在成年大鼠睾丸中,在精子发生的生精上皮周期的VIII-IX阶段,精原细胞和精原细胞在血睾屏障(BTB)处转运,同时分化为合子精母细胞(1,2). 因此,可以预见,BTB在上皮周期的第VIII(~29.1 h)和第IX(~7.7 h)阶段会经历广泛的重组(三)促进这些初级精母细胞在BTB的通过。虽然构成BTB的结构蛋白复合物是已知的(4)如闭塞蛋白/闭塞小带(ZO-1)、连接黏附分子-A(JAM-A)/ZO-1、克劳丁/ZO-1和N-钙粘蛋白/β-catenin,与这些结构成分协同作用以确定其与细胞骨架的关联和/或分离的调节因子尚不清楚。
用免疫组织化学方法在成年大鼠睾丸生精上皮的BTB处检测到一种非受体蛋白酪氨酸激酶——黏附斑激酶(FAK)(5),而其活化形式,p-FAK-Tyr397,主要定位于支持细胞延长精子细胞界面(大鼠从第8步精子细胞到第19步精子细胞)的顶端胞质特化(ES),与顶端ES组成蛋白β1整合素共定位并在结构上相互作用(5). 后续研究表明,对FAK-Tyr397是位于心尖ES的α6β1-整合素蛋白复合物的整合成分(6). 因为最近的研究表明,FAK是多个上皮细胞和内皮细胞紧密连接(TJ)和粘附连接(AJ)的关键调节器,以及细胞在TJ屏障上的移动,例如在病毒转染期间(7,8,9)(有关审查,请参阅参考。10,11,12),我们认为有必要进行一项研究,以确定FAK是否确实是大鼠睾丸和培养的支持细胞中BTB的一个整合成分,该细胞具有模拟BTB的TJ屏障体内。我们还试图确定BTB处FAK的假定相互作用蛋白伙伴。
此外,该领域的研究表明,CdCl2-诱导Sertoli细胞TJ-通透性屏障功能的破坏在体外是研究BTB动力学的新模型(13,14). 因此,我们使用了这个在体外评估在镉诱导TJ屏障损伤期间FAK与BTB完整膜蛋白相互作用的可能机制的模型。
材料和方法
动物
雄性Sprague-Dawley大鼠购自Charles River Laboratories(Kingston,NY)。洛克菲勒大学实验动物研究中心动物护理和使用委员会批准使用动物,协议编号为06018。
原始支持细胞培养
如前所述,从20天大鼠睾丸中分离出支持细胞(15). 细胞被放置在Matrigel(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)涂层的12孔培养皿(Matrigel-free F12/DMEM中稀释1:7;Sigma-Aldrich Corp.,St.Louis,MO)或双室装置(Millipore Millicell HA(混合纤维素酯)过滤器)上,有效表面积为~0.6 cm2; Millipore Corp.,Billerica,MA),并在补充碳酸氢钠、庆大霉素、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白和杆菌肽的无血清F12/DMEM中培养(16). 细胞在35℃和95%空气-5%CO下培养2(vol/vol)在潮湿的大气中。大约48小时后,对细胞进行低渗处理[20m米Tris(pH 7.4),2.5分钟,22℃],用于溶解残余生殖细胞(17). 因此,用于我们研究的Sertoli细胞培养物的细胞纯度高于98%,而所述的生殖细胞和/或Leydig细胞的污染可以忽略不计(18). 值得注意的是,根据形态学和功能分析,如所选蛋白质和/或基因的表达,这些支持细胞已分化、停止分裂,并且与从成年大鼠睾丸分离的支持细胞没有区别(例如.肌管蛋白,N-Ras,Smad2,MEKK2)(19,20). 在这个在体外模型中,Sertoli细胞形成功能性TJ通透性屏障(21)并具有TJ和基底ES的超微结构(16),模仿BTB体内.
通过量化支持细胞上皮的跨上皮电阻(TER)评估支持细胞TJ-通透性屏障
评估培养的支持细胞中功能性TJ通透性屏障的建立在体外,新鲜分离的细胞在1.2×10的条件下培养6每厘米细胞数2在Matrigel-coated两院制单元上。将每个单位放置在24孔培养皿的孔上,在顶部和底部培养皿中均含有0.5 ml F12/DMEM。如前所述,通过定量穿过支持细胞上皮的TER,每天监测TJ屏障的组装,持续7天(21). 评估镉对TJ屏障功能的影响,CdCl21和3μ米在第4天,当TJ屏障建立时,在两房单位的顶室和基底室被纳入F12/DMEM。在治疗前后(8小时)测量上皮细胞的TER,并用F12/DMEM清洗细胞两次以去除CdCl2之后。对照组为溶媒对照组(0.9%NaCl)和未经任何处理的细胞。每天在TER测量后更换每个双腔单元的培养基。每个时间点有三个重复的两院制单位。
电子显微镜
如前所述,电子显微镜是在洛克菲勒大学生物成像资源中心进行的(22),以监测支持细胞培养中BTB超微结构的存在(0.5×106每厘米细胞数2在Matrigel-coated盘子上,以模仿BTB的d 6)结尾体内.
