人类分子遗传学。2008年9月1日；17(17): 2723–2737.
IV型粘脂蛋白病患者的自噬功能障碍
,1 ,2 ,2和1,*
Silvia Vergarajauregui公司
1细胞生物学实验室
帕特里夏·S·康奈利
2美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所电子显微镜核心设备，邮编：20892
马修·丹尼尔斯
2美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所电子显微镜核心设备，邮编：20892
1细胞生物学实验室
2美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所电子显微镜核心设备，邮编：20892
收到日期：2008年3月28日；2008年5月20日修订；2008年6月10日接受。
- 补充资料
【补充资料】
GUID:435B26BE-7783-449C-AD8D-AF5A098CF4CD
GUID:F915745C-D20E-4F53-90C7-BF19FCC27CCC
摘要
粘蛋白1（MCOLN1）的突变与IV型粘脂蛋白沉积症（MLIV）有关，MLIV是一种溶酶体储存性疾病，以多种神经和眼科异常为特征。有人提出，MCOLN1可能调节晚期内体-溶酶体途径中膜成分的运输；然而，MCOLN1功能缺陷导致精神和精神运动发育迟缓的机制仍不清楚。在本研究中，我们显示了MLIV患者成纤维细胞自噬的结构性激活。MLIV细胞中自噬体的积累是由于从头开始自噬体的形成以及自噬体与晚期内体/溶酶体的延迟融合。自噬途径的损伤导致p62的水平和聚集增加，表明泛素蛋白的异常积累可能导致MLIV患者的神经退行性变。此外，我们发现MCOLN1缺陷细胞中血小板衍生生长因子受体向溶酶体的传递延迟，这表明MCOLN1对于自噬体和晚期内体与溶酶体有效融合是必要的。我们的数据与最近的证据一致，这些证据表明自噬缺陷可能是许多神经退行性疾病的共同特征。
简介
自噬（或更具体地说，大自噬）是一个介导大分子和细胞器被隔离到专门的细胞溶质囊泡中，随后在溶酶体中传递和降解的过程(1–三). 当细胞经历饥饿、受损细胞器积累或氧化应激等应激条件时，自噬激活就会发生，其主要作用有两个：产生营养物质和消除对细胞有潜在毒性的产物(4). 最近，有人提出，自噬也可能在非应激状态下的细胞内稳态中发挥非常重要的作用，因为自噬过程的基本活动是降解错误折叠的蛋白质和细胞器更新所必需的。基底细胞自噬在神经元中可能特别重要，聚集蛋白的积累往往导致细胞死亡(5). 因此，缺乏自噬机制特定成分的转基因小鼠表现出神经元中富含泛素内含物的积累和进行性神经变性(6,7). 此外，在人类的几种神经退行性疾病中，包括帕金森氏症中，也描述了自噬空泡的积聚(8,9)、老年痴呆症(10,11)和亨廷顿氏病(12).
自噬机制在真核生物中高度保守。在酵母中，已经鉴定出30多种自噬相关蛋白(13). 尽管其他一些蛋白质，如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）III类和beclin-1，具有重要的调节作用，但大多数这些蛋白质都介导蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂质结合事件。这一过程首先通过生长和封闭形成自噬体的双层膜结构隔离部分细胞质。LC3是酵母Atg8的哺乳动物同源物，是自噬体最具选择性的标记之一。磷脂酰乙醇胺（PE）基团的裂解和随后的附着(14)允许LC3插入自噬体膜。人们普遍认为PE结合LC3水平的增加与自噬的增加有关(15).
自噬体可以与不同类型的囊泡融合，包括内胚体多囊体（MVB）和溶酶体。这种融合确保了溶酶体酶降解自噬体的含量。最近的证据表明，损害自噬体降解的内体-溶酶体途径的改变也可能在一些神经退行性疾病中起作用。例如，肌萎缩侧索硬化症患者的CHMP2B基因突变被描述为肌萎缩侧索性硬化症，CHMP2B是ESCRT机制的一个组成部分，负责将蛋白质分类到MVB的腔泡中(16)和一种罕见的额颞痴呆(17)；而在许多遗传性痉挛性截瘫病例中突变的蛋白spatin与CHMP1B相互作用(18). 此外，siRNA耗尽ESCRT复合物的特定亚单位会导致自噬增加和含有泛素化蛋白质的蛋白质聚集体的积累(19). 因此，有效的自噬需要与功能性内体-溶酶体途径融合，而自噬降解的缺陷会导致泛素化蛋白质内含物的积累，从而可能导致神经退行性变(20).
