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.2008年9月1日；17(17):2723-37.
doi:10.1093/hmg/ddn174。 Epub 2008年6月11日。

IV型粘脂蛋白病患者的自噬功能障碍

Silvia Vergarajauregui公司 1, 帕特里夏·S·康奈利, 马修·丹尼尔斯, 玫瑰Puertollano
附属公司

IV型粘脂蛋白病患者的自噬功能障碍

Silvia Vergarajauregui公司等。 人类分子遗传学. .

摘要

粘蛋白1（MCOLN1）的突变与IV型粘脂蛋白沉积症（MLIV）有关，MLIV是一种溶酶体储存性疾病，以多种神经和眼科异常为特征。有人提出，MCOLN1可能调节晚期内体溶酶体途径中膜成分的转运；然而，MCOLN1功能缺陷导致精神和精神运动发育迟缓的机制仍不清楚。在本研究中，我们显示了MLIV患者成纤维细胞自噬的结构性激活。MLIV细胞中自噬体的积累是由于自噬小体新生形成增加以及自噬酶体与晚期内体/溶酶体融合延迟所致。自噬途径的损伤导致p62的水平和聚集增加，表明泛素蛋白的异常积累可能导致MLIV患者的神经退行性变。此外，我们发现MCOLN1缺陷细胞中血小板衍生生长因子受体向溶酶体的传递延迟，这表明MCOLN1对于自噬体和晚期内体与溶酶体有效融合是必要的。我们的数据与最近的证据一致，这些证据表明自噬缺陷可能是许多神经退行性疾病的共同特征。

