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细胞生物学杂志。2005年11月21日；171(4): 603–614.
数字对象标识：10.1083/jcb.200507002
预防性维修识别码：PMC2171557型
PMID：16286508
第条

p62/SQSTM1形成自噬降解的蛋白质聚集体，对亨廷顿蛋白诱导的细胞死亡具有保护作用

盖尔·比约克,1 特隆·拉马克,1 安德烈亚斯·布雷奇,2 海蒂·欧琴,1 玛丽亚·佩兰德,1 AudØvervatn公司,1 哈拉尔德·斯坦马克,2和泰耶·约翰森1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

泛素化蛋白聚集体的自噬降解对细胞生存很重要，但自噬机制如何识别这种聚集体尚不清楚。在这项研究中，我们报告了多泛素结合蛋白p62/SQSTM1的聚合产生的蛋白质体，要么游离于细胞质和细胞核中，要么出现在自噬体和溶酶体结构中。抑制自噬导致p62小体的大小和数量以及p62蛋白水平的增加。自噬标记轻链3（LC3）与p62小体共定位，与p62共免疫沉淀，表明这两种蛋白参与相同的复合物。在饥饿条件下，p62的缺失抑制LC3向自噬体的募集。引人注目的是，p62和LC3在突变体亨廷顿蛋白聚集体周围形成了一个外壳。p62蛋白水平的降低或对p62功能的干扰显著增加了突变体亨廷顿蛋白表达诱导的细胞死亡。我们认为p62可能通过LC3参与将多泛素化蛋白聚集体连接到自噬机制。

介绍

一些报告描述了p62，也称为固碳体1（SQSTM1），是蛋白质聚集物的一种常见成分，在影响大脑和肝脏的蛋白质聚集性疾病中发现。其中包括帕金森病中的路易体、阿尔茨海默病中的神经原纤维缠结和亨廷顿蛋白聚集体(Kuusisto等人，2001a,2002;Zatloukal等人，2002年;长冈等人，2004年). 在肝Mallory小体中，肝细胞癌中的透明小体和α1抗胰蛋白酶聚集体含有p62(Zatloukal等人，2002年). 所有这些聚集体都含有多泛素化蛋白质。440氨基酸长的p62蛋白含有NH2-末端Phox和Bem1p（PB1）结构域之后是ZZ型锌指结构域、包含假定磷酸化位点的PEST区域和COOH末端泛素相关（UBA）结构域(Geetha和Wooten，2002年). 后一结构域非共价结合泛素(Vadlamudi等人，1996年). 这增加了p62通过UBA结构域结合多泛素的能力而被招募到泛素化蛋白聚集体中的可能性(Donaldson等人，2003年). NH公司2-末端PB1结构域既用于p62的聚合，也用于与其他包含PB1结构区的蛋白质结合(Gong等人，1999年;Sanz等人，1999年,2000;Avila等人，2002年;Cariou等人，2002年;Lamark等人，2003年).

氧自由基应激后p62蛋白水平升高。mRNA和蛋白质水平均增加，表明基因转录受到诱导(石井等人，1997年). 氧化应激后转录因子Nrf2被激活，Nrf2基因敲除小鼠细胞中p62的诱导受到严重抑制(石井等人，2000年). 蛋白酶体活性的抑制也会导致p62的诱导(石井等人，1997年;Kuusisto等人，2001b;汤普森等人，2003年). 有趣的是，最近发现p62是一种对突变体亨廷顿蛋白表达的诱导反应蛋白(长冈等人，2004年). 亨廷顿病（Huntington’s disease）是一种迟发性进行性常染色体显性神经退行性疾病，由亨廷顿蛋白（Htt）突变型的表达引起，Htt蛋白含有由CAG重复序列编码的多聚谷氨酰胺扩张，其外显子1是一种神经系统疾病亨廷素基因(Vonsatel和DiFiglia，1998年). 这种疾病导致纹状体选择性神经元死亡。表达亨廷顿蛋白突变形式的细胞显示蛋白质的扩散和聚集定位。突变蛋白具有细胞毒性，聚集似乎是细胞存活的机制(Arrasate等人，2004年). 由具有聚谷氨酰胺和聚丙氨酸扩张的聚集倾向性蛋白质形成的蛋白质内含物被大自噬降解（以下简称自噬；Kegel等人，2000年;Ravikumar等人，2002年,2004)，这是一种大规模降解途径，其中形成一种称为自噬体的双膜或多膜结合结构来隔离细胞质。随后，自噬体与溶酶体融合，其内容物和内膜在回收大分子时被降解(莱文和克林斯基，2004年;吉森，2004). 大多数长寿蛋白质和一些细胞器被自噬降解，自噬除了细胞内环境稳定外，还与细胞分化、组织重塑、生长控制、细菌和病毒感染、细胞防御、对不利环境的适应、神经退行性疾病、心肌病、，细胞凋亡与癌症(Cuervo，2004年). 在自噬体标记蛋白中，酵母中的Atg8和哺乳动物中的轻链3（LC3）(Kabeya等人，2000年). 合成后，LC3在其COOH末端被裂解，产生细胞溶质LC3-I形式。LC3-I转化为LC3-II，LC3-II可能通过与磷脂酰乙醇胺的偶联与自噬体膜紧密结合(Kabeya等人，2000年,2004).

在本研究中，我们报告了多泛素结合和均聚p62蛋白可能通过LC3参与将多泛素化蛋白聚集体连接到自噬机制，促进此类聚集体的清除，从而有助于降低突变亨廷顿蛋白表达的毒性。

结果

HeLa细胞细胞质中的p62体是含有泛素的蛋白质聚集体

据报道，p62蛋白存在于神经退行性疾病和其他蛋白聚集性疾病的几种细胞质内含物中(Zatloukal等人，2002年). 在之前的一项研究中，我们注意到内源性和异位表达的p62存在于人类HeLa细胞核周区域的许多圆形体中(Lamark等人，2003年). 通过使用单克隆和多克隆抗体进一步研究，发现p62蛋白位于细胞质中，约85%的细胞的细胞核染色较弱(图1A） ●●●●。在细胞质中，蛋白质富含圆形小体，直径从共焦显微镜的检测极限（0.1μm）到2μm不等。这些结构似乎有两种不同的类型：大量直径为0.1–0.2μm的微弱天体和直径为0.5至1μm的强度为5–10倍的天体。有趣的是，约5%的细胞群含有直径为1-2μm的大p62小体。在～15%的细胞中，细胞质和细胞核的荧光强度相似。核p62富含斑点或小体，少数细胞（～0.5%）显示p62的核聚积，直径为0.5–1μm的p62小体的染色强度是弥漫核p62的5–10倍。从广义上讲，这种p62定位模式在广泛的细胞系中观察到，包括HeLa、HEK293、MDCK II、U2OS、A431、HT1080、TERT成纤维细胞、NIH3T3成纤维细胞和一些人类神经母细胞瘤细胞系。尽管p62异质分布的原因尚不清楚，但很明显，p62小体以一种或另一种形式广泛存在于各种细胞类型中。