免疫组织化学
用组织染色法对大鼠睾丸中FAK进行免疫组织化学定位-Plus(加)试剂盒(Zymed Laboratories,Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)如前所述(16). 简言之,成年大鼠睾丸固定在Bouin固定剂中,脱水,石蜡包埋,切片至5μm。切片脱蜡后,用3%过氧化氢甲醇溶液(vol/vol)处理以阻断内源性过氧化物酶活性,然后用0.1%Triton X-100(vol/vol)渗透切片。随后用兔抗FAK抗体孵育切片(补充表1,作为补充数据发布在内分泌学会期刊在线网站上,网址为http://endo.endojournals.org)然后用生物素化山羊抗兔IgG和链霉亲和素过氧化物酶,用3′3-二氨基联苯胺HCl底物-色素混合物染色,用苏木精复染,装裱。使用内置于奥林巴斯BX61显微镜(奥林巴斯美国公司,纽约州梅尔维尔)中的奥林巴斯DP71 12.5 MPa数码相机拍摄光显微照片。图像是使用奥林巴斯MicroSuite FIVE(1224版)软件包(奥林巴斯Soft Imaging Solutions Corp.,Lakewood,CO)采集的,转换为TIFF格式,并由Adobe PhotoShop在Adobe Creative Suite(3.0版;Adobe Systems,Inc.,Mountain View,CA)中进行分析。还进行了一级抗体被兔IgG替代的阴性对照。
免疫荧光显微镜
免疫荧光显微镜基本上如所述进行(23). 简言之,将成年大鼠睾丸的冷冻切片(~7μm)安装在聚乙烯上-我-赖氨酸涂层载玻片,用多聚甲醛固定,用Triton X-100渗透,用BSA封闭,用一级抗体培养(补充表1),然后用与AlexaFluor488结合的二级抗体培养(绿色)或AlexaFluor555(红色)(分子探针,尤金,俄勒冈州)。使用ProLong Gold防褪色试剂和4′,6′-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)(一种核蓝色染色剂)(Invitrogen)将载玻片安装在盖玻片上。使用兔或鼠IgG代替一级抗体进行阴性对照。为了进行细胞染色,将Sertoli细胞以0.05×10的比例涂布在Matrigel-coated盖玻片上6每厘米细胞数2并在大约48小时后接受低张治疗,如前所述(17),以溶解残留的生殖细胞。第4天,用载体(0.9%NaCl)或CdCl培养细胞2(3 μ米)在35℃下持续0、3、6和9小时,并按所述进行免疫荧光染色。对于肌动蛋白染色,按照上述方法处理细胞,并使用罗丹明结合的卵磷脂(Invitrogen)代替抗体。对实验中9到12个随机选择的区域中的至少500个细胞进行拍照和评分,并使用不同批次的Sertoli细胞培养物将每个实验重复至少三到四次。
免疫印迹分析和免疫共沉淀(co-IP)
按照说明进行免疫印迹分析(23,24). 补充表1列出了初级和次级抗体的来源及其工作稀释液。Co-IP按所述进行(24). 简言之,成年大鼠睾丸裂解物在免疫沉淀缓冲液[50 m米三分之一,0.15米氯化钠,1%(体积/体积)非碘P-40,1 m米EGTA,2米米N-乙基马来酰亚胺,10%甘油(体积/体积),1 m米苯甲基磺酰氟、15μl/ml磷酸酶抑制剂鸡尾酒1(Sigma-Aldrich)、15μl/ml磷酸酶抑制物鸡尾酒2(Sigma Aldrich。Co-IP的每个样品管使用约300μl中约700μg的蛋白质。
统计分析
全部在体外本文报道的培养实验使用重复或三次的培养皿或使用不同批次的Sertoli细胞的双室单位重复至少三到四次。对于体内实验中,每个时间点至少使用四只大鼠。使用重复测量模型和Dunnett检验,通过双向方差分析进行统计分析,以使用GB-STAT统计分析软件包(版本7;Dynamic Microsystems,Silver Spring,MD)比较治疗组和相应对照组之间的变化。因此,我们考虑了治疗组蛋白质水平(或TER)的变化与在这些分析中,相应的控制(第一个变量)也作为时间的函数(第二个变量)。
结果
FAK在BTB的阶段特异性表达及其与闭塞素相互作用形成闭塞素-FAK蛋白复合物
图1A,a–h,显示了FAK在成年大鼠睾丸生精上皮中的阶段特异性表达。免疫反应性FAK主要在基底室附近发现,与其在BTB的定位一致。在生精上皮周期的所有阶段,FAK均在BTB高水平表达,表明其在BTB维持中的重要性。然而,在第VIII-IX阶段,其染色明显减少与其他阶段(图1A、e和f与b–d、g和h;值得注意的是,图1Aa是一种用正常兔IgG替换一级抗体的对照,说明b–h中显示的染色对FAK是特异的),当BTB在这些阶段进行重组以促进初级精母细胞的转运时。为了进一步证实FAK确实是BTB的一个组成部分,对其与TJ整合膜蛋白闭塞素的共定位进行了检测。事实上,FAK与闭塞素在BTB的同一部位共定位(图1B,a–h),说明FAK可能是BTB的监管组成部分。此外,FAK似乎也定位于固有膜的细胞区,例如肌样细胞和/或淋巴管内皮,以及间质中的莱迪格细胞(图1B).