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数字

图1。
图1。
MLIV患者成纤维细胞自噬增加。(一个)对照组成纤维细胞生长在完全培养基中（未经处理，左侧），在EBSS培养基中饥饿3 h（饥饿，中间）或饥饿3 h，然后在完全培养液中恢复1 h（恢复，右侧），用内源性LC3的多克隆抗体固定、渗透和免疫染色。(B类)未经处理的对照组和MLIV成纤维细胞的LC3染色。值得注意的是，与对照组成纤维细胞的弥漫染色相比，LC3在MLIV成纤维细胞中显示出泡状染色。(C)在完全培养基中生长的MLIV成纤维细胞被固定、渗透并用LC3多克隆抗体（红色）和CD63或p62单克隆抗体（绿色）进行免疫染色。插图显示所示区域的放大倍数为3倍(D类)用抗LC3（绿色）和抗泛素（红色）对未处理的MLIV细胞进行双重免疫染色。共聚焦荧光显微镜检查细胞。将红色和绿色通道中的图像合并，生成每行上的第三张图片；黄色表示重叠定位。比例尺=10µm。
图2。
图2。
MLIV成纤维细胞自噬上调。(一个)对照组和MLIV成纤维细胞在不使用或使用50µg/ml leupeptin的情况下处理7 h。细胞被裂解，并用抗LC3（顶部）或抗肌动蛋白（底部）进行免疫印迹。(B类)（A）中所示实验的量化。自噬被测量为LC3-II/LC3-I的比率，表示为未经处理的对照细胞比率增加了一倍。结果为平均值±SD(n个= 7),P（P）< 0.01. (C)western blot检测对照组成纤维细胞和MLIV成纤维细胞的裂解液中beclin-1和actin的表达。(D类)用肌动蛋白标准化的beclin-1水平的量化显示为对照细胞的倍数增加。结果为平均值±标准差(n个= 9),P（P）< 0.05. (E类)Western blot显示p62在MLIV成纤维细胞的可溶和不可溶部分中积聚。(F类)通过用肌动蛋白水平使p62正常化来进行量化。结果为平均值±SD(n个= 4). 可溶的P（P）< 0.001; 不溶的P（P）< 0.05.
图3。
图3。
MLIV成纤维细胞中自噬体的积聚。对照组成纤维细胞的电子显微照片(一个)和MLIV成纤维细胞(B类). 注意电子致密溶酶体和自噬体的积累[箭头所示示例与(E类)]存在于MLIV细胞中。比例尺=2µm。(C–E类). MLIV成纤维细胞中具有细胞质内容物的膜结合结构的高倍放大图像，与自噬体一致。在(D类)箭头表示线粒体中有嵴。箭头表示线粒体内外膜和自噬体周围双层膜清晰可见的区域。比例尺=200 nm。(F类和G公司)含有同心板层包涵体的MLIV成纤维细胞中的特征溶酶体。比例尺=200 nm。(H（H）)MLIV成纤维细胞的EM图像显示含有同心板层包涵体和细胞质内容物的自体溶酶体。比例尺=200 nm。
图4。
图4。
饥饿诱导MLIV患者成纤维细胞的强烈自噬。(一个)对照成纤维细胞或MLIV成纤维细胞在对照条件下（DMEM）或饥饿3小时后固定，并用内源性LC3抗体进行免疫染色。请注意，如图2所示，在正常情况下，LC3在MLIV成纤维细胞中显示为囊泡染色，而对照成纤维细胞为弥漫染色。饥饿3小时后，自噬进一步增加。比例尺=10µm。（B）从未经处理的细胞（DMEM）中收集来自对照成纤维细胞或来自MLIV患者的成纤维细胞的裂解物，在缺乏或存在50µg/ml亮氨酸肽的情况下饥饿3小时的细胞，或饥饿3小时后恢复1小时的细胞（恢复）。western blot显示内源性LC3（顶部）和肌动蛋白（底部）。（C）自噬以LC3-II/LC3-I的比率进行测量，并表示为正常培养基（DMEM）中对照细胞比率的倍数增加。结果为平均值±S。D(n个= 5). 饥饿+饥饿P（P）< 0.05; DMEM，饥饿P（P）< 0.01; 恢复P（P）< 0.001.
图5。
图5。
MLIV成纤维细胞中自噬体的降解延迟。(一个)对照组和MLIV成纤维细胞在EBSS培养基中饥饿3小时，然后在完全培养基中恢复20或40分钟。然后固定细胞，用免疫荧光检测LC3定位。比例尺=10µm。(B类)恢复20分钟（左侧面板）或40分钟（右侧面板）后，显示20个以上、10到20个或10个以下LC3阳性结构的细胞百分比。
图6。
图6。
MLIV成纤维细胞中自噬体和溶酶体的融合延迟。(一个)MLIV成纤维细胞饥饿3小时，然后在完全培养基中恢复20或40分钟。细胞固定、渗透并用LC3多克隆抗体（绿色）和CD63单克隆抗体（红色）进行免疫染色。插图放大3倍。共聚焦荧光显微镜检查细胞。将红色和绿色通道中的图像合并，生成每行上的第三张图片；黄色表示重叠定位。比例尺=10µm。(B类)在恢复20或40分钟后，对对照组和MLIV成纤维细胞中自噬体-溶酶体融合事件的百分比进行量化，作为与溶酶体标记CD63共定位的LC3阳性结构的分数。恢复20分钟，P（P）< 0.01; 40分钟恢复，P（P）< 0.05.
图7。
图7。
MCOLN1的过度表达增加了自噬。(一个)用GFP-LC3转染NRK细胞24 h。未经处理的细胞，在EBSS培养基中饥饿3 h（饥饿，中心）或饥饿3 h，然后在完全培养基中恢复1 h（恢复，右侧），固定并用共焦荧光显微镜检查。比例尺=10µm。(B类)用GFP-LC3和MCOLN1-FLAG联合转染NRK细胞，固定并用FLAG抗体染色。比例尺=10µm。(C)正常情况下（未经治疗）、饥饿3小时后或恢复1小时后，在没有或存在MCOLN1-FLAG的情况下，以水泡模式表达GFP-LC3的细胞百分比。结果为平均值±SD(n个=300），P（P）< 0.001.
图8。
图8。
MLIV成纤维细胞PDGFR下调受损。(一个)对照组成纤维细胞和MLIV成纤维细胞在含有0.1%BSA的DMEM中饥饿16小时，并与100 ng/ml PDGF-BB孵育指定时间。然后对细胞进行裂解，进行SDS-PAGE并用PDGFR抗体进行免疫印迹。作为负荷控制，还对裂解液进行肌动蛋白印迹。(B类)从三个独立实验中量化相应PDGFR波段的光密度。
图9。
图9。
MLIV患者自噬缺陷诱导神经退行性变的机制模型。在MCOLN1缺失细胞中，沿晚期内体/溶酶体途径的贩运受到干扰。因此，自噬体和溶酶体之间的融合被延迟从头开始自噬体的形成增加。自噬途径的功能障碍导致蛋白质聚集和细胞器转换缺陷，从而使细胞，尤其是神经元更容易受到细胞死亡的影响。
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