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HeLa细胞细胞质中的p62小体是含泛素的蛋白质聚集体。（A） HeLa细胞固定后进行p62染色。p62在>200个细胞中的分布模式不同，表现为胞质小体、胞质大体和密集体、细胞核和细胞质染色相等以及细胞核富集。显示了各组中的细胞百分比。（B） GFP-p62在HeLa细胞中的表达水平（稳定表达GFP-p62S–GFP-p六十二）与内源性p62在母细胞HeLa中的水平相比。（C） 稳定表达GFP-p62的细胞显示与内源性p62类似的GFP-标记p62的细胞质间断定位。活细胞的视频显微镜显示，小而微弱的身体（细箭头）显示出定向迁移，而大多数较大而强烈的身体（粗箭头）则不迁移（视频1和2，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200507002/DC1). 此处显示视频1中的静态图像。（D） 含有内源性p62或瞬时或稳定转染GFP-p62的机体均含有多泛素。将HeLa细胞固定，分别用p62和多泛素（克隆FK1）单克隆抗体直接偶联AlexaFluor555（红色）和AlexaFluxor488（绿色）染色。表达GFP-p62的细胞只被染色为多泛素（红色）。棒材，20μm。

我们生成了一个HeLa细胞系（稳定的[S]GFP-p62），该细胞系稳定地表达了适度水平的GFP-p62-融合蛋白，其水平大约是母细胞系的四倍(图1B） ●●●●。S–GFP-p62细胞系显示了图1A、 但大型圆体动物的数量从5%增加到40%。GFP标记的p62融合蛋白的视频共聚焦显微镜也表明p62小体可以分为两个群体(图1C和视频1和2，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200507002/DC1)：大量微弱、可移动的物体（大多数小于0.3μm）和较大的物体（>0.5μm），流动性低或无流动性。值得注意的是，这些较大且标记更强烈的结构在整个结构中都具有相同的荧光，表明它们不是囊泡。这些身体似乎是通过融合生长的，它们的大小和强度随着表达水平的增加而增加。总之，这些结果表明p62体代表了两个不同的种群，它们在大小、强度和移动性方面都有所不同。重要的是，据共焦荧光显微镜观察，所有p62小体都含有泛素(图1D） ●●●●。这与p62通过其UBA结构域与多泛素结合的能力一致。

p62形成细胞质体需要PB1和UBA结构域

为了绘制参与胞质体形成的p62结构域，将不同GFP-p62 cDNA构建物瞬时转染NIH3T3细胞，并用共焦荧光显微镜分析融合蛋白(图2A） ●●●●。使用NIH3T3细胞是因为它们具有低水平的内源性p62，但用HeLa细胞获得了类似的数据（未描述）。所有缺失PB1结构域的缺失结构体（即p62（124-440）、p62（256-440）和p62（385-440））在NIH3T3细胞中具有完全扩散分布(图2A和未描述）。D69A突变体也是如此，它废除了p62的PB1结构域介导聚合(图2A；Lamark等人，2003年). 这强烈表明，p62的PB1结构域介导聚合对细胞质体的形成至关重要。

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p62形成细胞质体需要PB1和UBA结构域。（A） 所示缺失结构是COOH末端与GFP融合，并在NIH3T3成纤维细胞中表达。星号分别表示PB1（D69A）和UBA（I431A）域中的点突变。（B） 用指示的myc标记的p62构建物瞬时转染S–GFP-p62细胞，固定并染色myc标记。棒材，20μm。

鉴于其与多泛素结合的能力，UBA结构域可能需要用于细胞质体的形成。为了支持这一点，我们发现一个缺乏UBA结构域（p62（1–385））的结构体和影响UBA结构区折叠的I431A突变体在转染NIH3T3细胞中均表现出扩散定位(图2A） ●●●●。p62（1–122）的孤立PB1结构域形成了大体(图2A） 以及包含1–256个氨基酸的结构（未描述）。然而，我们一致观察到，这些截短的p62结构形成的结构是不同的，与全长p62形成的圆体相比，形状不太规则。相比之下，仅包含PB1和UBA结构域（p62Δ123–385）的结构体形成了与全长p62形成的结构体无法区分的结构体。这些数据表明，PB1和UBA结构域对于全长p62定位到含泛素体中是必要的和充分的。

在体内，由于p62与其他PB1结构域相互作用伙伴的结合，p62聚合物的长度可能会缩短。与此一致，p62 D69A的过度表达(图2B） 或p62 R21A（未描述）抵消了S–GFP-p62细胞中GFP-p六十二小体的形成。这些PB1结构域突变体可能与野生型p62竞争，以结合到作为链终止剂的不断增长的p62分子链。然而，p62ΔUBA构建物myc-p62（1–385）的过度表达也阻止了S–GFP-p62细胞中细胞质点的形成(图2B） ●●●●。与PB1突变体相比，UBA结构域的缺失对p62与自身相互作用或体外形成聚合物的能力没有影响（未发表的数据）。体外聚合p62只需要PB1结构域。因此，UBA结构域的作用可能是通过与多泛素化蛋白质相互作用交联p62聚合物。

p62小体既可以作为无膜蛋白聚集体（隔离体），也可以作为膜限制的自噬体和溶酶体结构

为了表征p62小体的两个群体，我们在固定细胞和活细胞中进行了一系列共定位实验。我们观察了内源性p62和外源性表达的GFP-p62或表位标记的p62。早期内体标记与p62小体没有共定位。早期内体抗原1（EEA1）没有与内源性p62或外源性表达的GFP-p62共定位(图3A） ●●●●。与此一致，在内化15分钟的时间点，p62和EGF受体（固定细胞）或荧光标记的EGF（活细胞）之间没有共定位（未发表的数据）。然而，在30和60分钟时，有一小部分较小的p62小体与EGF受体或其配体共定位（未公布的数据）。此外，通过荧光标记的转铁蛋白的内化，GFP-p62与回收室没有关联（未发表的数据）。因此，这些数据表明，弱染色的较小p62小体可能是晚期内体或溶酶体。CD63常被用作晚期内体/溶酶体的标记物，在多泡内体中高度富集(Escola等人，1998年). 在S–GFP-p62细胞中，用抗CD63抗体进行免疫染色，发现与较小GFP-p六十二结构的一部分共定位(图3B） ●●●●。大p62小体的CD63始终为阴性。通过对CD63和GFP抗体进行免疫电镜检测，发现了同时含有CD63和GFP-p62的囊泡，尽管CD63和绿色荧光蛋白p62也存在于同一囊泡结构中的不同隔室中(图3C） ●●●●。

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p62小体既可以作为无膜蛋白聚集体，也可以作为膜限制的自噬体和溶酶体结构。（A） 含有内源性p62或瞬时表达GFP-p62的小体相对于EEA1阳性早期内体的定位。用AlexaFluor488直接标记的p62抗体将内源性p62染成绿色，用AlexaFuor555直接标记的EEA1单克隆抗体将EEA1染成红色。或者，瞬时表达的GFP-p62在HeLa细胞中表达，EEA1用EEA1单克隆抗体染色为红色（底部）。方框区域以较高的放大倍数显示在右侧。（B） 在稳定表达GFP-p62的HeLa细胞中GFP-p82和CD63的染色（用单克隆抗体染色为红色）。（C） 用GFP pAb（10-nm金颗粒，箭头）和单克隆CD63（15-nm金颗粒、箭头）染色的S–GFP-p62的免疫电子显微照片。（D） 从LysoTracker阳性酸性细胞器中快速洗涤剂提取GFP-p62。用LysoTracker标记瞬时表达GFP-p62的HeLa细胞60分钟。在添加1%Triton X-100后，以15秒的时间间隔对洗涤剂提取液进行成像。盒状区域显示在底部两幅图像中，在提取洗涤剂之前和之后以较高的放大倍数显示。棒材（A、B和D），20μm。

为了进一步分析p62是否部分定位于晚期内体/溶酶体室，我们利用荧光染料LysoTracker，当它面对晚期内体或溶酶体室内的酸性环境时，会显示出强烈的荧光。如所示图3D、 LysoTracker标记了p62小体的一个亚组分，这些结构被洗涤剂萃取后迅速丢失，而高浓度小体具有抗洗涤剂能力。作为对照，我们对GFP标记的p40phox进行了相同的实验，它与p62类似，包含PB1结构域，但位于内体中。正如预期的那样，在LysoTracker荧光消失的同时，从内体中提取p40phox（图S1，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200507002/DC1).

