溶酶体介导的衰老染色质加工

CCF的形成与核质染色质起泡有关

为了研究衰老过程中CCF的形成，我们将组蛋白H2B在其N端融合的近衰老细胞转染到GFP（GFP-H2B），并对活细胞进行延时荧光成像。值得注意的是，我们观察到GFP-H2B片段从非有丝分裂衰老细胞的主细胞核上“起泡”(图2 A;图S2 A; 和视频1). 同样，我们用组蛋白H3（图S2 B）和γ-H2AX抗体染色固定的衰老细胞，观察到明显的核泡(图2 B). 尽管最近有报道称癌细胞系中存在核-细胞质染色质起泡(Vargas等人，2012年)，含有CCF的细胞的积累与衰老人类细胞中此过程的频率增加一致。我们的结论是，衰老细胞通过核膜挤压染色质，使富含组蛋白的H3K27me3-和γ-H2AX阳性染色质丢失到细胞质中。

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图2。

衰老细胞中与层粘连蛋白B1耗竭相关的核质染色质起泡。（A） 从非有丝分裂RS细胞核中挤出GFP-H2B阳性染色质片段。瞬时转染GFP-H2B表达细胞的共焦延时显微镜，60倍原始放大，150 nm光学切片，时间单位为分钟。棒材：10µm；（插入）2µm。（B） 从细胞核中渗出的染色质片段为γ-H2AX阳性。棒材：（顶部）10µm；（底部）5µm。（C） Western blot检测RS细胞中层粘连蛋白B1和层粘连素B受体（LBR）的下调。有关时间进程的详细信息，请参见材料和方法。（D） 通过免疫荧光测定OIS细胞层粘连蛋白B1的耗竭。（E） 沿着D中箭头的层粘连蛋白B1荧光强度线扫描。所示数据来自三个重复中的一个代表性实验。（F） BRAFV600E体外诱导OIS黑素细胞中层粘连B1的耗竭。棒材，10µm。（G） F黑素细胞层粘连蛋白B1的定量免疫荧光。显示了两个重复的代表性实验。至少对150个随机选择的细胞进行了评估。（H） 与表皮中的非新生黑素细胞相比，衰老痣黑素细胞（n）对层粘连B1的染色更少。白色虚线表示真皮和表皮之间的基膜。底部面板（Epi和Nevus）从顶部的白色方框区域展开。共聚焦显微镜检查DAPI（蓝色）、MelanA（红色）和层粘连蛋白B1（绿色）染色组织。棒材，20µm。（一） 三种不同痣的H结果定量。获得了层粘连蛋白B1和黑色素a染色痣的表观荧光图像，并对表皮或黑色素a阳性细胞进行了评分，以确定是否存在（阳性）特征层粘连素B1“环。”至少对50个黑色素a表达的表皮黑素细胞和100个黑色素痣细胞进行了得分。三种不同痣±SEM的平均值；P<0.0005。

染色质从衰老细胞的细胞核中逸出的观察结果表明，核膜可能会失去完整性。为了研究这一点，我们比较了增殖细胞和衰老细胞中核膜下核层的表达和定位。正如最近报道的那样(Shimi等人，2011年;Freund等人，2012年)在体外RS和OIS成纤维细胞中，层粘连蛋白B1的丰度显著下调(图2、C和D). 特别是，层粘连蛋白B1从核周区域被耗尽，可能位于核膜下(图2、D和E). 那些层粘连蛋白B1减少的细胞也表现出明显的SAHF（图S2、C和D）。此外，层粘连蛋白B受体（LBR）在衰老细胞中的表达也受到抑制(图2 C). BRAFV600E诱导的衰老黑素细胞也获得了类似的结果(图2、F和G)以及进行RS的黑素细胞（图S2 E）。与非新生表皮角质形成细胞（图S2 F）和位于邻近基底膜的黑素细胞（推测为非新生）相比，体内衰老痣黑素细胞在层粘连B1中也缺乏(图2、H和I). Campisi及其同事还报告说，体内衰老细胞中的层粘连蛋白B1下调，特别是在受辐射小鼠的肝脏中(Freund等人，2012年). 尽管层粘连蛋白A/C的表达在衰老过程中基本上没有变化，但我们确实观察到层粘连蛋白质A/C在衰老细胞中的重新定位，远离核周区域（图S2 G）。总之，这些结果表明，衰老细胞的核膜在结构上受到损害，可能有助于细胞核起泡。