IV型粘液表皮病（MLIV）是一种溶酶体储存障碍（LSD），其特征是由于晚期内胚体-溶酶体途径中膜成分的运输缺陷导致严重的神经和眼科异常。MLIV患者患有精神和精神运动迟缓、严重神经退行性变、肌张力降低或张力减退、失血和视力问题，包括角膜混浊、视网膜退行性、对光的敏感性和斜视(21–23). 粘脂蛋白-1（MCOLN1）是一种阳离子通道，与瞬时受体电位通道超家族同源(24–27). MCOLN1由六个跨膜跨域组成，N端和C端尾部位于胞浆内，孔位于跨膜段5和6之间。两个酸性二亮氨酸分选基序负责蛋白质向晚期内体/溶酶体的转运(28–30). MCOLN1是一种非选择性通道，优先选择单价阳离子(31–34)其活性可以通过磷酸化进行调节(35)以及pH和Ca的变化2+浓度(32,33,36).
对MLIV患者获得的成纤维细胞的分析显示，含有鞘脂、磷脂和酸性粘多糖的增大液泡积聚(24,37–39)，表明MCOLN1可能是沿着晚期内体/溶酶体途径正确运输蛋白质和脂质所必需的。这一想法得到了秀丽隐杆线虫结果表明，敲除MCOLN1的同源基因cup-5后，杂交细胞器扩大，其中包含晚期内体和溶酶体标记(40). 最近，一些研究小组建议MCOLN1在不同的细胞过程中发挥其他作用，包括调节溶酶体酸化(36)，线粒体周转(41)和溶酶体分泌(42). 然而，MCOLN1功能缺陷导致精神和精神运动发育迟缓的机制仍基本未知。
在本研究中，我们检测了MLIV患者成纤维细胞的自噬过程。我们推断，MLIV中观察到的晚期内体/溶酶体通路的缺陷可能对自噬体的形成和/或降解产生深远影响。正如预测的那样，我们发现MCOLN1的缺失导致基础自噬增加，自噬体降解减少。在正常情况下，MLIV成纤维细胞比对照成纤维细胞积聚更多LC3阳性结构。几乎所有LC3阳性结构都含有p62，这表明患者体内泛素化蛋白的异常积累。饥饿诱导自噬后，自噬体与晚期内体-溶酶体在MLIV成纤维细胞中的融合效率较低。我们还观察到PDGFR延迟传递到MCOLN1缺陷细胞中的溶酶体。因此，MCOLN1似乎沿着晚期内胚体-溶酶体途径调节贩运事件，我们认为这些贩运事件的缺陷会导致低效自噬和泛素化蛋白的积累，这可能有助于MLIV患者的神经退行性过程。
结果
人成纤维细胞自噬的监测
LC3是监测哺乳动物细胞自噬最常用的标记物。正常情况下，LC3呈胞质分布；然而，在自噬诱导后，它被招募到新形成的自噬体中，并一直与这些结构相关，直到自噬体与晚期内体/溶酶体融合。如图所示A、 用厄尔平衡盐溶液（EBSS）孵育成纤维细胞3小时，使其饥饿，导致LC3明显补充到离散的囊泡结构。随后用完全培养基培养一小时（恢复），使自噬体降解并将LC3重新分配到胞浆。因此，监测内源性LC3分布的变化是追踪人类成纤维细胞自噬的合适方法。
MLIV患者成纤维细胞自噬增加。(A类)对照组成纤维细胞生长在完全培养基中（未经处理，左侧），在EBSS培养基中饥饿3 h（饥饿，中间）或饥饿3 h，然后在完全培养液中恢复1 h（恢复，右侧），用内源性LC3的多克隆抗体固定、渗透和免疫染色。(B类)未经处理的对照组和MLIV成纤维细胞的LC3染色。值得注意的是，与对照组成纤维细胞的弥漫染色相比，LC3在MLIV成纤维细胞中显示出泡状染色。(C类)用LC3多克隆抗体（红色）和CD63或p62单克隆抗体（绿色）固定、透化和免疫染色在完全培养基中生长的MLIV成纤维细胞。插图显示所示区域的放大倍数为3倍(D类)使用抗LC3（绿色）和抗泛素（红色）对未经处理的MLIV细胞进行双重免疫染色。通过共聚焦荧光显微镜检查细胞。将红色和绿色通道中的图像合并，生成每行上的第三张图片；黄色表示重叠定位。比例尺=10µm。
MLIV成纤维细胞自噬的基本水平增加
为了评估MLIV中自噬过程是否发生改变，我们比较了正常非失活条件下，对照组成纤维细胞和MLIV患者成纤维细胞内源性LC3的分布。正如预期的那样，LC3在未经处理的对照细胞中主要是细胞溶质，尽管偶尔也能检测到LC3标记的自噬体（图B） ●●●●。相反，在MLIV成纤维细胞中观察到大量LC3阳性结构，这表明这些细胞中的基础自噬具有结构性激活（图B） ●●●●。定量分析显示，对照细胞中自噬体的平均数量为12.8（SD±1.3，n个=10），而在MLIV细胞中，自噬体的平均数量增加到54.2（SD±3.2，n个= 10).