我们无法通过免疫电镜检测内源性p62。然而，通过对S–GFP-p62细胞进行免疫电镜，我们观察到无膜蛋白聚集体（隔离体）和膜包围的p62小体(图4A） ●●●●。为了在超微结构水平上进一步表征固位体，我们进行了相关的免疫荧光和EM。蛋白酶体抑制剂如PSI可诱导细胞内p62蛋白的数量显著增加(Kuusisto等人，2001b;汤普森等人，2003年). 我们利用这一点增加HeLa细胞内内源性p62小体的大小，以促进EM/免疫荧光研究。结果表明，大而强荧光的p62结构是与内吞小泡无关的无膜蛋白聚集体(图4B） ●●●●。聚集物具有丝状外观，似乎排除了任何细胞溶质物质。在稳定转染的细胞系和瞬时转染的HeLa细胞中，都发现p62位于表明自噬体的双膜结构中(图4C） ●●●●。自噬结构和自溶体是S-GFP-p62细胞中p62小体的主要组成部分。

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p62既存在于自噬体中，也存在于细胞溶质聚集体/固定体中。（A） GFP-p62的免疫电镜。用兔抗GFP（Abcam）标记S-GFP-p62细胞，然后用蛋白A-金（15nm）标记。我们在无膜胞质结构和螯合体（箭头）以及内体（Endo）中观察到标记。（B） 用10μM PSI处理5 h的HeLa细胞的相关免疫荧光/EM显示典型的隔离体。插图显示了两个标记为1的隔离体放大图。（C） 含有p62的自噬体的代表性图像。转染GFP-p62的HeLa细胞被免疫金标记为A。注意GFP-阳性物质周围的池样膜（箭头）。箭头表示融合的内体。

p62小体被自噬降解

GFP-p62在自噬体内的存在表明p62小体被自噬降解。将细胞添加到35S标记的蛋氨酸表明p62在HeLa细胞中的半衰期为～6小时，24小时后几乎所有放射性标记蛋白都消失了(图5A） ●●●●。众所周知，蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺可显著降低自噬诱导的蛋白质降解(劳伦斯和布朗，1993年;Abeliovich等人，2000年). 一直以来，用环己酰亚胺处理24小时的细胞中p62蛋白的水平是稳定的(图5A） ●●●●。

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p62小体被自噬降解。（A） 脉冲相位标记法对p62降解的比较35环己酰亚胺（CHX）处理后的S-蛋氨酸和免疫印迹。HeLa细胞经脉冲处理35S-蛋氨酸，并在非放射性介质中培养指定时间。免疫纯化后，用放射自显影法测定放射性p62的含量，用同一膜的免疫印迹法测定p62的总量。通过免疫印迹法测定不同时间10μg/ml环己酰亚胺处理后细胞总裂解物中的p62水平（底部）。（B） p62和LC3-II水平随着自噬活性的变化而变化。HeLa或S–GFP-p62细胞未经处理或添加雷帕霉素（10μg/ml）或巴非霉素A1（Baf.A1；10μg/ml）18小时。使用LC3、p62和肌动蛋白抗体依次检测免疫印迹。（C和D）定位于细胞质体的p62的数量随着自噬的抑制而增加。HeLa细胞或S–GFP-p62 HeLa电池未经处理或添加巴非霉素A1 18小时，固定细胞，使用p62 mAb（C）将p62染成红色或直接成像（D）。使用Draq5 DNA染色观察细胞核。处理细胞和未处理对照细胞的成像设置相同。（E） 大多数S–GFP-p62胞质体被识别瞬时表达LC3的抗体染色。用myc-LC3瞬时转染S–GFP-p62细胞。使用抗Myc标记单克隆抗体将Myc-LC3染成红色。方框区域表示以较高的放大倍数显示在左侧的单元格部分。棒材，5μm。

为了进一步探讨自噬与p62降解之间的关系，用雷帕霉素处理细胞，雷帕霉素是自噬的诱导剂(Noda和Ohsumi，1998年)或巴非霉素A1。巴氟霉素A1是液泡ATP酶的抑制剂，它阻断自噬体与溶酶体的融合，导致自噬体结构的积累(山本等人，1998年). 雷帕霉素处理引起内源性p62的轻微降低，而巴非霉素A1处理18小时导致HeLa细胞中内源性p62的积累(图5B） ●●●●。它还导致S–GFP-p62细胞中内源性和GFP标记的p62增加(图5B） ●●●●。在隔离膜形成后，LC3参与自噬的后期步骤(Klionsky，2005年). 未修饰的LC3-I形式是细胞溶质，而LC3-II可能在其COOH末端共价连接到磷脂酰乙醇胺，并与自噬体膜紧密结合，是自噬的重要标志(Kabeya等人，2000年,2004;水岛，2004年). 具有LC3抗体和LC3-II形式最高亲和力的Western blot(Kabeya等人，2000年)用巴非霉素A1处理HeLa细胞和S–GFP-p62细胞后，显示出LC3-II的强烈诱导作用(图5B） ●●●●。有趣的是，S–GFP-p62细胞中LC3-II的背景水平高于亲本HeLa细胞，这表明这些细胞中的自噬活性更高(图5B） ●●●●。与Western blot数据一致(图5B） ，免疫染色显示，用巴非霉素A1处理的HeLa细胞中广泛积聚了小p62小体（0.3–0.8μm）(图5C） ●●●●。同样，经巴非霉素A1处理后，S–GFP-p62细胞中积聚的含有GFP-p62-的小点(图5D） ●●●●。用3-甲基腺嘌呤处理细胞，抑制了自噬过程中的隔离步骤，也导致了p62在胞质点中的积聚，尽管效果不如巴非霉素A1明显(图5D） ●●●●。

目前，还没有抗体可用于哺乳动物细胞内源性LC3的免疫染色，并且只能使用抗myc抗体检测到myc-LC3的过度表达。瞬时转染后，myc-LC3存在于HeLa细胞（未描述）中内源性p62形成的大部分细胞质体中，并且在S–GFP-p62细胞中也与GFP-p60强共定位(图5E） ●●●●。一般来说，很难找到不含p62的myc-LC3阳性点。值得注意的是，在HeLa细胞中，自噬体很小，通常在荧光显微镜下显示为点(水岛，2004年). 在用巴非霉素A1处理的细胞中，含有p62和myc-LC3的细胞质体大量堆积（未公布的数据）。GFP-LC3与p62的共表达与一种新的非常明亮的红色荧光蛋白tdTomato融合(Shaner等人，2004年)，实现了活细胞中p62-LC3阳性体的可视化。共存于tdTomato-p62和GFP-LC3的HeLa细胞的视频共聚焦显微镜显示，许多含有p62和LC3的标点结构具有高迁移率（视频3，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200507002/DC1).