FAK在成年大鼠睾丸生精上皮中的阶段特异性定位及其与BTB处闭塞素的相互作用。Aa,与正常兔IgG孵育的成年大鼠(~300 g体重)正常睾丸的横截面,用于免疫组织化学。A、 b–h,FAK以红棕色沉淀物的形式出现,定位于上皮细胞的基底室,与它在BTB的定位一致。A、 e和f,在晚期VIII和IX小管中,FAK在BTB的定位明显减少(见e和f与b–d、g和h)。B、 在这些荧光显微照片中,FAK(绿色)与闭塞素(TJ蛋白)共定位(红色)在BTB(参见c–d、g和h中的合并图像)。在间质中也检测到一些FAK染色,可能是Leydig细胞,以及固有膜(a–h)中的肾小管周围肌样细胞和/或淋巴管内皮细胞。这个装箱区a–d分别放大,e–h显示。C、 使用成年大鼠睾丸裂解物(~700μg蛋白质)进行Co-IP,显示闭塞素在结构上与FAK相互作用。睾丸裂解物(50μg蛋白质,不含Co-IP)或Co-IP与正常兔IgG分别作为阳性和阴性对照。D、 使用睾丸(T)和生精小管(ST)的裂解物(~50μg蛋白质)进行免疫印迹分析,以说明抗体的特异性。比例尺in Aa为30μm,适用于A,A–h,in Ba为200μm,适合于B,B–d,in Be为40μm,适用于B,f–h。细胞核用DAPI染色(蓝色). A和B中显示的结果是四个独立实验的代表性数据。C中所示的Co-IP数据是10个独立实验的代表性数据。免疫沉淀;D、 染色正面;M、 蛋白质标记物。
因为FAK在睾丸期特异性表达,与观察到的闭塞蛋白类似(25),两种蛋白质均与BTB共定位(图1B)并且在第VIII期肾小管的BTB处也显著减少(图1A) (25)推测FAK可以在结构上与BTB处的闭塞素相互作用,形成调节蛋白复合物。为了验证这一假设,使用睾丸裂解物对闭塞素和FAK进行Co-IP与控件。Co-IP实验结果如图1C所示在正常大鼠睾丸中,FAK在结构上与闭塞素相互作用,但与JAM-A和克劳丁-11没有相互作用(数据未显示)。为了说明这些实验中使用的抗FAK抗体的特异性,图1D是一种使用睾丸和生精小管裂解物的免疫印迹,产生约125 kDa的显著蛋白带,与FAK的表观分子量一致。
支持细胞TJ-通透性屏障的组装及FAK在支持细胞中的表达和细胞分布与其他BTB相关蛋白在体外
接下来我们研究了FAK是否在功能上与Sertoli细胞TJ屏障的组装有关在体外当支持细胞培养6天时在体外(见黑色箭头如图2A所示这是培养的支持细胞的典型特征在体外)模拟BTB的超微结构体内检测到基底ES和共存TJ(图2,A–C)和桥粒(ds)(绿色,参见图2A中ds的典型电子密度物质). 例如,培养的两个相邻的Sertoli细胞在体外显示基础ES超微结构(蓝色),以肌动蛋白丝的存在为代表(黑色箭头如图2C所示尽管这些肌动蛋白丝的发育程度低于所发现的体内可能是由于包埋过程)夹在内质网(ER)和支持细胞质膜之间(图2,A–C),TJ位于两个Sertoli细胞之间(参见红色箭头)在图2B的放大区域如图2C所示这些电子显微镜数据,再加上通过评估整个支持细胞上皮的TER得出的功能数据,说明TER从第1天到第3天增加,最终证明这些培养细胞正在组装功能性TJ屏障,到第4天,TER达到稳定,持续到本实验结束的第7天(图2D).