我们用LC3和CD63抗体标记MLIV细胞，后者是晚期内体/溶酶体的标记物。如图所示C、 一些LC3阳性小泡没有与CD63共定位。这些小泡可能是新生的自噬体，因为它们没有任何溶酶体特征。我们还观察到许多LC3标记的点状物与CD63共定位，表明自噬体与晚期内体/溶酶体融合。
有趣的是，大多数LC3阳性囊泡也含有p62（图C） ，一种常见于与神经退行性疾病相关的蛋白质内含物中的分子(43). 有人认为p62与泛素化蛋白和LC3相互作用的能力(44)调节通过自噬去除的蛋白质聚集体的形成(20). 与这个想法一致，我们发现MLIV患者细胞中存在的许多自噬体含有泛素化蛋白（图D） ●●●●。这些结果表明，在MCOLN1缺陷细胞中观察到的自噬改变导致了含有泛素化蛋白的蛋白质聚集体的积累。
LC3最初以未经处理的形式合成，在其C末端区域迅速裂解生成可溶性LC3-I。在自噬诱导过程中，LC3-I亚型通过PE基团的偶联转化为LC3-II，该PE基团允许LC3插入自噬体的膜中。已经证实，LC3-II的量与自噬体形成的程度相关。为了证实MLIV中的基础自噬增加，我们通过免疫印迹分析了对照细胞和患者细胞中LC3-II和LC3-I的比率。如图所示A、 在基础条件下，MLIV成纤维细胞中检测到LC3-II水平升高。七个独立实验的量化显示，MCOLN1缺失细胞中LC3-II/LC3-I比率增加了3倍（2.97；SD±0.3）（图B） ●●●●。有人建议，在某些情况下，测量LC3-II/肌动蛋白比率可能是监测自噬诱导的更准确方法。LC3-II/肌动蛋白比率的量化显示增加了3.29倍（SD±0.6；n个=7）在MLIV细胞中，从而证实患者的自噬激活(补充材料，图S1).
MLIV成纤维细胞自噬上调。(A类)对照组和MLIV成纤维细胞在不使用或使用50µg/ml leupeptin的情况下处理7 h。细胞被裂解，并用抗LC3（顶部）或抗肌动蛋白（底部）进行免疫印迹。(B类)（A）中所示实验的量化。自噬被测量为LC3-II/LC3-I的比率，表示为未经处理的对照细胞比率增加了一倍。结果为平均值±标准差(n个= 7),P（P）< 0.01. (C类)western blot检测对照组成纤维细胞和MLIV成纤维细胞的裂解液中beclin-1和actin的表达。(D类)用肌动蛋白标准化的beclin-1水平的量化显示为对照细胞的倍数增加。结果为平均值±标准差(n个= 9),P（P）< 0.05. (E类)Western blot显示p62在MLIV成纤维细胞的可溶和不可溶部分中积聚。(F类)通过用肌动蛋白水平使p62正常化来进行量化。结果为平均值±SD(n个= 4). 可溶的P（P）<0.001；不溶的P（P）< 0.05.
自噬增加可能是由于自噬小体形成增加或自噬体降解减少所致。为了区分这两种可能性，我们将细胞与溶酶体蛋白酶抑制剂leupeptin孵育。如果亮蛋白肽处理没有引起LC3-II水平的增加，则很可能是由于抑制自噬降解而导致自噬体积累。如图所示A和B，对照细胞和患者细胞中的LC3-II水平在leupeptin的存在下确实增加。这些结果表明，MLIV细胞中自噬体与溶酶体的融合没有被阻断，自噬增加可能至少部分是由于自噬小体形成增加。然而，值得注意的是，leupeptin实验并不排除MLIV细胞自噬体降解较慢的可能性（见下文）。有趣的是，参与自噬体形成的III类PI3K复合物的组成部分beclin-1的表达(45)MLIV成纤维细胞增加（图C和D）。MCOLN1缺乏引起的beclin-1上调可以解释患者细胞自噬体形成增加的原因。
我们还检测到MLIV成纤维细胞裂解物的免疫印迹中p62水平增加（图E和F）。重要的是，我们发现患者体内不溶性p62的含量增加了2倍以上（图E和F）。对Triton X-100提取保持抗性的蛋白质部分通常用作蛋白质聚集的定量测量(46). 因此，这些数据与我们的免疫荧光实验一致，并进一步证明了MLIV患者细胞中p62阳性包涵体的积聚。在不同MLIV患者的成纤维细胞中也发现LC3-II和不溶性p62水平升高（见材料和方法），从而证实了我们的结果(补充材料，图S2).