LC3在形成过程中与隔离膜相关，并在球形自噬体形成后留在膜上。因此，短暂过度表达的GFP-LC3被证明是一个很好的自噬标记物，因为当自噬被诱导时，其定位从弥散型变为点状或点状(水岛，2004年). GFP-LC3点代表隔离膜和自噬体(水岛，2004年). 氨基酸饥饿诱导自噬，并导致自噬体数量的短暂增加。与此相一致，我们发现在Hanks培养基中氨基酸饥饿60分钟后，HeLa细胞中GFP-LC3在间断结构中的比例从27%增加到53%。几乎所有LC3阳性体都对内源性p62呈阳性染色(图6A） ●●●●。有趣的是，过度表达的LC3重新分布到间断结构似乎取决于p62的存在。在两次转染小干扰RNA（siRNA）以耗尽内源性p62的细胞中，很少有细胞含有间断的GFP-LC3结构(图6A） ●●●●。相反，HA-p62的共同表达强烈增加了GFP-LC3间断表达的细胞的频率(图6A） ●●●●。D69A突变体的共表达抑制PB1结构域介导的聚合，导致p62的扩散定位(Lamark等人，2003年)，也导致GFP-LC3的扩散定位(图6A） ●●●●。与GFP-LC3和p62之间的直接或间接关联相一致，内源性p62和过度表达的HA-p62均与HeLa细胞提取物中的GFP-LC2免疫沉淀(图6B） ●●●●。当D69A突变体过度表达时，由于没有形成p62的聚合物，共免疫沉淀的p62较少。然而，当缺乏UBA结构域的p62突变体与GFP-LC3共表达时，内源性p62和p62ΔUBA都有效地共免疫沉淀(图6B） ●●●●。综上所述，上述结果表明LC3和p62小体之间存在密切联系，并且大部分p62小体能被自噬降解。

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p62是HeLa细胞中GFP-LC3阳性间断结构形成所必需的。（A） 单独转染GFP-LC3的HeLa细胞，或与抗p62、HA-p62或HA-p62 D69A的siRNA共转染HeLa的细胞，要么留在正常培养基中，要么饥饿氨基酸1小时。固定细胞，用p62单克隆抗体对p62进行染色。对每种情况下随机选择的200多个细胞进行GFP-LC3细胞质模式评分，无论是弥散型还是间断型。右侧显示了GFP-LC3阳性细胞的频率和标点定位。（B） 内源性p62以及共表达myc标记的野生型p62或p62的UBA缺失突变，与HeLa细胞提取物中的GFP-LC3免疫沉淀。共转染指定的结构后，从总细胞提取物中免疫沉淀GFP或GFP-LC3。如图所示，细胞培养物要么未经处理，要么缺乏氨基酸1小时。使用p62单克隆抗体检测铜化内源性或外源性表达myc标记的p62结构体。棒材，20μm。

p62在亨廷顿蛋白聚集体周围形成外壳

在许多聚集性疾病中，p62蛋白与蛋白质聚集体相关(Kuusisto等人，2001a;Zatloukal等人，2002年;长冈等人，2004年). 然而，p62在处理此类骨料中的作用尚不清楚。为了开始分析p62的可能功能作用，我们选择了一个已建立的模型，其中我们表达了NH2-亨廷顿蛋白的末端片段（氨基酸1–171）含有68个氨基酸的聚谷氨酰胺扩增物（N-HttQ68），该扩增物被发现是导致疾病发展的原因(Saudou等人，1998年). Flag-tagged N-HttQ68的表达导致约30%的表达细胞形成细胞质聚集体，p62和N-HttQ68在这些聚集体结构中强烈共定位(图7A） ●●●●。这些结构还含有泛素（图S3，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200507002/DC1). 在其余的细胞中，N-HttQ68蛋白在胞浆中扩散分布。含有亨廷顿蛋白聚集体的细胞似乎也表达高水平的p62，而含有弥散亨廷顿的细胞免疫染色的p62没有增加。高分辨率的共焦显微镜显示，p62明显在含有GFP–N-HttQ68–的聚集体周围形成了一个外壳(图7B） ●●●●。然而，一种可能性是抗体可能不会渗透到聚集物的核心，从而产生含有p62的外壳的错觉。因此，为了更严格地测试这一点，我们表达了DsRed2标记的p62和GFP–N-HttQ68，并在共焦显微镜下观察到活细胞。通过这种策略，很明显DsRed-p62在亨廷顿聚集体周围形成了一个外壳(图7C） ●●●●。仅DsRed2蛋白与亨廷顿蛋白聚集体没有任何关联（图S2，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200507002/DC1). 类似地，当p62融合到非聚集性、荧光非常明亮的tdTomato上时，观察到许多p62围绕GFP–N-HttQ68聚集物的结构(图7D） ●●●●。还可以看到稳定表达的GFP标记的p62包围了瞬时表达的Flag-HttQ68的聚集体（未示出）。以前已经证明亨廷顿蛋白聚集体是通过自噬降解的(拉维库马尔等人，2002年,2004). 有趣的是，我们发现myc-LC3蛋白在S–GFP-p62细胞中定位于含有GFP-p六十二和Flag–N-HttQ68的结构(图7E、 顶部）。通过共表达Flag–N-HttQ68和tdTomato-LC3，我们能够表明LC3是亨廷顿蛋白聚集体周围外壳的一部分(图7E、 底部）。我们推测，亨廷顿蛋白聚集体周围含有p62/LC3的外壳可能用于标记这些蛋白的自噬降解。

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p62在亨廷顿蛋白聚集体周围形成一个外壳。（A） 瞬时表达标记NH的HeLa细胞2-亨廷顿蛋白的末端片段（氨基酸1–171），包含68聚谷氨酰胺扩展，Flag–N-HttQ68。48小时后，固定细胞，并使用Flag单克隆抗体将Flag–N-HttQ68染成绿色。使用p62 pAb将内源性p62染成红色。（B） 内源性p62在聚集的GFP–N-HttQ68周围形成外壳。转染48小时后固定瞬时转染的HeLa细胞，并使用p62 mAb（红色）检测内源性p62。（C和D）GFP–N-HttQ68周围的p62外壳独立于抗体的使用进行检测。（C） 将GFP–N-HttQ68和DsRed标记的p62共转染到HeLa细胞中，表达48小时后获得活细胞图像。左侧面板显示了具有代表性的GFP–N-HttQ68和DsRed-p62双正结构的一个共焦平面，右侧面板显示了平面的Z堆叠，侧面和顶部有骨料的侧视图。N、 核心。使用Draq5检测（A–C）Nuclei。（D） 将GFP–N-HttQ68和tdTomato标记的p62共转染到HeLa细胞中，表达24小时后获得活细胞图像。（E） 瞬时表达的Flag–N-HttQ68和myc-LC3在GFP-p62阳性结构中共定位。转染后48 h固定S–GFP-p62细胞，Flag–N-HttQ68用Flag标记单克隆抗体染色为红色，myc-LC3用鸡myc标记单克隆疫苗染色为远红色（蓝色）（上图）。底部面板显示了GFP–N-HttQ68聚集体的活细胞图像，该聚集体被一个包含tdTomato-LC3的外壳包围。棒材，5μm。