FAK的稳态水平和细胞定位与在组装Sertoli细胞(SC)TJ-通透性屏障期间选择BTB-相关蛋白。A–C,培养的Sertoli细胞在体外显示出典型的指状微绒毛(箭头,A)位于心尖室。类ds-结(A)(绿色括号)检测到,其典型特征是并置的Sertoli细胞质膜中存在电子致密物质;基础ES(装箱区以肌动蛋白丝的存在为代表(黑色箭头)夹在支持细胞质膜和内质网(ER)(C)之间。共存基础ES(蓝色支架)和TJ(红色箭头)构成BTB的细胞如C.D所示,这些细胞中TJ屏障的建立(1.2×106每厘米细胞数2)通过定量细胞上皮的TER证实。E、 免疫印迹分析评估BTB蛋白质稳态水平的变化。F和G,合成数据的直方图,如E中所示,并根据肌动蛋白进行标准化。目标蛋白在第0天的相对蛋白水平被任意设置为1,并对其进行统计分析。每个酒吧是平均值±标准偏差三个实验中的一个。*,P(P)< 0.05; **,P(P)< 0.01. H和I,Sertoli细胞以0.05×10电镀6每厘米细胞数2将FAK(H、a和b)和p-FAK-Tyr染色到Matrigel-coated盖玻片上并培养4 d397(I、a和b)。荧光显微镜显示FAK(H,a和b)主要定位于细胞-细胞界面和细胞核,在胞浆中几乎没有染色。相反,p-FAK-Tyr397(I、a和b)主要局限于胞浆,在细胞-细胞界面和细胞核处染色较少。使用约30μg的支持细胞裂解物(Hc和Ic)蛋白通过免疫印迹法确认抗体的特异性。比例尺在A和B中为1μm,在C中为200 nm,在Ha和Ia中为20μm,这适用于Hb和Ib。细胞核用DAPI染色(蓝色).
在组装这个TJ通透性屏障的过程中,观察到TJ整体膜蛋白闭塞素和JAM-A的稳态水平的诱导(图2、E和F),显示了用于形成BTB的TJ构建块的增加在体外然而,克劳丁-11也是一种TJ-整体膜蛋白,在TJ-屏障组装开始时含量较高,但在形成TJ屏障时显著减少(图2,E和F),说明该蛋白可能不需要用于BTB的维持,与早先的报告一致,即成年大鼠的BTB处claudin-11显著减少与.未成熟大鼠(26).
有趣的是,细胞培养后FAK的稳态水平显著下降,但在整个培养过程中仍保持在相对稳定的水平,而对FAK-Tyr397水平显著增加(图2,E和G),表明FAK与对FAK-Tyr的相对比率397可能对BTB的组装和维护很重要在体外.
为了进一步验证FAK确实是BTB的成分,使用荧光显微镜来确认FAK和pFAK-Tyr的定位397在培养的支持细胞中。大多数FAK染色定位于Sertoli-Sertoli细胞界面和细胞核,在细胞胞浆中检测到相对较少的FAK染色(图2H). 相比之下,p-FAK-Tyr的含量要少得多397在细胞-细胞界面检测到,但大多数在细胞胞浆中发现,在细胞核中发现一些染色(图2). 用于免疫荧光显微镜的这两种抗体的特异性通过使用Sertoli细胞裂解物的免疫印迹进行确认,如图2所示、Hc和Ic。
氯化镉的影响2支持细胞骨架F-actin、TJ-屏障功能和BTB-相关蛋白的稳态水平在体外
随后,我们使用这个支持细胞培养系统作为模型来研究闭塞素/FAK复合物对BTB功能的作用在体外由于闭塞素是BTB的一种基于肌动蛋白的TJ蛋白,我们首先评估镉是否会引起肌动蛋白细胞骨架的改变,而肌动蛋白是闭塞素用于附着的。在用3μ米氯化镉2图3Aa图示了培养的支持细胞中典型的F-actin丝及其组织和排列在体外持续4天。使用CdCl 3小时后2观察到F-actin丝的暴露和紊乱(图3Ab)恶化了6小时(图3Ac). 除了两个治疗组肌动蛋白丝的明显紊乱外与控制装置(图3A、b和c与a),肌动蛋白丝出现碎片(白色箭头如图3A所示、b和c)。因此,CdCl的这些影响2在支持细胞的细胞骨架F-actin丝上显示,在这些时间点,CdCl2会影响Sertoli细胞的TJ屏障。到第4天,功能性TJ屏障在这些培养物中组装,这通过细胞上皮的稳定TER得到证实(图3B). 此时,用氯化镉处理细胞2、1和3μ米持续8小时;然后清洗细胞以去除CdCl2在接下来的3天中,每隔24小时监测一次上皮细胞的TER2与对照组相比,TER显著且呈剂量依赖性下降(图3B). CdCl的这种破坏作用2TJ屏障是不可逆的,因为即使在从培养基中去除毒物后,受损的BTB也无法重建。如前所述,这些浓度对Sertoli细胞无细胞毒性(13,14).