最后，通过透射电镜证实MLIV成纤维细胞中存在大量的基础自噬（图). 该分析显示，突变株中经常有自噬空泡，内含细胞器和其他细胞质内容物，但野生型成纤维细胞中没有（图A–E）。此外，我们观察到了先前在MLIV细胞中描述的典型同心多层结构和电子致密包裹体（图F和G）(47). 还发现了含有层状结构和似乎是半降解材料的囊泡（图H） 这可能是自噬体与多层小泡融合的结果。总之，我们的结果表明MCOLN1缺失细胞自噬通量的结构性增强。
MLIV成纤维细胞中自噬体的积聚。对照组成纤维细胞的电子显微照片(A类)和MLIV成纤维细胞(B类). 注意电子致密溶酶体和自噬体的积累[箭头所示示例与(E类)]存在于MLIV细胞中。比例尺=2µm。(C类–E类). MLIV成纤维细胞中具有细胞质内容物的膜结合结构的高倍图像，与自噬体一致。在(D类)，箭头表示线粒体中的嵴。箭头表示线粒体内外膜和自噬体周围双层膜清晰可见的区域。比例尺=200 nm。(F类和G公司)含有同心板层包涵体的MLIV成纤维细胞中的特征溶酶体。比例尺=200 nm。(H（H）)MLIV成纤维细胞的EM图像显示含有同心板层包涵体和细胞质内容物的自体溶酶体。比例尺=200 nm。
饥饿诱导的自噬不需要MCOLN1
接下来，我们比较了对照和突变成纤维细胞在应激条件下的自噬诱导。细胞在不含氨基酸（EBSS）的培养基中培养3小时以诱导自噬。如图所示A、 营养剥夺导致LC3阳性囊泡的数量和大小增加。饥饿条件下每个细胞的自噬体平均数量为38.9（SD±6.4，n个=12）在对照组成纤维细胞和79.88（SD±9.31；n个=10）在MLIV成纤维细胞中。
饥饿诱导MLIV患者成纤维细胞的强烈自噬。(A类)对照成纤维细胞或MLIV成纤维细胞在对照条件下（DMEM）或饥饿3小时后固定，并用内源性LC3抗体进行免疫染色。注意，如图所示正常情况下，MLIV成纤维细胞中LC3呈泡状染色，而对照成纤维细胞呈弥漫染色。饥饿3小时后，自噬进一步增加。比例尺=10µm。（B）从未经处理的细胞（DMEM）中收集来自对照成纤维细胞或来自MLIV患者的成纤维细胞的裂解物，在缺乏或存在50µg/ml亮氨酸肽的情况下饥饿3小时的细胞，或饥饿3小时后恢复1小时的细胞（恢复）。western blot显示内源性LC3（顶部）和肌动蛋白（底部）。（C）自噬以LC3-II/LC3-I的比率进行测量，并表示为正常培养基（DMEM）中对照细胞比率的倍数增加。结果为平均值±S。D(n个= 5). 饥饿+饥饿P（P）< 0.05; DMEM，饥饿P（P）< 0.01; 恢复P（P）< 0.001.
LC3-II/LC3-I比率免疫印迹的测量证实，饥饿后，在对照细胞和突变细胞中都有强大的自噬诱导（图B） ●●●●。四个独立实验的量化显示，对照细胞饥饿后LC3-II/LC3-I比率增加了4.54倍（SD±0.76），MCOLN1缺陷细胞增加了5.76倍（SD？.08）（图C） ●●●●。当测量LC3-II/肌动蛋白比率时，也得到了类似的结果(补充材料，图S1).