p62对多聚谷氨酰胺扩增的亨廷顿蛋白过度表达诱导的细胞死亡具有保护作用

N-HttQ68的表达导致了细胞凋亡的诱导，表现为GFP阳性、圆形和分离的细胞，细胞核浓缩或破碎(图8A） ●●●●。野生型N-HttQ17的表达与GFP对照组（未描述）的凋亡水平相同。在表达48小时后诱导细胞死亡的HttQ68的百分比在不同的实验中有所不同，GFP-HttQ68-转染HeLa细胞的17到46%不等，五个独立实验的平均值为29%。我们一致观察到，通过表达p62反义RNA降低内源性p62水平会增加GFP–N-HttQ68–表达细胞的凋亡。在仅表达GFP的对照细胞中，凋亡也有不太明显但显著的增加(图8B） ●●●●。此外，表达针对p62的siRNA导致内源性p62水平降低，并且在表达突变的亨廷顿蛋白后，凋亡相应增加（未发表的数据）。有趣的是，缺失UBA结构域的p62缺失结构体（p62ΔUBA）的共同表达显著增加了表达huntingtin的凋亡细胞的频率(图8B） ●●●●。这些发现在HeLa细胞和神经母细胞瘤细胞系SHSY-5Y中都观察到。由于反义RNA或siRNA对p62的消耗以及p62ΔUBA过度表达对p62小体形成的干扰增加了亨廷顿蛋白诱导的细胞死亡，我们推断，通过过度表达p62提高p62水平可能具有保护作用。我们确实可以在每次实验中观察到一个小的保护作用(图8B） 但是HeLa细胞已经有相当高的p62表达水平，仅仅是过度表达就可以将p62直接导入固位体。总之，这些结果表明p62对亨廷顿蛋白诱导的细胞死亡具有保护作用。

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干扰p62蛋白水平或功能会增加突变亨廷顿蛋白诱导的细胞死亡。（A） 核Draq5染色显示GFP阳性细胞为活细胞或凋亡细胞。表达48小时后，GFP阳性细胞附着在表面，具有正常的细胞核外观（开放箭头），并被评分为活的，而具有浓缩或碎片细胞核（箭头）的圆形、部分分离的细胞被评分为死的。在随机选择的显微镜视图中，对200多个GFP阳性细胞进行了评分。棒材，20μm。（B） 共表达p62反义结构体或缺失UBA结构域的p62缺失结构体对N-HttQ68诱导HeLa和SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞死亡的影响。

讨论

蛋白质在真核细胞中通过两条主要途径降解。短寿命蛋白质被蛋白酶体降解，而长寿命蛋白质则被自噬降解。在氧化应激和其他条件下形成的蛋白质聚集体会导致蛋白质的错误折叠和聚集，如聚谷氨酰胺和聚丙氨酸扩张突变，这些蛋白质聚集体通过自噬降解(Ravikumar等人，2002年,2004). 自噬通常被认为是一种非特异性的体降解机制。目前尚不清楚自噬机制是否对多泛素化蛋白聚集体具有特异性识别或靶向性。

我们的数据表明，p62可能将多泛素化蛋白与自噬机制联系起来。该功能似乎依赖于p62通过NH的聚合2-通过p62的COOH-末端UBA结构域结合PB1末端结构域和多泛素。内源性和外源性表达的p62都可以与自噬标记LC3共纯化。p62和LC3均与突变体亨廷顿蛋白聚集体共定位。最近研究表明，这种聚集体会被自噬降解(Ravikumar等人，2002年,2004). 最近，对Atg7条件敲除小鼠的研究表明，清除泛素阳性聚集物需要自噬(小松等人，2005年). 我们发现p62在亨廷顿蛋白聚集体周围形成了一个外壳。在HeLa和SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞中，在反义RNA介导的p62水平缺失或通过表达缺乏UBA结构域的p62缺失突变体干扰p62功能后，由聚集蛋白突变体亨廷顿蛋白表达诱导的细胞死亡增加。

我们发现p62位于细胞质中两种不同类型的小体中。第一种结构表现为大蛋白聚集体（隔离体），不被膜包围，在活细胞中流动性很低。然而，S–GFP-p62细胞中的大多数p62小体通常是较小的结构，具有更高的迁移率，与早期内体标记物共定位不良，但与共表达的myc或GFP-标记的LC3强烈共定位。发现大量p62小体与LysoTracker和溶酶体标记CD63共定位，这与p62定位于自噬体一致。通过清洁剂提取活细胞，我们观察到两组p62小体。提取后LysoTracker阳性p62小体迅速丢失，而LysoTracher阴性结构未被1%Triton X-100溶解。这与p62部分位于膜包裹的自噬体和部分位于细胞溶质隔离体一致。氨基酸饥饿诱导自噬导致GFP-LC3标记的自噬体数量明显增加，所有这些都与内源性p62呈正相关。大量p62小体是自噬体的观点也得到了p62-LC3广泛积累的支持，这种阳性结构是用巴非霉素A1处理后在细胞中观察到的。Bafilomycin A1抑制自噬体-溶酶体融合步骤，导致自噬空泡积聚。EM实验证实，p62存在于自噬体和隔离体中，并且p62与CD63在细胞质膜包裹的自噬体内共定位。有趣的是，通过共免疫沉淀，我们发现p62和LC3是相同蛋白复合体的组成部分。应该注意的是，p62与GFP-LC3的共表达并没有增加与LC3共纯化的p62的总量。这表明这种相互作用可能不是直接的，而是取决于第三种限制性细胞因子。这一概念与我们在GST下拉分析中未能检测到GST-p62和体外翻译的LC3之间的任何相互作用一致（未发表的数据）。此外，抑制p62聚合的p62 D69A突变体与GFP-LC3的共免疫沉淀效率很低，这表明聚合物p62对与LC3的相互作用很重要。我们的数据表明，在HeLa细胞中，需要p62来积累GFP-LC3，以应对氨基酸饥饿。在用siRNA转染后，在缺乏内源性p62的细胞中，没有形成GFP-LC3点来响应氨基酸饥饿。同样，在共表达p62突变体的细胞中也没有形成GFP-LC3点，导致内源性p62的扩散定位。这些结果表明，p62聚合对HeLa细胞自噬体的形成很重要。

先前的研究已经确定p62是氧化应激诱导的应激反应蛋白(石井等人，1997年,2000). 该蛋白质还被确定为蛋白质聚集体中的一种常见成分，在广泛的蛋白质聚集体疾病中发现(Zatloukal等人，2002年). 最近，突变体亨廷顿蛋白的表达被证明能诱导p62(长冈等人，2004年). 有趣的是，蛋白酶体抑制会产生活性氧(Ling等人，2003年)和具有扩展的聚谷氨酰胺延伸的聚集蛋白突变蛋白抑制蛋白酶体活性(Bence等人，2001年). 因此，聚集性疾病中p62的诱导也可能是由活性氧物种引起的。众所周知，前列腺素J2通过降低谷胱甘肽、谷胱甘苷过氧化物酶和线粒体膜电位以及增加蛋白结合脂质过氧化产物的产生来诱导氧化应激(Kondo等人，2001年). 在人类神经母细胞瘤细胞中，p62用于将泛素化蛋白隔离到体内，以应对炎症剂前列腺素J2的治疗(Wang和Figueiredo-Pereira，2005年). 我们目前的结果提供了p62如何识别泛素化蛋白体并将其呈现给自噬机制的分子机制。

