱导死亡。相反，成熟的BDNF（而非前BDNF）在诱导TrkB磷酸化方面是有效的。proBDNF的作用依赖于p75NTR和sortilin的细胞共表达，因为p75NTR-缺陷的神经元对proBDNF-诱导的凋亡具有抵抗力，而sortilin-竞争性拮抗剂可阻断交感神经元死亡。此外，添加预先形成的可溶性sortilin和proBDNF复合物未能诱导sortilin-和p75NTR共存的细胞凋亡，这表明需要proBDNF-与细胞表面的两种受体相互作用来启动细胞死亡。结合我们过去的发现，这些数据表明，神经营养因子家族能够通过对原神经营养因子的不同处理来调节不同的生物过程。

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数字

图1。
图1。
前BDNF由培养的皮层神经元释放。A类，前BDNF抗血清的特异性。将来自293个感染了腺-BDNF的细胞的培养基与与Sepharose偶联的proBDNF特异性IgY（proBDNF-IP）或未包含IgY的偶联反应（对照IP）的类似处理的Sepharoze培养。免疫沉淀蛋白用SDS-PAGE分离，用抗成熟BDNF进行Western blot。B类，条件培养基（40 ml，1×108细胞）和来自培养皮层神经元的洗涤剂裂解物（2 mg；在RIPA缓冲液中制备）用抗-proBDNF-偶联Sepharose珠免疫沉淀。用SDS-PAGE分离免疫沉淀蛋白，并用抗成熟BDNF抗血清进行Western blot。proBDNF的位置以及分子量标记（以千道尔顿为单位的数字）均已显示。IP，免疫沉淀。
图2。
图2。
原BDNF和成熟BDNF的纯化。A类,B类，编码BDNF-His的重组腺病毒(A类)或proBDNF-His(B类)被用于感染HEK 293细胞，条件培养基用Ni-chromography纯化。通道1，色谱前的条件培养基。第2车道，立柱贯通。第3道，柱洗。第4道，柱洗脱液。通道5，柱洗脱液进行银染色分析。C类，从杆状病毒感染的昆虫细胞培养基中纯化proBDNF-His。泳道1，色谱前的条件培养基。第2车道，立柱贯通。第3道，柱洗。第4道，柱洗脱液。通道5，柱洗脱液进行银染色分析。D类，ProBDNF-His柱洗脱液（来自4号通道，B类)用BDNF原域特异性抗体进行复制。E类，从293个表达前BDNF-His的细胞中提取培养基，并使用Ni-chromography进行纯化。在没有或有的情况下孵育纯化的蛋白质N个-在20°C条件下，糖酶（25 mU/ml）持续12 h。通过添加SDS样品缓冲液和煮沸终止反应。蛋白质通过SDS-PAGE分离，并用抗成熟BDNF进行蛋白质印迹。适用时，proBDNF、成熟BDNF及其脱糖形式的位置用箭头表示。WB，蛋白质印迹。
图3。
图3。
分泌的前BDNF是二聚体。如前所述，使用阳离子交换色谱纯化来自重组腺病毒感染细胞培养基的ProBDNF（非His-tag）。通过Superdex 200凝胶过滤在25m内分离纯化的proBDNF米三氯甲烷，pH 7.0，200 m米氯化钠。用抗BDNF抗血清进行Western blotting分析显示的组分。顶部，proBDNF洗脱曲线的色谱图。天然分子量标准用箭头表示。洗脱后的proBDNF峰（箭头）的计算分子量为68 kDa。含有proBDNF的洗脱液的底部Western blot（WB）。
图4。
图4。
ProBDNF与sortilin结合。A类，proBDNF与sortilin结合的表面等离子体共振分析。纯化的细胞外区域的sortilin固定在生物传感器芯片上（120 fmol/mm2)然后用从杆状病毒感染的昆虫细胞培养基中纯化的proBDNF在指定浓度下培养。记录开关频率，并计算Kd日指示值。抑制proBDNF（10 n米)与sortilin结合10μ米显示神经降压素（NT），以及仅用稀释剂获得的反应单位。B类293个稳定表达proBDNF-His的细胞被表达GFP或可溶性sortilin的腺病毒（Ad）感染。在感染后2天，收获细胞裂解物，并用sortilin抗血清进行免疫沉淀（IP）。免疫沉淀蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并用抗皮质素（顶部面板）或抗成熟BDNF（底部面板）抗血清进行Western blot。细胞裂解物被溶解，同时进行蛋白质印迹。WB，蛋白质印迹。
图5。
图5。
分泌的sortilin减少了proBDNF的降解。将感染表达GFP或可溶性sortilin的腺病毒（Ad）的293细胞的条件培养基与表达前BDNF His的细胞的条件培养基混合（4℃下4小时）。然后将这些混合物与指定浓度的纤溶酶孵育1 h，然后使用抗皮质素（顶面板）或抗BDNF（底面板）抗血清进行SDS-PAGE和Western blot分析。
图6。
图6。
成熟BDNF在诱导TrkB活化方面比proBDNF更有效。通过镍色谱法纯化分泌的前BDNF His或成熟的BDNF His。A类表达TrkB的PC12细胞在无血清培养基中培养6 h，然后用1 n米成熟BDNF，1 n米制备细胞裂解物，并用抗Trk抗血清免疫沉淀（IP），然后用SDS-PAGE和蛋白印迹（WB）标记所示抗血清。B类在含有1%血清的培养基中，用或不用前BDNF-His、成熟BDNF-Hi或商业成熟BDNF处理TrkB-表达的PC12细胞。48小时后，一名对治疗条件一无所知的观察者对含神经细胞的百分比进行了评分。误差条表示从两个独立实验中获得的值。
图7。
图7。
Sortilin和p75NTR公司是促BDNF凋亡作用所必需的。A类，将培养的大鼠SCG神经元与成熟BDNF或前BDNF孵育48 h。然后固定培养物并用Tuj1（红色）进行免疫组织化学处理，然后进行TUNEL分析（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺，100μm。B类在有或无20μg米神经降压素如图所示。48小时后，对细胞进行TUNEL分析，如A类在每种培养条件下对TUNEL阳性神经元的百分比进行评分。然后将这些数字归一化为那些被剥夺NGF的神经元（在不同的实验中变化在10%到20%之间）。误差条表示三个独立进行的实验的SEM。统计显著性(第页<0.05）每个配对样本之间用星号表示。C类，来自p75的交感神经元NTR公司-如前所述，建立了空白或野生型（WT）小鼠（Bamji等人，1998年）。复制培养物的处理方式与B类并进行TUNEL分析。误差条表示三个独立进行的实验的SEM。统计显著性(第页<0.05）配对样本之间用星号表示。
图8。
图8。
前BDNF和前BDNF-可溶性sortilin复合物对神经元凋亡的影响。将稳定表达proBDNF-His的293个细胞的条件培养基与感染了编码GFP的腺病毒（第1道）或可溶性考替林（第2道）的细胞的条件化培养基在4°C下培养4小时。通过镍色谱法纯化ProBDNF和ProBDNF-皮质醇复合物。A类用SDS-PAGE对洗脱液进行分离，并用抗皮质素（顶部）或抗BDNF（底部）抗血清进行Western blot。可溶性sortilin和proBDNF的位置显示在右侧（箭头）。B类，用所示配体处理大鼠SCG神经元，并进行TUNEL分析，如图7所示B类误差条表示三个独立进行的实验的SEM。在适用的情况下，给出了指示样本对之间的统计显著性。
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