用leupeptin处理饥饿细胞后，两种细胞类型中的LC3-II水平都进一步增加，这与MLIV细胞中自噬体和溶酶体的融合没有被阻断的概念一致（图B和C）。此外，当细胞在饥饿后在完全培养基中恢复1小时时，LC3-II/LC3-I比率降低到接近未处理细胞的水平（图B和C）。因此，这些结果表明，在缺乏MCOLN1的情况下，可以发生饥饿诱导的自噬和自噬体降解。
MLIV成纤维细胞中自噬体与晚期内体/溶酶体途径的融合延迟
如前所述，在用亮蛋白肽处理后观察到的LC3-II水平的增加表明自噬体与晚期内体/溶酶体的融合在MLIV成纤维细胞中没有被阻断（图B和B） ●●●●。然而，这些实验并不能证明突变细胞的融合在某种程度上被延迟。为了测试这种可能性，我们将细胞在EBSS培养基中饥饿3小时，然后短时间恢复20分钟和40分钟。如图所示A、 与对照细胞相比，MCOLN1缺陷细胞中LC3阳性小泡的数量显著增加。量化每个细胞的自噬体总数显示，在恢复20分钟后，只有24.3%的对照细胞显示超过20个自噬小体，24.3%的细胞显示少于10个(n个= 37). 相比之下，62%的MCOLN1缺陷细胞含有20多个自噬体，只有1%的自噬小体少于10个(n个=24）（图B） ●●●●。40分钟恢复后，含有少于10个自噬体的MCOLN1缺陷细胞的百分比增加（从20分钟恢复时的1%增加到40分钟时的15%），显示超过20个自噬体的细胞的百分比减少（从62-35%），再次证实了MLIV成纤维细胞中自噬体的降解没有被阻断。然而，在40分钟恢复后，含有20个以上自噬体的细胞数量在突变细胞中显著增加【突变细胞中为32%(n个=20）与对照细胞中的0%(n个=44）]，而对照细胞中自噬体少于10个的细胞百分比较高（对照细胞为95.45%，突变细胞为15%）（图B） ●●●●。当我们分析不同患者细胞系恢复20和40分钟后的自噬体数量时，也得到了类似的结果(补充材料，图S3). 因此，我们的数据表明，MLIV细胞中的自噬体降解实际上是延迟的。
MLIV成纤维细胞中自噬体的降解延迟。(A类)对照组和MLIV成纤维细胞在EBSS培养基中饥饿3小时，然后在完全培养基中恢复20或40分钟。然后固定细胞，用免疫荧光检测LC3定位。比例尺=10µm。(B类)恢复20分钟（左侧面板）或40分钟（右侧面板）后，显示20个以上、10到20个或10个以下LC3阳性结构的细胞百分比。
当我们分析CD63和LC3之间的共定位作为自噬体和晚期内体/溶酶体融合的标志时，我们发现MLIV患者细胞中68.8%（SD±11）的LC3阳性囊泡在恢复20分钟后与CD63共定位，40分钟后该百分比增加到87.7%（SD±7）（图). 然而，与对照细胞相比，MLIV成纤维细胞中LC3/CD63共定位的程度显著降低（恢复20分钟后，对照细胞中为92%，突变细胞中为68.8%），这表明自噬体与晚期内体/溶酶体的融合在MCOLN1缺陷细胞中效率较低。
MLIV成纤维细胞中自噬体和溶酶体的融合延迟。(A类)MLIV成纤维细胞饥饿3小时，然后在完全培养基中恢复20或40分钟。细胞固定、渗透并用LC3多克隆抗体（绿色）和CD63单克隆抗体（红色）进行免疫染色。插图放大了3倍。共聚焦荧光显微镜检查细胞。将红色和绿色通道中的图像合并，生成每行上的第三张图片；黄色表示重叠定位。比例尺=10µm。(B类)在恢复20或40分钟后，对对照组和MLIV成纤维细胞中自噬体-溶酶体融合事件的百分比进行量化，作为与溶酶体标记CD63共定位的LC3阳性结构的分数。恢复20分钟，P（P）< 0.01; 恢复40分钟，P（P）< 0.05.
MCOLN1在NRK细胞中的过度表达诱导自噬体的积累
据报道，改变内体/溶酶体途径的某些蛋白质的表达可能会影响自噬过程的效率。例如，突变型CHPM2B（ESCRT-III复合物的成分之一）的过度表达诱导LC3阳性小泡的积聚，可能是由于自噬体与MVB融合的缺陷所致(19). 我们之前已经描述过MCOLN1的过度表达影响内体/溶酶体途径，并诱导晚期内体/溶体的增大(28). 因此，在本研究中，我们检测了MCOLN1过度表达是否会导致自噬体积聚。
为了监测自噬活性，我们跟踪了GFP标记的LC3在NRK细胞中瞬时表达的分布变化。与内源性LC3类似，GFP-LC3在未经处理的NRK细胞中主要是细胞溶质，在EBSS中饥饿3h后，用GFP-LC2标记的点状囊泡结构明显增加（图A） 。有趣的是，MCOLN1的过度表达导致了GFP-LC3标记的自噬体的大量积累（图B） ●●●●。每种实验条件下300个细胞的定量结果表明，在营养丰富的条件下，仅表达GFP-LC3的NRK细胞中，<8%（7.21%，SD±0.58）的细胞显示GFP-LC3puncta。相比之下，33%（SD±0.86）的同时表达GFP-LC3和MCOLN1的细胞显示GFP-LC3-阳性小泡（图C） ●●●●。饥饿诱导的自噬似乎不受MCOLN1表达的影响，因为在EBSS中孵育3小时后，单独表达GFP-LC3或GFP-LC3+MCOLN1的细胞中积累GFP-LC3-标记点的细胞百分比非常相似（分别为76.13%，SD±7.04%和76.33%，SD？.3）（图C） ●●●●。最后，恢复1小时后，两种细胞类型中GFP-LC3阳性囊泡的数量均显著减少（图C） ●●●●。综上所述，我们的结果表明，MCOLN1过度表达诱导的晚期内体/溶酶体途径的改变导致自噬体在基础条件下异常积聚。
MCOLN1的过度表达增加了自噬。(A类)用GFP-LC3转染NRK细胞24 h。未经处理的细胞，在EBSS培养基中饥饿3 h（饥饿，中心）或饥饿3 h，然后在完全培养基中恢复1 h（恢复，右侧），固定并用共焦荧光显微镜检查。比例尺=10µm。(B类)用GFP-LC3和MCOLN1-FLAG联合转染NRK细胞，固定并用FLAG抗体染色。比例尺=10µm。(C类)正常情况下（未经治疗）、饥饿3小时后或恢复1小时后，在没有或存在MCOLN1-FLAG的情况下，以水泡模式表达GFP-LC3的细胞百分比。结果为平均值±标准差(n个= 300),P（P）< 0.001.