事实上，在一些衰老细胞中，我们观察到染色质通过核周层片B1网络疝出(图3，A和B)与衰老细胞核膜屏障功能受损的观点一致。为了直接测试这一点，我们从增殖和衰老细胞中获取细胞核，用70或500 kD的荧光高分子量右旋糖酐培养细胞核，并通过荧光显微镜对其摄取进行评分。衰老细胞的细胞核对两种右旋糖酐的渗透性更强(图3、C和D). 显示SAHF的细胞核总是能被右旋糖酐渗透，这突显了衰老和包膜通透性之间的联系(图3、E和F). 值得注意的是，在单个细胞核中，我们还观察到染色质挤出和右旋糖酐侵入发生在非常接近的物理位置(图3 G). 这些结果表明，衰老细胞层粘连蛋白B1的下调与核膜的非选择性通透性和核染色质向细胞质的丢失有关。

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图3。

衰老细胞中染色质从细胞核到细胞质的起泡与核膜完整性的丧失有关。（A） H3K27me3阳性染色质突入OIS细胞的细胞质。底部面板放大了黄色方框区域。棒材：（顶板）10µm；（底板）5µm。（B） OIS中椎板B1间隙或疝气的定量。平均值±SEM，n个= 2; P<0.01。（C） 衰老细胞的分离细胞核对70kD和500kD右旋糖酐都具有渗透性，表明核膜屏障功能受损。暗核不含荧光右旋糖酐。棒材，10µm。（D） C.平均值±标准偏差结果的量化，n个= 4; 70-kD和500-kD右旋糖酐的P<0.000001。（E） OIS SAHF代表⁺细胞核显示右旋糖酐渗透性。棒材，10µm。（F） SAHF中右旋糖酐70摄取的定量⁺和SAHF⁻OIS细胞。P<1.9×10⁻⁵（G）在单个细胞核中，染色质挤出和右旋糖酐侵入发生在非常接近的物理位置。右侧面板从左侧黄色方框区域展开。棒材：（左）10µm；（右）2µm。

载体、转染和病毒感染

本研究中使用了以下载体：pLNC-ER-H-RASG12V，编码雌激素受体（ER）配体结合域和H-RASG12 V的融合蛋白（如Barradas等人，2009年); pBOS-H2B-GFP（BD）；和pPA-H2B-TagRFP（Evrogen）。使用Phoenix包装细胞和聚乙烯亚胺（PEI；Linear MW 25000；Polysciences，Inc。；Kennedy等人，2011年). 成纤维细胞用1µg/ml嘌呤霉素或500µg/ml新霉素进行药物筛选，并在实验期间保存在药物中。对于编码GFP-或RFP-组蛋白H2B的质粒的瞬时转染，载体通过Amaxa核感染传递（溶液R，X001程序）。48小时后，将细胞接种到3厘米的玻璃底培养皿（磐石美国公司）上，用于随后的延时显微镜检查。

黑素细胞感染

使用标准方法生成了在巨细胞病毒初始早期启动子转录控制下编码癌基因BRAF600E的水泡性口炎病毒G假型慢病毒载体和猴病毒40启动子对嘌呤霉素的耐药性(Kennedy等人，2011年). 黑素细胞在添加2µg/ml聚brene（EMD Millipore）的正常培养基中感染过夜，然后在1µg/ml嘌呤霉素存在下培养13天。