评估氯化镉影响的研究2支持细胞骨架F-actin、TJ-屏障功能和BTB-相关蛋白的稳态水平在体外.A,支持细胞以0.05×10电镀6每厘米细胞数2在Matrigel-coated盖玻片上培养4d,用3μ米氯化镉2在0、3和6小时后,使用罗丹明结合的指骨样蛋白对细胞进行F-actin染色(红色)和DAPI(细胞核染色,蓝色). Aa,正常支持细胞显示典型的F-actin丝的组织和排列。3小时后CdCl2观察到F-actin丝的暴露、紊乱和碎片化(Ab);6小时后,这些变化被清楚地记录下来(Ac)(参见白色箭头在b和c中与.a)。比例尺in Aa为30μm,适用于A、b和c。支持细胞以0.5×10电镀6每厘米细胞数2在Matrigel涂层的双腔单元(B)或12孔培养皿(C–G)上可以组装一个功能性TJ屏障,在d 4上,CdCl2在这些培养物中,F12/DMEM中含有指定浓度的。B、 暴露于CdCl的培养物中支持细胞上皮的TER2(8 h)呈剂量依赖性下降,说明CdCl2-诱导TJ屏障破坏。C–G,在这些培养物中,第4天的Sertoli细胞用载体(0.9%NaCl,对照)或CdCl处理2(3 μ米),并在0、6、9和24小时后终止,以评估BTB不同蛋白质稳态水平的变化。由于所有对照组在0、6、9和24小时的目标蛋白稳态水平没有显著差异,因此我们只比较了CdCl后6、9、24小时的蛋白水平2治疗与.时间零点。D–G中所示的直方图是数据的结果,如C中所示,与肌动蛋白标准化。治疗组中在时间零点的靶蛋白的相对水平被任意设置为1,对此进行统计分析。由于在对照样品和治疗组的时间零点未检测到p-p38 MAPK(n.d.),因此将6、9和24小时的p-p38 MAPK与各自时间点的总p38 MAPK进行比较(注:未检测到总p38 MAPK水平的差异),将其任意设置为1。每个酒吧是平均值±标准偏差至少三个不同的实验,P(P)< 0.05; **,P(P)< 0.001.
接下来我们评估了CdCl的影响2与TJ相关的蛋白质稳态水平的支持细胞暴露(例如JAM-A、claudin-11、clodin和ZO-1)、半桥粒(β1-整合素)以及一些已被报道调节其他上皮和/或睾丸连接重构的信号分子(例如.FAK、c-Src和p38 MAPK及其各自的磷酸化形式,即p-FAK-Tyr397,p-FAK-Tyr576,对Src-Tyr529和p-p38 MAPK)。细胞与载体(0.9%NaCl)或3μ米氯化镉2,并在0、6、9和24小时后终止。值得注意的是,闭塞素和ZO-1,分别是TJ整合膜蛋白和适配器,以及克劳丁-11对镉的敏感性明显高于分析的其他蛋白,因为它们的水平在大约6-9小时的CdCl后降低2而大多数研究的蛋白质仅在24小时后才减少(图3,C–G)。在所研究的信号分子中,CdCl处理6小时后,显著诱导了p-p38 MAPK2此后保持升高,但非磷酸化形式p38的稳态水平对CdCl没有反应2处理(图3、C和G)。
氯化镉的影响2闭塞素/ZO-1/FAK蛋白复合物及其在支持细胞中的细胞定位在体外
因为FAK在结构上与闭塞素相互作用,但闭塞素也已知与ZO-1以1:1的化学计量比形成蛋白质复合物(27,28),我们试图用闭塞素研究FAK的分布(图4A)和ZO-1(图4B)CdCl之后2治疗。FAK和闭塞素在对照Sertoli细胞中共同定位于同一位置(图4A、a–c)和CdCl2-处理过的电池(图4A,d–i),如在合并图像中观察到的(图4A、c、f和i)。然而,在CdCl之后2暴露3小时后,这两种蛋白质从细胞-细胞界面重新分布到胞浆中(图4A,d–f),9小时后更明显(图4A,g–i)。有趣的是,FAK还与ZO-1共同定位于对照细胞的细胞-细胞界面(图4B,a–c),说明FAK确实是闭塞素/ZO-1蛋白复合物的组成部分。此外,CdCl后类似的蛋白质再分配模式2观察到ZO-1和FAK的闭塞素和FAK治疗(图4,B与.A)。这些结果表明FAK可能参与CdCl2-诱导闭塞素和ZO-1重新分布,因为已知TJ和AJ的整体膜蛋白磷酸化会影响其细胞分布(有关综述,请参阅参考文献。29和30)并且可能闭塞素和/或ZO-1是FAK的底物。