突变体亨廷顿蛋白在一些细胞中扩散，在其他细胞中聚集。显然，聚集是细胞生存的一种机制(Arrasate等人，2004年). 与此一致，Steffan等人（2004年）发现突变体亨廷顿蛋白的泛素化是解毒蛋白质的重要途径，而相同残基的sumoylation阻止聚集并导致细胞死亡。自噬对清除亨廷顿蛋白聚集体很重要，诱导的自噬导致表达突变亨廷顿素的细胞存活率增加(Ravikumar等人，2002年,2004). 类似长冈等人（2004）我们发现突变体亨廷顿蛋白也可以在没有p62的情况下形成聚集体。因此，我们认为p62的保护作用可能是将自噬体成分补充到多泛素化蛋白聚集体中，而不是帮助或促进这些聚集体的形成。鉴于自噬在预防蛋白质聚集诱导的神经退行性变中的重要作用，p62和具有相关功能的蛋白质可能是开发神经保护药物的诱人靶点。

材料和方法

细胞转染

使用LipofectAMINE Plus（Invitrogen）转染亚流入HeLa和SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞。使用G418选择稳定的转染体，使用最小稀释度分离GFP阳性克隆并亚克隆两次。使用LipofectAMINE Plus以100nM的24小时间隔转染两次针对p62（Dharmacon）的siGENOME SMARTpool SQSTM1 siRNA寡核苷酸混合物。针对人类组织因子的siRNA（Dharmacon）被用作无关对照。通过免疫印迹验证了siRNA对p62的敲除。

抗体和试剂

使用了以下抗体：抗p62和EEA1单克隆抗体（BD转导实验室）；p62 pAb（Progen Biotechnik公司）；多泛素单克隆抗体（克隆FK1；亲和生物试剂公司）；CD63单克隆抗体（衣阿华大学发育研究杂交瘤库）；抗GFP抗体（Ab290；Abcam有限公司）；抗EGF受体和myc-tag抗体（9E10；圣克鲁斯生物技术公司）；抗肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich）；和LC3抗体（由日本静冈国立遗传研究所吉森氏T菌赠送；Kabeya等人，2000年). 所有Alexa标记的荧光二级抗体、LysoTracker、荧光标记的葡聚糖和EGF以及用于Alexa直接标记单抗的Zenon试剂盒均来自Invitrogen。巴非霉素A1、环氧亚胺、3-甲基腺嘌呤和雷帕霉素均购自Sigma-Aldrich。蛋白酶体抑制剂I（PSI）来自Calbiochem。Draq5来自Biostatus Ltd.Redivue Pro-mix35S-蛋氨酸来自GE Healthcare。

质粒

前面已经描述了以下向量(Lamark等人，2003年)：pCW7-mycUbi（丹麦哥本哈根丹麦癌症协会J.Lukas赠送；Thullberg等人，2000年); pcDNA3-myc-LC3和pEGFP-C1-LC3(Simonsen等人，2004年); 网关入口克隆pENTR-p62和pENTR-p 40phox；网关目的地向量pDestEGFP-C1和pDestmyc；以及网关表达载体pDestHA-p62、pDestmyc-p62、p DestHA-p62 D69A、p Destmyc-p62 D59A、p destEGFP-p62 D69A和pEGFP-p62。pENTR-p62 I431A是通过使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）对pENTR-p 62进行突变而构建的。p62缺失结构pENTR-p62Δ123–386、pENTR-p62（387–440）、pENTR–p62（1–122）、pENTR-p62（124–440，和pENTR-p22（1–385）是通过将pENTR-p62中所示的p62片段亚克隆到网关入口载体（pENTR1A或pENTR3C；Invitrogen）中来实现的。pENTR-Htt（1-171）68Q-Flag是从质粒pcDNA1-Htt（1-177）68Q-Blag（获得于挪威特罗姆索特罗姆索大学U.Moens；Saudou等人，1998年)进入pENTR3C。哺乳动物tdTomato融合表达载体ptdTomato-C1是通过将pEGFP-C1（CLONTECH Laboratories，Inc.）的EGFP基因与来自细菌表达载体pRSET-B-tdTomato（来自加利福尼亚州圣地亚哥加利福尼亚大学R.Tsien；Shaner等人，2004年). 将pEGFP-C1-LC3中的400-bp EcoRI–BamHI片段插入具有相同酶切的ptdTomato-C1中，制成ptdTomaso-LC3。网关目的载体pDest-tdTomato-C1是通过将pDestEGFP-C1的EGFP基因与tdTomato交换而制成的，而网关目的载体p DestDsRED2-C1是通过将网关盒B（网关矢量转换系统；Invitrogen）插入pDsRE02-C1（CLONTECH Laboratories，Inc.）中而构建的。Gateway表达载体pDestDsRED2-p62、pDest-tdTomato-p62、pDestEGFP-p62（1–122）、pDestEGFP-p62（387–440）、pDestEGFP-p62Δ123–386、pDestEGFP-p22（1–385，使用网关重组反应（Invitrogen）制备pDestEGFP-p40phox。反义p62构建体pAS-p62-c是通过重组pAS-p62而制备的(Lamark等人，2003年)用EcoRV消化后。所有结构均通过DNA测序（BigDye；Applied Biosystems）进行验证。用于诱变、PCR和DNA测序反应的寡核苷酸来自Eurogentec。

共聚焦显微镜分析

细胞培养物直接在显微镜下检查，或固定在4%PFA中，并按前面所述进行染色(Lamark等人，2003年). 在37°C的含10%血清的Hanks培养基中对活细胞进行成像，而在PBS中对固定细胞进行RT成像。使用配备40×1.2W C-Apochroma物镜和共焦模块（LSM510 META；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）的显微镜（Axiover 200；Carl蔡司显微成像公司）采集图像并使用LSM5软件3.2版（卡尔蔡司MicroImaging，Inc.）。使用Photoshop（Adobe）处理图像。Z轴叠加视频图像是使用Axiovert显微镜上的成像仪（Ultraview RS Live Cell；PerkinElmer）采集的，该显微镜带有63×NA 1.4平面彩色物镜。在每个时间点，共有8-10个共聚焦1-μm平面覆盖细胞的整个高度。视频是使用Imaging Suite软件（PerkinElmer）获取的，并使用Premiere Pro软件（Adobe）进行压缩。使用LSM510 META共焦模块对单个共焦平面成像，获得双色活细胞视频。视频是使用QuickTime Pro压缩的。

相对长度单位

免疫电镜细胞如前所述固定并嵌入(Peters等人，1991年). 切割小块，注入2.3 M蔗糖1小时，安装在银钉上，并在液氮中冷冻。在−110°C的温度下，在超薄切片机（Ultracut；Leica）上切割超薄冰冻切片，并用2%甲基纤维素和2.3M蔗糖的1:1混合物收集。将切片转移到formvar/碳涂层网格中，用一级抗体标记，然后用桥接二级抗体和蛋白a-金结合物标记，基本上如前所述(Slot等人，1991年). 对于双标记实验，我们在第一个蛋白a-金和第二个一级抗体之间加入了一个阻断步骤（在0.1%戊二醛和0.1M PBS中培养15分钟）。包埋在2%甲基纤维素/0.4%乙酸铀酰中后，我们在电子显微镜（CM10；Philips）中观察到80 kV下的切片。

