多区域测序揭示肿瘤内异质性和分支进化

体细胞突变的鉴定和验证

对于患者1，我们对来自原发肿瘤（PreP）和胸壁转移（PreM）预处理活检样本的DNA进行了外显子-捕获多区域测序，这些样本是肾切除标本（R1至R9）的九个原发肿瘤区域，肾切除标本的肾周脂肪转移（M1），切除的胸壁转移瘤的两个区域（M2a和M2b）和生殖系DNA¹⁹(图2A). 该序列的平均覆盖率为74次读取(表1在中补充附录). 对改变蛋白质氨基酸序列的非同义体细胞点突变、插入和缺失（indels）进行筛选和手动审查，以消除测序和比对错误，并确定突变的区域分布。区域R6和R7被排除在分析之外，因为只有一个非同义变异通过了过滤(表2在中补充附录)并绘制肿瘤的区域分布图(图2B). 桑格测序用于验证42个突变。在这些突变中，37个（88%）在最初确定的区域得到了专门验证(图2B，以及图1在中补充附录)，记录肿瘤内遗传异质性。

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图2

患者1的肿瘤内遗传异质性和系统发育。

A组显示了肾切除和转移切除标本的核心活检部位和区域。G表示肿瘤等级。B组显示了101个非同义点突变和32个indels在肾切除标本的7个原发肿瘤区域（R1至R5和R8至R9）、肾切除标本肾周脂肪（M1）和切除胸壁转移瘤的两个区域（M2a和M2b）的区域分布，通过外显子组测序（包括VHL（甚高频）Sanger测序检测到突变）。区域R6和R7被排除在分析之外，因为只有一个非同义变异体通过了过滤。热图表明每个区域存在突变（灰色）或缺失（深蓝色）。热图上方的颜色条表示突变的分类，根据它们是普遍存在的、由原发肿瘤区域共享的、由转移部位共享的还是该区域独有的（私有）。在这些基因名称中，紫色表示突变有效，橙色表示突变无效。由于DNA可用性有限，在原发肿瘤（PreP）和胸壁转移瘤（PreM）的预处理样品中仅验证了6个突变（VHL、MTOR、SOX9、ALKBH8、SETD2、，和KDM5C系列剪接位点）。C组显示了肿瘤区域的系统发育关系。R4a和R4b是在R4中检测到的子克隆。问号表示检测到设置D2剪接位点突变可能存在于R4a中，而R4b最有可能共享设置D2在其他原发肿瘤区域也发现移码突变。分支长度与分隔分支点的非同义突变数成正比。潜在的驱动基因突变由分支中的指示基因获得（箭头）。面板D显示了区域倍性分析。所有其他原发肿瘤区域均为二倍体（未显示）。DI表示非整倍体峰的DNA指数，表示与二倍体基因组相比的DNA含量。

为了避免过高估计肿瘤内异质性，需要低假阴性突变调用率。我们对R4和R9进行了超深外显子捕获测序（中位数覆盖率分别为262和255个读数），以研究是否可以通过增加测序深度（即每个外显子测序读数的中位数）检测到R4或R9中未发现的异质突变。这确定了R4中已知的64个突变和R9中的75个突变，仅检测到2个额外的突变（ITGB3标准和AKAP8公司在其他初级区域也存在，表明141个区域中有2个区域的假阴性率较低（1.4%）(表3在中补充附录).

体细胞突变异质性与克隆排序

我们排除了5个未经验证的突变，并将其余128个突变分为40个普遍存在的突变，59个由几个但不是所有区域共享的突变，以及29个单一区域中特定区域特有的突变（所谓的私有突变）。我们将共享突变细分为肾切除标本的大多数原发肿瘤区域（R1至R3、R5和R8至R9）共享的31个突变、原发肿瘤的预处理活检标本以及大多数转移区域共享的28个突变。私人突变的检测表明正在进行区域克隆进化。

如Merlo等人所述，我们通过克隆排序推断了祖先关系并构建了肿瘤区域的系统发育树。²⁰(图2C)这揭示了肿瘤的分支而非线性演变。一个分支进化为转移部位的克隆，另一个分支分化为原发肿瘤区域。R4具有一些但不是全部的原发性肿瘤和转移性突变，这表明该区域至少存在两个克隆群体，它们起源于转移性肿瘤和其他原发性癌症部位的祖细胞。R4超深测序数据中的变异频率表明，与转移部位共享的突变检测频率高于与其他原发肿瘤区域共享的突变，进一步支持R4中存在两个亚克隆(图2在中补充附录). （有关同义突变的探索性系统发育分析，请参阅图3在中补充附录.)