FAK与闭塞素或ZO-1在Sertoli-Sertoli细胞界面的克隆化及其在CdCl后的重新分布2治疗。0.05×10镀膜支持细胞6每厘米细胞数2在涂有Matrigel涂层的盖玻片上培养4d,形成完整的上皮,用3μ米氯化镉20、3和9小时。FAK(绿色)显示与闭塞素共定位(红色; A、 A–i)和ZO-1(红色; B、 a–i)在Sertoli-Sertoli细胞界面(a、a–c和B,a–c)和CdCl处均处于控制状态2-在合并图像(A、c、f和i,以及B、c、f和i)中观察到的处理细胞(A、d–i和B、d–i)。这些发现不仅说明FAK是支持细胞BTB的组成部分在体外,与体内结果(见图1)而且FAK是BTB处闭塞蛋白-ZO-1蛋白复合物的组成部分。CdCl之后2暴露后,蛋白质定位错误,从细胞-细胞界面重新分布到细胞质中,早在3小时(A、d–f和B、d–f),9小时后更为明显(A、g–i和B、g–i)。DAPI公司(蓝色)用于细胞核染色。比例尺单位Aa为20μm,适用于A、b–i和b、A–i。
氯化镉2-在支持细胞中诱导的闭塞素重新分布显然是通过内吞小泡介导的过程介导的
因为先前的研究表明,睾丸细胞连接蛋白的内吞和/或再循环是诱导BTB重组以促进初级精母细胞在BTB的转运的重要机制(23,31)和CdCl2研究表明,可以诱导闭塞素从支持细胞界面重新分布到细胞质,我们设想毒素诱导的BTB破坏可能通过这些途径介导。进行双重标记免疫荧光显微镜检查,以评估occludin和早期内体标记物早期内体抗原-1(EEA-1;图5A)和氯氰菊酯(图5B),一种已知参与BTB蛋白质内吞的内吞蛋白(23,31),在CdCl之后2治疗与控件。在对照细胞中,闭塞素和EEA-1的共定位相对较少(图5A,a–c),以及闭塞素和氯氰菊酯之间(图5B检测到a–c)。然而,与CdCl孵育3小时后2,闭塞素在细胞质中与EEA-1共定位(图5A,d–f)以及氯氰菊酯(图5B,d–f),9小时后,这种关联变得更加明显(图5Ag–i和Bg–i),表明闭塞素在CdCl上的定位错误2治疗是由于TJ-整合膜蛋白在BTB的内化。此外,CdCl后ZO-1和EEA-1的共定位2治疗也以类似的模式检测到(补充图1,作为补充数据发布在内分泌学会期刊在线网站上,网址为http://endo.endojournals.org). 以前曾报道过该实验室使用的抗EEA-1和甲氰菊酯抗体的特异性(23). 尽管免疫荧光显微镜显示闭塞素和EEA-1之间以及闭塞素和氯氰菊酯之间的共定位增加,但治疗6 h后免疫印迹法观察到EEA-1和氯氰化物的稳态水平没有变化;治疗24小时后,仅检测到氯氰菊酯轻度下降(图5、C和D)。
氯化镉2-诱导支持细胞中闭塞素分布的变化,以及闭塞素与早期内体标记物(EEA-1)和内吞小泡(网格蛋白)的关联。0.05×10镀膜支持细胞6每厘米细胞数2在Matrigel-coated盖玻片上,用3μ米氯化镉2持续0、3和6小时。在对照组中,在细胞-细胞界面检测到大多数occludin,并且几乎没有occludin的共定位(红色)和EEA-1(绿色)(A,A–c),以及闭塞素和氯氰菊酯(绿色,B,a–c)。然而,CdCl后3小时2处理,occludin从细胞-细胞界面重新分布到细胞胞质溶胶中,与EEA-1(A,d–f)和网格蛋白(B,d–f)共定位(白色箭头)9小时后,这些变化更加明显(白色箭头,A,g-i和B,g-i),表明CdCl后闭塞素的定位错误2治疗可能是蛋白质内吞增加的结果。