MCOLN1的缺失导致沿内胚体/溶酶体途径的货物运输延迟
如上所述，MLIV成纤维细胞中自噬体与溶酶体的融合延迟，因此我们假设，如果没有MCOLN1，晚期内体和溶酶体之间的融合也可能受损。为了测试这种可能性，我们跟踪了从质膜到溶酶体的货物运输。血小板源性生长因子受体（PDGFR）是受体酪氨酸激酶家族的一个典型成员，其激活和转运已被详细描述(48). 配体诱导的PDGF受体二聚化导致受体的自磷酸化以及下游信号蛋白的结合和磷酸化。PDFGR信号的终止是通过内吞作用和将受体传递到溶酶体进行降解来实现的。因此，我们用PDGF刺激细胞不同的时间段，并通过免疫印迹分析测定PDGFR的量。有趣的是，我们观察到，与对照细胞相比，MCOLN1缺陷细胞中配体诱导的PDGFR降解减少（图A） 。三个独立实验的定量分析表明，与对照细胞相比，MLIV成纤维细胞在配体刺激后60和90分钟的PDGFR剩余量增加了50%以上（图B） ●●●●。这些结果表明，MCOLN1是PDGFR高效运输到溶酶体所必需的。这些数据结合起来表明，MCOLN1是从晚期内体和自噬体向溶酶体有效输送物质所必需的。
MLIV成纤维细胞PDGFR下调受损。(A类)对照组成纤维细胞和MLIV成纤维细胞在含有0.1%BSA的DMEM中饥饿16小时，并与100 ng/ml PDGF-BB孵育指定时间。然后对细胞进行裂解，进行SDS-PAGE并用PDGFR抗体进行免疫印迹。作为负荷控制，还对裂解液进行肌动蛋白印迹。(B类)来自三个独立实验的相应PDGFR带的光密度的量化。
讨论
本文中，我们报道了MLIV患者成纤维细胞自噬的组成性激活。这种激活是在基础条件下观察到的，是自噬体形成增加和自噬体内降解延迟的结果。为了监测自噬，我们分析了LC3从胞质溶胶向囊泡结构的募集，以及LC3-II水平的增加。我们发现，与对照成纤维细胞相比，MCOLN1缺陷细胞中LC3阳性点状细胞的数量显著增加。有趣的是，大多数LC3标记的结构也含有p62，这表明MLIV成纤维细胞中存在泛素化蛋白的积累。免疫印迹分析也证实LC3-II和p62水平升高。leupeptin治疗和CD63与LC3的共定位实验表明，MLIV细胞中自噬体与晚期内体/溶酶体的融合没有被阻断。这些数据，加上在突变成纤维细胞中观察到的beclin-1水平的增加，表明自噬体的积累至少部分是由于自噬小体的形成增加。然而，我们还观察到，在MLIV患者细胞中，自噬体成熟效率较低。因此，我们认为，MLIV细胞中报告的自噬诱导是由于自噬小体形成增加和自噬体与晚期内体/溶酶体融合延迟所致。
MLIV的特征是严重的神经异常；然而，神经退行性变的潜在机制尚不清楚。我们认为，由于MCOLN1的缺失，沿着内体/溶酶体途径的运输缺陷会损害溶酶体功能，导致自噬体降解效率低下。这反过来导致泛素聚集物的积累，产生细胞应激，并进一步诱导自噬体的形成和积累（图). 在成纤维细胞中，细胞的快速分裂有助于防止错误折叠或聚集的蛋白质的积累，自噬缺陷可能不会特别有害。然而，这些产物在神经元中的积累可能导致细胞死亡，并且由于神经元无法被替换，因此会发生神经退化。
MLIV患者缺陷自噬诱导神经退行性变机制的拟议模型。在MCOLN1缺失细胞中，沿晚期内体/溶酶体途径的贩运受到干扰。因此，自噬体和溶酶体之间的融合被延迟从头开始自噬体的形成增加。自噬途径的功能障碍导致蛋白质聚集和细胞器转换缺陷，从而使细胞，尤其是神经元更容易受到细胞死亡的影响。
此外，自噬应激可能导致线粒体等受损细胞器的积累，使细胞更容易受到促凋亡信号的影响(49). 为了支持这一观点，最近的一项研究表明，MLIV成纤维细胞积聚碎片状线粒体，并对钙诱导的凋亡表现出更高的敏感性2+-动员激动剂(41).