单次活检显示平均70个体细胞突变，约占该肿瘤中检测到的所有突变的55%。在肾切除术样本中，通过多区域测序检测到的所有突变中，只有34%存在于所有区域（如果包括预处理和转移切除样本，则为31%），这表明单个活检不能代表整个肿瘤的突变情况。

为了探讨依维莫司暴露是否会导致肿瘤内异质性，我们比较了预处理样品与治疗后样品的系统发育关系(图2C). 在原发性肿瘤预处理样本中的71个突变中，67个也存在于治疗后的原发性肿瘤区域，66个胸壁转移突变中的64个存在于治疗后的转移区域，这表明系统发育树的两个主要分支存在于药物治疗前。与治疗后分析一致，原发性肿瘤和胸壁转移瘤的预处理样本中60%的突变不与两个活检样本相同。R4中的克隆不太可能在治疗期间从原发性肿瘤或胸壁转移的预处理样品进化而来，因为这种进化需要将大量体细胞突变逆转为野生型，进一步支持治疗前存在肿瘤内异质性。最后，在依维莫司暴露6周和12周前后采集的样本具有相似数量的非同义突变(图4在中补充附录). 因此，依维莫司似乎不会增加突变负荷，治疗前肿瘤中存在主要的系统发育分支，表明肿瘤内异质性不是依维莫斯治疗的结果。

区域倍性分析和染色体畸变检测

倍性分析²¹大多数原发区呈二倍体，而切除的胸壁转移瘤的m2b区有两个亚四倍体群体(图2D). 通过克隆排序分析，与转移部位最相似的区域R4具有四倍体特征，这表明胸壁转移中的亚四倍体群体可能是从R4中的四倍体中间物发展而来的。肿瘤区域接受基于SNP阵列的等位基因不平衡检测，以识别染色体畸变。由于DNA不足，原发肿瘤和转移瘤的预处理样品被排除在外，R1、R3和R5未能进行质量控制。染色体3p上的等位基因不平衡是唯一普遍存在的异常(图5A在中补充附录). 加上染色体3p上相应减少的阵列信号强度(图5B在中补充附录)，这表明编码VHL和组蛋白H3K36甲基转移酶SETD2的3p片段中的单一缺失事件导致杂合性丢失。没有肿瘤区域具有相同的等位基因失衡特征，转移瘤内等位基因不平衡的异质性可能是由非整倍体驱动的，这表明染色体畸变导致了肿瘤内遗传异质性。

肿瘤内遗传异质性与融合性肿瘤进化

肿瘤中突变基因与透明细胞癌中复发突变基因的比较^4,22已识别VHL、KDM5C、SETD2，以及MTOR公司(图2B). 在这些驱动基因中，只有VHL（甚高频）在所有分析区域中普遍发生突变。相反，设置D2具有三种不同区域分布的不同突变(图2C)：转移瘤有一个错义突变，R4有一个剪接位点突变，所有其他区域都有一个2 bp的移码缺失，这也在R4中检测到。由于SETD2三甲基化H3K36，我们用三甲化H3K16抗体对几个肿瘤区域进行染色，以确定突变的肿瘤内异质性对蛋白质功能的影响。三甲基化H3K36在癌细胞中减少，但在大多数基质细胞和SETD2野生型对照的透明细胞癌中呈阳性(图6在中补充附录). 这些数据支持SETD2甲基转移酶功能缺失导致的表型收敛进化，这种缺失是由三种不同的、区域性分离的突变在普遍缺失另一种突变的背景下驱动的设置D2染色体3p上的等位基因。

观察到X染色体编码的组蛋白H3K4脱甲基酶KDM5C的聚合进化，在R1到R3、R5和R8到R9中存在破坏性突变（错义和移码缺失），在转移瘤中存在剪接突变(图2B和​和2C2摄氏度).