免疫印迹法检测到治疗组和对照组之间EEA-1或氯氰菊酯的稳态水平没有变化(每车道约30μg蛋白质),但氯氰化镉24小时后氯氰菊酯的轻度下降除外2治疗(C和D)。D中所示的直方图与C中所示数据相对应,并与肌动蛋白标准化。由于对照组0、6、9和24小时的目标蛋白水平与治疗组0小时的目标蛋白质水平没有显著差异,因此我们仅在CdCl后6、9、24小时比较蛋白质水平2治疗与时间零点,任意设置为1,并对其进行统计分析。每个酒吧是平均值±标准偏差三个实验中的一个。*,P(P)< 0.05.比例尺in Aa和Ba为20μm,适用于A、b–i和b、b–i。DAPI公司(蓝色)细胞核染色。
讨论
occludin/ZO-1在睾丸BTB中的作用
成年哺乳动物睾丸生精上皮中的BTB对精子发生至关重要。除了赋予细胞极性的作用外,它还创造了一种独特的免疫屏障,将减数分裂后生殖细胞的发育与体循环隔离开来(4,32,33). 然而,BTB与其他血组织屏障(如血脑屏障)不同,它是一个高度动态的结构,因为它在上皮周期的第VIII-IX阶段经历了广泛的重组,以促进初级精母细胞的转运(1). 因此,可以设想BTB必须受到严格调节,以协调精子发生过程中的细胞事件。为了进行功能研究以了解BTB动力学的生物学和调控,必须充分阐明其组成。迄今为止,已知构成啮齿动物睾丸中相邻支持细胞之间BTB的完整膜蛋白包括:TJ蛋白(例如闭塞素、JAM-A和克劳丁);基础ES蛋白(例如.N-钙粘蛋白,连接蛋白-2);和缝隙连接蛋白(例如连接43)(4,29). 然而,外围监管机构(例如蛋白激酶和磷酸酶)与这些完整膜蛋白在结构上相关的几乎是未知的。根据其他上皮细胞调节TJ-屏障功能的研究,改变BTB整体膜蛋白磷酸化状态的蛋白激酶可能会影响细胞粘附状态(29,30)在上皮细胞周期的第VIII-IX阶段,例如通过与下面的细胞骨架网络分离,从而“破坏”和/或“打开”TJ屏障,以促进初级精母细胞在BTB的通过。例如,在大多数上皮的TJ原纤维中发现的occludin主要在Ser/Thr和Tyr残基处被磷酸化(34,35)而磷酸化程度较低的闭塞素没有组装成TJ纤维,而是局限于基底外侧膜(34,36).
Occludin/ZO-1/FAK是BTB的一种新型调节蛋白复合物
FAK是一种非受体蛋白酪氨酸激酶,是整合素介导的信号转导途径中已知的调节剂(8,9,10,11,37,38,39)调控一系列细胞事件,包括细胞运动、病毒转染、凋亡、细胞分化、细胞粘附、连接动力学等。文献中的大多数研究表明,FAK是基于整合素的信号通路的调节剂,与Src和ILK协同作用,调节局灶接触处的细胞功能(40). 然而,早期对成年大鼠睾丸的研究表明,FAK的两种激活形式,即对FAK-Tyr397和p-FAK-Tyr576,主要位于心尖ES,是心尖ES的组成部分(5),这是一种睾丸特异性非典型AJ型,仅限于Sertoli细胞精子(第8步及以后)(41). 在顶点ES,p-FAK-Tyr397表格a真诚地α6β1-整合素-层粘连蛋白-α3β3γ3复合物(42,43,44,45)粘附复合物(5)调节发育中精子细胞与支持细胞之间的粘附。事实上,随后的研究表明,p-FAK/β1-整合素复合物在精子形成之前一直存在于心尖ES(6). 有趣的是,在早期的一项研究中,BTB也检测到FAK(5). 然而,其阶段特异性、结合伙伴及其在BTB中的功能是已知的。在此,FAK被证明是BTB的一个组成部分,与之前的报告一致(5). 最重要的是,该蛋白在BTB显示出阶段特异性定位,在上皮周期的第VIII-IX阶段,当初级精母细胞在BTB转运时,其表达显著降低(1),这也与早期报道的BTB中闭塞素的阶段特异性表达模式相一致(25). 