溶酶体功能障碍引起的自噬缺陷可能不是MLIV的唯一特征。最近的证据表明，在许多LSD中，如多硫酸酯酶缺乏症和IIIA型粘多糖病，溶酶体中未降解产物的积累会损害自噬体的成熟，导致泛素化蛋白聚集体的积累和线粒体缺陷(50). 此外，降低溶酶体活性的因素，例如老化或氧化应激，可能会降低自噬清除有毒或聚集蛋白质的能力，从而加剧与年龄相关的神经退行性疾病，如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和亨廷顿氏病(5).
尼曼-匹克C型病（NPC）是一种以进行性神经退行性变为特征的鞘脂沉积障碍，自噬体的积聚也被描述为NPC(51). 有趣的是，在鼻咽癌中观察到自噬体的形成增加，而不是降解缺陷。这些结果表明，胆固醇在晚期内体/溶酶体中的积累增加了beclin-1的水平，导致基础自噬增加(52). MLIV成纤维细胞中也有胆固醇在晚期内体中异常积聚的报道(36). 因此，胆固醇运输中断可能是我们在MLIV细胞中观察到的与beclin-1水平升高相关的自噬体形成增加的原因，而溶酶体功能缺陷可能是自噬体弱效降解的原因。
我们不能排除MCOLN1在自噬体和晚期内体/溶酶体融合中发挥特殊作用的可能性。NRK细胞中MCOLN1的瞬时表达诱导GFP-LC3标记小泡的积累。由于转染后短时间内溶酶体内不太可能积聚大量脂质，因此，MCOLN1功能因过度表达而发生改变可能是自噬体成熟受损的原因。也有人认为MCOLN1可能调节晚期内体和溶酶体之间的融合/裂变事件(40,53). 与这一观点一致，我们发现在MLIV成纤维细胞中，PDGFR向溶酶体的递送延迟（图). 此外，最近有研究表明，经MCOLN1 siRNA处理的巨噬细胞中，液相标记物向溶酶体的转运较慢(54). 由于后期内体-溶酶体融合所需的一些蛋白质可能与自噬体-溶菌体融合所需要的蛋白质相同，因此MCOLN1可能参与这两种融合事件。
我们的研究结果表明，调节自噬可能是治疗MLIV的一种有效策略。我们在对照细胞和MLIV细胞中发现饥饿后强烈的自噬诱导，表明自噬机制在MCOLN1缺陷细胞中起作用。因此，旨在诱导自噬激活的治疗，如热量限制或雷帕霉素治疗，可能有助于克服基础条件下出现的延迟自噬体降解。这种策略被建议用于治疗其他神经退行性疾病(55,56). 例如，在亨廷顿病的动物模型中，通过雷帕霉素治疗诱导自噬可以减轻神经元死亡(57).
总之，我们的数据证明了溶酶体功能对自噬活动的影响，并表明，与其他LSD类似，自噬缺陷导致的泛素化蛋白内含物的积累可能导致MLIV患者的神经变性。
材料和方法
抗体和试剂
使用的主要抗体有：小鼠单克隆抗泛素抗体（FK2；MBL，沃本，马萨诸塞州，美国）、小鼠单克隆抗体CD63（H5C6）和小鼠单克隆抗血清p62 lck配体（BD Pharmigen，加利福尼亚州圣何塞市，美国）、小鼠单克隆抗肌动蛋白抗体（BD Transduction，加利福尼亚州圣荷西市，美国），兔多克隆抗LC3抗体（Sigma，圣路易斯，密苏里州，美国，兔多克隆抗Beclin-1抗体（Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA）和兔多克隆抗血小板衍生生长因子受体（Upstate/Millipore，Bellerica，MA，US）。所使用的二级抗体是：与Alexa Fluor 488或555（Molecular Probes，Eugene，or，USA）缀合的山羊抗小鼠或山羊抗兔。HRP-结合抗鼠或抗兔IgG（GE Healhcare/Amersham Bioscience，美国新泽西州皮斯卡塔韦）。白肽、哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物和NP-40是从Sigma中获得的。PDGF-BB来自Upstate/Millipore。
细胞系和转染
MLIV患者的皮肤成纤维细胞（克隆WG0909）、相应的杂合子非疾病父代皮肤成纤维纤维细胞（复制WG0988）和无关的非疾病皮肤成纤维蛋白（复制MCH065）均来自蒙特利尔儿童医院突变人类细胞株库（加拿大蒙特利尔）。MLIV成纤维细胞克隆MG02527来自Coriell Cell Repositories（美国马萨诸塞州波士顿）。成纤维细胞和NRK细胞保存在补充了100 U/ml青霉素（Gibco）和10%（w/v）胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM，Life technologies，Invitrogen/Gibco，Carlsbad，CA，USA）中。根据制造商的建议，使用FuGENE-6（美国印第安纳波利斯罗氏诊断公司）转染NRK细胞。转染后24小时进行分析。
细胞饥饿
通过用PBS清洗三次，使细胞饥饿，并在37°C的EBSS（EBSS，Sigma）中培养3 h。为了检查细胞从饥饿中恢复，将在EBSS中培养3小时的细胞转移到37°C下的DMEM–10%FBS中，达到指定的时间。
质粒
GFP-LC3嵌合体是Dale Hailey（NIH，Bethesda，MD，USA）的一份礼物。如前所述，克隆了MCOLN1-FLAG(35).