V-ATP酶的抑制

为了抑制V-ATP酶活性，在收获前向细胞中添加50 nM巴非霉素A1或1 nM康那霉素A（均来自Sigma-Aldrich）24 h。

免疫荧光

对于免疫荧光，将生长在盖玻片上的细胞在−20°C下用甲醇固定20分钟，然后在pH 7.6的TBS-HCl中再水化。在TBS/0.05%（vol/vol）吐温20（TBS-T）中洗涤两次5分钟后，细胞在含有2%（wt/vol）山羊血清的TBS-T中被阻断20分钟。然后，细胞在适当稀释的（TBS-T/2%[wt/vol]山羊血清）一级抗体中在室温下孵育1小时。本研究中使用的主要抗体为：组蛋白H3（39163，1:1000；活性基序）；γ-H2A。X（磷光体S139，ab11174，1µg/ml；Abcam），53BP1（4937，1:500；细胞信号技术），H3K27Me3（39536，1:5000；有源Motif）；H3K9Ac（39585，1:1000；主动主题）；层粘连蛋白A/C（ab13910，1µg/ml；Abcam）；层粘连蛋白B1（ab16048，1µg/ml；Abcam）；第62页^SQSTM公司（SC-25575，1µg/ml；圣克鲁斯生物技术公司）；和抗泛素化蛋白，克隆FK2（04–263，1µg/ml；EMD Millipore）。作为阴性对照，使用以下IgG匹配抗体：抗HA标签（小鼠IgG1，2367；细胞信号技术）；抗兔IgG（M7023；Sigma-Aldrich）；和正常兔血清（S-5000；Vector Laboratories）。在随后的TBS-T清洗后，用Alexa 488或Alexa 594结合二级抗体（分子探针）培养细胞。用1µg/ml的DAPI对细胞核进行复染。

共焦显微镜

使用共焦显微镜（A1R型；尼康）和60×/1.4 NA Plan Apo VC物镜（尼康）获得共焦图像。根据期刊图像政策，使用NIS-Elements AR3软件（尼康）获得图像，并调整亮度和对比度。

共焦延时显微镜

对于活细胞成像，在时间推移前24小时，将表达H2B-RFP或H2B-GFP的IMR-90细胞接种到3厘米的玻璃底培养皿（磐石美国公司）上。然后在37°C、CO的加湿室中进行肝细胞成像₂-使用配备PanFluor 40×/1.30 NA物镜（尼康）的共焦显微镜（A1R型；尼康）富集大气。使用NIS-Elements AR3软件（尼康）采集和处理图像。

右旋糖酐核渗透性测定

收获后2.5×10⁶用10 ml冷PBS清洗细胞，然后将其重新悬浮在5 ml冷低渗溶解缓冲液（1 mM KCl，1.5 mM MgCl₂1 mM DTT和10 mM Tris-Cl，pH值8），补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂。在冰上孵育15分钟后，用Dounce均质器进行10-20次敲击。由相控显微镜监测的完整细胞核在500克5分钟，然后再次悬浮在蔗糖缓冲液中（10 mM Tris-Cl、5 mM EGTA、80 mM KCl、20 mM NaCl和250 mM蔗糖，pH 7.6）。以1:500的比例添加德克萨斯红共轭70-kD（D1829；分子探针）和FITC-共轭500-kD的右旋糖酐（D7136；分子探针。使用荧光显微镜（Eclipse 80i；尼康）或共焦显微镜（A1R型；尼康型）拍摄图像。为了进行评分，根据Hoechst染色获得细胞图像，然后通过对绿色（500-kD葡聚糖）或红色（70-kD右旋糖酐）通道中获得的图像进行视觉评估，将所有细胞的葡聚糖评分为阳性或阴性。在4个重复中，每个重复至少对100个细胞进行评分。