对生长在网格盖玻片（Eppendorf）上的HeLa细胞进行相关免疫荧光/EM。细胞经PSI处理3h，固定于3%PFA/PBS中（30min），用0.05%皂苷/PBS渗透，用小鼠抗p62（1:2000）标记，然后用驴抗小鼠Cy2（1:500）标记。将样品包埋在moviol中后，在显微镜（LSM510 META；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）上观察，并记录感兴趣细胞的定位。为了进行EM观察，将相同的盖玻片用2%戊二醛固定在0.1 M磷酸盐缓冲液中，并用2%OsO进行后固定4在0.1 M磷酸盐缓冲液中添加1.5%KFeCN。随后，用4%乙酸铀酰将盖玻片整体染色60分钟，在乙醇中脱水，并嵌入Epon中。聚合后，用40%氢氟酸去除盖玻片，并将扁平试样粘在Epon短棒上。随后，将块体切割至荧光显微镜网格盖玻片上观察到的区域，并以50-70-nm的截面厚度平行于基底进行剖切。切片后用柠檬酸铅染色（2分钟）。拍摄电子显微照片，并在Photoshop中覆盖共焦图像。

免疫印迹和免疫沉淀

所有表达结构均由稳定转染后或如前所述瞬时转染24小时后制备的总细胞提取物的免疫印迹控制(Lamark等人，2003年). 用0.14μCi/ml标记细胞35在不含甲硫氨酸的培养基中通过30分钟脉冲进行S-甲硫氨酸，在PBS中洗涤，并在正常培养基中孵育不同时间。使用来自以下来源的总细胞裂解液中的p62单克隆抗体免疫沉淀内源性p6235如前所述的S-甲硫氨酸细胞(Lamark等人，2003年). 使用抗GFP抗体从总细胞提取物中免疫沉淀GFP-LC3。

在线补充材料

视频1显示了在HeLa细胞中表达的S–GFP-p62在2分钟内的迁移。总共收集了130个图像堆栈，时间间隔为1秒。视频2显示了在HeLa细胞中表达的S–GFP-p62在1小时内的迁移。收集了60个图像堆栈，时间间隔为60秒。视频3显示pDest-tdTomato-LC3和GFP-p62在HeLa细胞中瞬时共存的动态运动。对一个共焦平面成像3分钟，时间间隔为4秒。视频1、2和3分别显示为每秒15、6和10帧。图S1显示了HeLa细胞中GFPp40phox-和LysoTracker阳性囊泡的快速洗涤剂提取。图S2显示DsRed荧光蛋白和GFP–N-HttQ68聚集体之间缺乏关联。图S3显示了突变亨廷顿蛋白聚集体中内源性p62和多泛素的积累。在线补充材料可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200507002/DC1.

致谢

我们感谢卑尔根分子成像中心的Hege Avsnes Dale和Endy Spriet为活细胞成像仪的视频图像提供的帮助。我们感谢钱瑞敏赠送的pRSET-B-tdTomato，感谢卢卡斯赠送的pCW7-mycUbi，感谢莫恩和沙特赠送的pcDNA1-Htt（1-171）68Q-Flag，感谢吉森赠送的LC3抗体。

这项工作得到了挪威研究委员会、挪威癌症协会、Aakre基金会、Simon Fougner Hartmanns Familiefond和Blix基金会对T.Johansen的资助。A.Brech是挪威研究委员会挪威功能基因组研究国家计划的职业奖学金获得者。