免疫荧光显微镜
对于免疫荧光，皮肤成纤维细胞或NRK细胞生长在盖玻片上，并在−20°C的甲醇/丙酮（1:1，v/v）中固定10分钟。在室温下用PBS、0.1%（wt/vol）皂苷和0.1%BSA中稀释的一级抗体孵育1h。用PBS冲洗5分钟以去除未结合抗体，然后在室温下用稀释在PBS、0.1%（wt/vol）皂苷和0.1%BSA中的二级抗体（Alexa555或Alexa488-共轭山羊抗兔或抗鼠Ig）培养细胞30–60分钟。在用PBS进行最终冲洗后，用Fluoromount G（美国亚利桑那州伯明翰市南方生物技术协会）将盖玻片安装在玻璃载玻片上。荧光图像是在LSM 510共焦显微镜上获得的（美国纽约州桑伍德卡尔蔡司）。为了在恢复条件下进行共定位分析，每个实验每个细胞系有6个细胞进行成像和分析，如下所示：通过关闭GFP通道对LC3阳性囊泡进行计数和标记。然后，重新打开GFP通道并计算共定位小泡的数量。根据这两个值，确定共定位囊泡的比例。
电子显微镜
细胞在60 mm Permanox培养皿（Nunc Nalgene）中培养，并进行透射电镜处理。简而言之，培养物用戊二醛和多聚甲醛固定，用四氧化锇固定，染色整体乙酸铀酰，乙醇脱水，Epon包埋。化学物质来自电子显微镜科学。在Sorvall MT2超微切片机上平行于粘附表面切割60nm厚的切片，用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色，并用配备有AMT XR-60数码相机（Advanced Microscopy Techniques）的JEM 1200 EXII电子显微镜（JEOL USA）观察。
蛋白质印迹
用冰镇PBS清洗成纤维细胞，并在冰镇溶解缓冲液（25 m）中提取米Tris–HCl，pH 7.4，150 m米氯化钠，5米米EDTA，1%NP-40，添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒），离心（16000 g）10 min，收集上清液（可溶性部分）。为了分析不溶性部分中的蛋白质水平，用裂解缓冲液清洗剩余的蛋白质颗粒，离心并用含有2%十二烷基硫酸钠的样品缓冲液萃取。样品在还原条件下通过SDS–PAGE（4–20%梯度凝胶）进行分析，并转移至硝化纤维素。然后用1×PBS、0.05%吐温-20、10%非脂肪乳封闭膜，并用适当的抗体孵育。蛋白质检测采用增强化学发光试剂（Amersham Biosciences）。使用公共域ImageJ程序（1.38）对不同蛋白质的数量进行量化，用同一样品中的肌动蛋白含量进行标准化，并表示为对照成纤维细胞中的数量增加了一倍。
PDGFR降解
将皮肤成纤维细胞血清饥饿16小时，并用PDGF-BB（100ng/ml）刺激指定时间。用PDGFR抗体对总细胞裂解物进行免疫印迹。使用公共领域ImageJ程序（1.38）对每个时间点的PDGFR数量进行量化，并表示为与同一实验中未刺激的成纤维细胞相比剩余PDGFR的百分比。
基金
该项目得到了NIH、国家心脏、肺和血液研究所（NHLBI）的院内研究计划的支持。
致谢
我们感谢Dale Hailey的有益讨论和建议。我们也感谢NIH研究员编辑委员会的编辑协助。
利益冲突声明。作者没有要声明的利益冲突。
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