免疫组织化学

对从Fox Chase癌症中心（宾夕法尼亚州费城）获得的石蜡包埋人类痣进行免疫组化。通过二甲苯和分级醇系物的传代，将福尔马林固定石蜡包埋段脱蜡并再水化。用3%过氧化氢处理使内源过氧化物酶活性失活，然后在沸腾的柠檬酸盐缓冲液中孵育进行抗原回收。切片在5%血清中封闭1小时，然后在室温下与一级抗体孵育1小时或在4°C下过夜（对于层粘连蛋白B1）。使用以下抗体：抗组蛋白H3（克隆96C103680；细胞信号技术）；抗组蛋白H2B（ab1790；Abcam）；抗组蛋白H2A（ab18255；Abcam）；抗层粘连蛋白B1（ab16048；Abcam）；和用于p16（9511；MTM）的CINtec组织学试剂盒。然后将切片在二级抗体中培养1小时（Envision+试剂盒[Dako]或Vectastain ABC系统[Vector Laboratories]），并用DAB对染色进行可视化。

基于荧光的免疫组织化学

脱水、抗原回收和蛋白质阻断后，将组织切片与一级抗体一起孵育，用PBS Tween 20适当稀释。然后将样品分别在PBST中清洗3×5分钟，然后应用次级Alexa Fluor 488或594抗体（1:500）30分钟。清洗后，用1µg/ml DAPI对样品进行染色，并将其嵌入VectaMount安装介质（Vector Laboratories）中。用于本研究的抗体如下：层粘连蛋白B1（ab160481:1000；Abcam）、组蛋白H3（3680,11:500；细胞信号技术）、黑色素A（M7196,1:50；Dako）和S100（X03111:400；Dako）。

自动定量荧光显微镜

如前所述对玻片进行免疫荧光染色后，在60倍原始放大倍数（Plan Apo 60×/1.4 NA油透镜；尼康）和配备Orca-ER CCV数码相机（哈马松光电）的荧光显微镜（Eclipse 80i；尼康。使用MetaMorph软件和集成形态计量分析模块在线性荧光范围内测量平均核荧光。相同的制备、采集和分析参数用于比较显微镜。每个样本至少分析25个随机域中的300个细胞。

免疫印迹法

细胞在1×Laemmli样品缓冲液中溶解，用SDS-PAGE溶解5–20µg蛋白质，然后转移到PVDF膜上并用抗体进行检测。本研究中使用的抗体如下：抗组蛋白H3（39163；活性基序）；抗组蛋白H2B（ab1790；Abcam）；抗组蛋白H2A（ab18255；Abcam）；抗组蛋白H4（39269；活性基序）；抗组蛋白H4（2935；细胞信号技术）；抗层粘连蛋白B1（ab16048；Abcam）；抗层粘连蛋白A/C（ab13910；Abcam）；抗-LC3-B（ab48394；Abcam）；抗细胞周期蛋白A（SC-754；圣克鲁斯生物技术公司）；抗p16（克隆G175-405，51-1325GR；BD）；抗组织蛋白酶L（ab6314；Abcam）；抗p53抗体（Ab-6，泛嗜性，OP43；EMD Millipore）；抗H3cs.1（39573；活性Motif）；抗α-微管蛋白（T5168；Sigma-Aldrich）；抗兔IgG，HRP相关（NA934；GE Healthcare）；和抗鼠IgG，HRP连锁（P0447；Dako）。

DNA定量

使用Qubit荧光计和宽范围dsDNA定量试剂盒在1×Laemmli缓冲液中的1µl细胞裂解液中测量DNA浓度。

统计分析

所示结果为平均值±SD或平均值±SEM。P值由学生的2型双尾模型计算t吨测试。

作者想感谢Beatson研究所的显微镜核心设施。

P.D.Adams实验室的工作由NIA项目P01 AG031862和CR-UK项目C10652/A10250资助。S.L.Berger实验室的工作由P01 AG031862资助。J.F.Passos由BBSRC David Phillips奖学金资助。G.Hewitt由BBSRC学生奖学金资助。