mTOR功能性肿瘤内异质性

雷帕霉素（mTOR）激酶的哺乳动物靶点在除R4外的所有原发肿瘤区域都携带激酶域错义突变（L2431P）。所有携带mTOR（L2431P）的肿瘤区域都增加了下游mTOR途径靶向磷酸-S6和磷酸-4EBP的染色。含有野生型mTOR的区域在肿瘤细胞中没有磷酸化S6和磷酸化4EBP染色(图3A). 依维莫司不太可能影响停药7天后获得的这些标本中mTOR途径的活性（药物半衰期，30小时）。²³将编码mTOR（L2431P）的互补DNA转染到清细胞癌细胞系中，在血清饥饿后增强了磷酸化-S6染色，表明L2431P促进构成性mTOR激活(图3B). 用突变mTOR构建物瞬时转染肾细胞癌细胞株不会影响体外依维莫司的敏感性（数据未显示）。mTOR序列与结构相关的磷脂酰肌醇3（PI3）激酶β相一致(图7在中补充附录). 根据这种比对得出的结构模型表明，L2431映射到激活环附近的自抑制域中的疏水口袋。脯氨酸取代L2431可能会影响mTOR激活环的构象。这些数据表明，肿瘤内遗传异质性与激酶活性的功能异质性相关。

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图3

患者1基因型与表型的相关性。

A组显示磷酸-S6（Ser235/236）和磷酸-4EBP（Thr37/46）染色。所有携带mTOR（L2431P）的肿瘤区域都增加了下游mTOR途径靶点磷酸化-S6和磷酸化-4EBP的染色。含有野生型mTOR的区域在肿瘤细胞中没有磷酸化S6和磷酸化4EBP染色。B组显示了Caki1细胞（来源于人类肾细胞癌）的免疫印迹，这些细胞仅瞬时转染绿色荧光蛋白（GFP）载体（模拟）、GFP-mTOR（野生型）或GFP-mTOR（L2431P），有无血清饥饿。C组显示了基于两个分子亚群的预后特征基因的样本分层聚类：clear-cell A（ccA）表示预后良好，clear-cell B（ccB）表示预后不良。转移部位（M2a和M2b）和原发肿瘤部位R4分离在一起，在clear-cell A亚组中富集了基因，而在clear-cell B亚组中则富集了剩余的肿瘤区域，这表明如果从单个活检中获得样本，基因表达特征可能无法正确预测结果。热图（树状图）右侧的括号表示根据分析基因的表达对样本进行的层次聚类。z分数表示样本中基因的mRNA表达与所有样本的平均mRNA表达之间的标准偏差差异。

预后特征的瘤内异质性

我们测定了110-gene标志物的瘤内表达，该标志物将透明细胞癌分为两个分子亚群：透明细胞a（预后良好）和透明细胞B（预后不良）。²⁴与系统发育分析一致，转移位点和原发肿瘤位点R4分离在一起，在透明细胞A亚群中富集了基因，而其余肿瘤区域在透明细胞B亚群中则富集了基因(图3C). 因此，如果从异质性肿瘤的单个区域进行评估，预后基因表达特征可能无法正确预测结果。

三个连续肿瘤的瘤内遗传异质性

为了确定E-PREDICT试验中的连续透明细胞癌中是否存在肿瘤内异质性，我们对患者2的原发肿瘤和转移瘤进行了多区域外显子组测序，并对患者2、3和4的原发癌进行了倍性和等位基因不平衡分析。在依维莫司治疗6周期间，CT成像显示肿瘤尺寸没有变化。

患者2有一个转移性肿瘤，在VHL（甚高频）.治疗前核心活检样本中肿瘤细胞含量低于5%，因此被排除在外。从R1到R9的原发肿瘤区域取自肾切除标本。在参与试验5个月后，无客观肿瘤反应，从进展性肝转移中获取核心活检标本。我们对肿瘤和种系DNA样本进行了外显子捕获测序（中位数覆盖率，61个读数）(表1在中补充附录). R2、R5和R8被排除在分析之外，因为其方差与总阅读量的比率较低，表明基质污染较高。共检测到119个体细胞突变，并绘制了其区域分布图(图4A，以及表4在中补充附录). 我们使用Sanger测序来验证抑癌基因中的体细胞突变VHL、PBRM1、，和TP53，在2个独立和空间分离的突变中设置D2（错义和移码突变）和PTEN公司（剪接位点和错义突变），以及15个随机选择的突变中的14个（验证率为95%）(图8在中补充附录).

由英国癌症研究院医学研究委员会、英国皇家马斯登医院肾脏研究基金、诺华、欧盟框架7个性化RNA干扰以增强个体化细胞毒性和靶向治疗药物的交付（PREDICT）以及威康信托基金（给未来博士）的资助。