在我们的初步调查中,以检查BTB的FAK约束合作伙伴与对-FAK-Tyr397和p-FAK-Tyr576在与β1整合素相互作用的心尖ES处,我们认为FAK也会与BTB处的整合素形成复合物,因为BTB由啮齿动物睾丸中共存的TJ、基底ES、缝隙连接和类ds-连接组成。然而,几乎所有的β1整合素染色都在心尖ES处检测到(44,46),与之前的报告一致(43)对于在基底室中检测到的β1-整合素,随后的研究表明它是半桥粒的组成部分,与α2-层粘连蛋白共定位(46)是啮齿类动物睾丸基膜的组成部分(47). 尽管α6β4整合素被假定为基底ES的一种可能成分(48),我们未能与FAK联合免疫沉淀β4整合素。此外,JAM-A和claudin-11(均为大鼠睾丸BTB处的假定TJ-整合膜蛋白)均与FAK无关(我们未发表的观察结果)。有趣的是,如Co-IP所示,闭塞素在结构上与FAK相互作用,这与双标记免疫荧光显微镜的结果一致。通过使用在体外CdCl处理Sertoli细胞的模型2存在模拟体内障碍物。这些发现表明,CdCl后支持细胞中闭塞素和ZO-1的内化2-诱导的TJ屏障破坏也伴随着FAK,明确证明了新型occludin/ZO-1/FAK复合物的存在。然而,FAK是否调节闭塞素粘附功能以及闭塞素是否也可以通过TJ处的FAK介导信号功能尚待确定。此外,BTB处的FAK是否在除Tyr-397和Tyr-576以外的Tyr残基处激活尚待确定,它们是FAK的两种激活形式,是心尖ESβ1-整合素粘附复合物的整合结构成分(5,6). 在此背景下,值得注意的是,在培养的Sertoli细胞中在体外利用已建立的BTB超微结构,FAK定位于细胞-细胞界面,但大多数对FAK-Tyr397在支持细胞胞质溶胶而不是细胞-细胞界面中检测到,可能是因为这些培养物缺乏顶端ES(注意:生殖细胞在低渗处理步骤中裂解)。因此,p-FAK-Tyr397无法定位于ES顶端,因此大部分染色都是在细胞胞浆中发现的。因此,这些观察进一步验证了对FAK-Tyr的概念397是顶点ES的一个组件(5). 基于本文报告的结果,我们假设BTB对镉毒性的异常敏感性可能是通过其对FAK的影响介导的;这反过来改变了闭塞素/ZO-1粘附复合物的磷酸化状态,该复合物在BTB具有TJ通透性屏障功能(图6). 这种相互作用的最终结果是诱导闭塞素/ZO-1/FAK复合物的加速内吞,从而破坏BTB的稳定性并导致其破坏。然而,睾丸可能利用这一方案在上皮周期第八阶段诱导BTB重组,以促进初级精母细胞在BTB的转运。在此背景下,值得注意的是,已知BTB完整性受细胞因子调节(例如TGF-β3、TNF-α)和睾酮,其中细胞因子受到干扰(19,21,25)睾丸激素促进(26)支持细胞TJ-通透性屏障功能,可能由其对BTB蛋白质内吞、再循环和/或跨细胞作用的差异效应介导(23). 然而,我们没有包括这些试剂,以避免细胞培养中的额外参数影响和/或使镉模型中的实验结果复杂化;因此,我们在本文中报告的观察到的效应可以完全归因于镉的影响,而不是多种因素相互作用的净结果。
示意图说明了闭塞素/ZO-1/FAK是一种调节性蛋白复合物,可介导CdCl2-诱导BTB破坏,这可能被睾丸用于在上皮周期的第VIII–IX阶段重组BTB,以促进原代钩端精母细胞的通过。顶部面板,BTB“关闭”,其中咬合蛋白/ZO-1/FAK蛋白复合物位于相互作用的支持细胞之间,以形成TJ屏障。中间面板,用CdCl处理支持细胞后2FAK改变了闭塞素(和/或ZO-1)的磷酸化状态,导致复合物在细胞-细胞界面上的定位错误,可能是通过甲氰菊酯介导的内吞途径,可能是靶向内切体介导的细胞内降解,破坏BTB的稳定;因此BTB“打开”,如下部面板氯化镉2还诱导肌动蛋白丝断裂,如本文所述。
总之,我们在成年大鼠睾丸BTB处发现了一种新的闭塞素/ZO-1/FAK蛋白复合物。这一发现为设计功能实验以研究其在BTB动力学中的调节作用提供了基础。