笔记

本文中使用的缩写：EEA1，早期内体抗原1；LC3，轻链3；PB1、Phox和Bem1p；小干扰RNA；UBA；泛素相关。

工具书类

  • Abeliovich，H.、W.A.Dunn Jr.、J.Kim和D.J.Klonsky。2000.将自噬体生物发生分解为不同的成核和扩张步骤。《细胞生物学杂志》。 151:1025–1034.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Arrasate，M.、S.Mitra、E.S.Schweitzer、M.R.Segal和S.Finkbeiner。包涵体形成降低突变亨廷顿蛋白水平和神经元死亡风险。自然。 431:805–810.[公共医学][谷歌学者]
  • Avila，A.、N.Silverman、M.T.Diaz-Meco和J.Moscat。2002年果蝇属非典型蛋白激酶C-ref（2）p复合物构成toll通路中信号传导的保守模块。分子细胞。生物。 22:8787–8795.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bence，N.F.、R.M.Sampat和R.R.Kopito。2001.蛋白质聚集对泛素-蛋白酶体系统的损害。科学。 292:1552–1555.[公共医学][谷歌学者]
  • Cariou，B.、D.Perdereau、K.Cailliau、E.Browaeys-Poly、V.Bereziat、M.Vasseur-Cognet、J.Girard和A.F.Burnol。2002.适配器蛋白ZIP结合Grb14并通过招募蛋白激酶Czeta调节其对胰岛素信号的抑制作用。分子细胞。生物。 22：6959–6970。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cuervo，A.M.2004年。自噬：在疾病和健康中。趋势细胞生物学。 14:70–77.[公共医学][谷歌学者]
  • 唐纳森、K.M.、W.Li、K.A.Ching、S.Batalov、C.C.Tsai和C.A.Joazeiro。2003.泛素介导的将正常细胞蛋白质螯合到聚谷氨酰胺聚集体中。程序。国家。阿卡德。科学。美国。 100:8892–8897.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Escola，J.M.、M.J.Kleijmeer、W.Stoorvogel、J.M.Griffith、O.Yoshie和H.J.Geuze。在多泡内体的内囊泡和人类B淋巴细胞分泌的外体上选择性富集四跨蛋白。生物学杂志。化学。 273:20121–20127.[公共医学][谷歌学者]
  • Geetha，T.和M.W.Wooten。泛素结合蛋白p62的结构和功能特性。FEBS信函。 512:19–24.[公共医学][谷歌学者]
  • Gong，J.、J.Xu、M.Bezanilla、R.van Huizen、R.Derin和M.Li，1999年。ZIP1和ZIP2对钾通道PKC磷酸化的差异刺激。科学。 285:1565–1569.[公共医学][谷歌学者]
  • 石井、T.、T.Yanagawa、K.Yuki、T.Kawane、H.Yoshida和S.Bannai。低摩尔水平的过氧化氢和蛋白酶体抑制剂诱导小鼠腹腔巨噬细胞中的60-kDa A170应激蛋白。生物化学。生物物理学。Res.Commun公司。 232:33–37.[公共医学][谷歌学者]
  • 石井、T.、K.伊藤、S.高桥、H.佐藤、T.Yanagawa、Y.Katoh、S.Bannai和M.Yamamoto。转录因子Nrf2协同调节巨噬细胞中的一组氧化应激诱导基因。生物学杂志。化学。 275:16023–16029.[公共医学][谷歌学者]
  • Kabeya，Y.、N.Mizushima、T.Ueno、A.Yamamoto、T.Kirisako、T.Noda、E.Kominami、Y.Ohsumi和T.Yoshimori，2000年。LC3是酵母Apg8p的哺乳动物同源物，加工后定位于自噬体膜。EMBO J。 19:5720–5728.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kabeya，Y.、N.Mizushima、A.Yamamoto、S.Oshitani-Okamoto、Y.Ohsumi和T.Yoshimori，2004年。LC3、GABARAP和GATE16根据II型的形成定位于自噬体膜。细胞科学杂志。 117:2805–2812.[公共医学][谷歌学者]
  • Kegel、K.B.、M.Kim、E.Sapp、C.McIntyre、J.G.Castano、N.Aronin和M.DiFiglia。亨廷顿蛋白的表达刺激内体溶酶体活性、内体小管化和自噬。《神经科学杂志》。 20:7268–7278.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Klinsky，D.J.2005年。自噬的分子机制：尚未解答的问题。细胞科学杂志。 118:7–18.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 小松，M.，S.Waguri，T.Ueno，J.岩田，S.村田，I.田田，J.Ezaki，N.水岛，Y.Ohsumi，Y.Uchiyama等人，2005年。Atg7缺陷小鼠饥饿诱导和结构性自噬的损伤。《细胞生物学杂志》。 169:425–434.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kondo，M.、T.Oya-Ito、T.Kumagai、T.Osawa和K.Uchida。环戊烯酮前列腺素作为细胞内氧化应激的潜在诱导剂。生物学杂志。化学。 276:12076–12083.[公共医学][谷歌学者]
  • Kuusisto、E.、A.Salminen和I.Alafuzoff。2001.a.泛素结合蛋白p62存在于人类tau病和突触核蛋白病的神经元和神经胶质内含物中。神经报告。 12:2085–2090.[公共医学][谷歌学者]
  • Kuusisto、E.、T.Suuronen和A.Salminen。2001.b.泛素结合蛋白p62在神经元细胞凋亡和蛋白酶体抑制期间被诱导表达。生物化学。生物物理学。Res.Commun公司。 280:223–228.[公共医学][谷歌学者]
  • Kuusisto、E.、A.Salminen和I.Alafuzoff。阿尔茨海默病神经原纤维缠结中p62的早期积累：缠结形成的可能作用。神经病理学。申请。神经生物学。 28:228–237.[公共医学][谷歌学者]
  • Lamark，T.、M.Perander、H.Outzen、K.Kristiansen、A.Overvatn、E.Michaelsen、G.Bjorkoy和T.Johansen。哺乳动物Phox和Bem1p结构域蛋白家族内的相互作用代码。生物学杂志。化学。 278:34568–34581.[公共医学][谷歌学者]
  • 劳伦斯，B.P.和W.J.布朗。1993年。蛋白质合成的抑制将自噬隔离与溶酶体酶的传递分开。细胞科学杂志。 105:473–480.[公共医学][谷歌学者]
  • 莱文、B.和D.J.克林斯基。2004.自我暗示的发展：自噬的分子机制和生物功能。开发单元。 6:463–477.[公共医学][谷歌学者]
  • Ling、Y.H.、L.Liebes、Y.Zou和R.Perez-Soler。人体H460非小细胞肺癌细胞对新型蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bortezomib）的凋亡反应中的活性氧生成和线粒体功能障碍。生物学杂志。化学。 278:33714–33723.[公共医学][谷歌学者]
  • 水岛，N.2004。监测自噬的方法。国际生物化学杂志。细胞生物学。 36:2491–2502.[公共医学][谷歌学者]
  • Nagaoka，U.、K.Kim、N.R.Jana、H.Doi、M.Maruyama、K.Mitsui、F.Oyama和N.Nukina。2004年。p62在扩张的聚谷氨酰胺表达细胞中的表达增加及其与聚谷氨酰胺内含物的关系。神经化学杂志。 91:57–68.[公共医学][谷歌学者]
  • Noda、T.和Y.Ohsumi。1998年，Tor是一种磷脂酰肌醇激酶同源物，控制酵母中的自噬。生物学杂志。化学。 273:3963–3966.[公共医学][谷歌学者]
  • Peters，P.J.、J.J.Neefjes、V.Oorschot、H.L.Ploegh和H.J.Geuze。1991.高尔基复合体中MHC II类分子与MHC I类分子的分离，以运输至溶酶体隔室。自然。 349:669–676.[公共医学][谷歌学者]
  • 拉维库马尔（Ravikumar）、B.、R.Duden和D.C.Rubinsztein。具有聚谷氨酰胺和聚丙氨酸扩增的聚集倾向性蛋白质被自噬降解。嗯，分子遗传学。 11:1107–1117.[公共医学][谷歌学者]
  • 拉维库马尔（Ravikumar）、B.、C.Vacher、Z.Berger、J.E.Davies、S.Luo、L.G.Oroz、F.Scaravilli、D.F.Easton、R.Duden、C.J.O'Kane和D.C.Rubinsztein。2004年。在亨廷顿病的苍蝇和小鼠模型中，抑制mTOR可诱导自噬并降低聚谷氨酰胺扩增的毒性。自然遗传学。 36:585–595.[公共医学][谷歌学者]
  • Sanz，L.、P.Sanchez、M.J.Lallena、M.T.Diaz Meco和J.Moscat。p62与RIP的相互作用将非典型PKC与NF-kappaB激活联系起来。EMBO J。 18:3044–3053.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sanz，L.、M.T.Diaz-Meco、H.Nakano和J.Moscat。2000.非典型PKC相互作用蛋白p62通过IL-1-TRAF6途径传导NF-kappaB激活。EMBO J。 19：1576–1586。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Saudou，F.、S.Finkbeiner、D.Devys和M.E.Greenberg，1998年。亨廷顿蛋白在细胞核中起到诱导凋亡的作用，但死亡与核内包涵体的形成无关。细胞。 95:55–66.[公共医学][谷歌学者]
  • 北卡罗来纳州Shaner、R.E.Campbell、P.A.Steinbach、B.N.Giepmans、A.E.Palmer和R.Y.Tsien。2004.改进了从Discosoma sp.红色荧光蛋白衍生的单体红色、橙色和黄色荧光蛋白。自然生物技术。 22:1567–1572.[公共医学][谷歌学者]
  • Simonsen，A.、H.C.Birkeland、D.J.Gilloly、N.Mizushima、A.Kuma、T.Yoshimori、T.Slagsvold、A.Brech和H.Stenmark，2004年。Alfy，一种新型FYVE域蛋白，与蛋白颗粒和自噬膜相关。细胞科学杂志。 117:4239–4251.[公共医学][谷歌学者]
  • Slot、J.W.、H.J.Geuze、S.Gigengack、G.E.Lienhard和D.E.James。1991.大鼠棕色脂肪组织中胰岛素可调节葡萄糖转运蛋白的免疫放大。《细胞生物学杂志》。 113:123–135.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Steffan，J.S.、N.Agrawal、J.Pallos、E.Rockabrand、L.C.Trotman、N.Slepko、K.Illes、T.Lukacsovich、Y.Z.Zhu、E.Cattaneo等，2004年。亨廷顿和亨廷顿病病理学的SUMO修改。科学。 304:100–104.[公共医学][谷歌学者]
  • H.G.汤普森、J.W.哈里斯、B.J.沃尔德、F.林和J.P.布罗迪。乳腺肿瘤中p62的过度表达和乳腺癌细胞中前列腺衍生Ets因子的调节。致癌物。 22:2322–2333.[公共医学][谷歌学者]
  • Thullberg，M.、J.Bartek和J.Lukas。泛素/蛋白酶体介导的p19INK4d降解决定了其在细胞周期中的周期性表达。致癌物。 19:2870–2876.[公共医学][谷歌学者]
  • 瓦德拉穆迪、R.K.、I.Joung、J.L.Strominger和J.Shin。p62是p56lck的SH2结构域的磷酸酪氨酸非依赖性配体，属于一类新的泛素结合蛋白。生物学杂志。化学。 271:20235–20237.[公共医学][谷歌学者]
  • Vonsatel，J.P.和M.DiFiglia。1998年亨廷顿病。神经病理学杂志。实验神经学。 57:369–384.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang，Z.和M.E.Figueiredo-Pereira。抑制固位体1/p62上调可防止前列腺素J2诱导的泛素化蛋白聚集，但不会降低其神经毒性。分子细胞。神经科学。 29:222–231.[公共医学][谷歌学者]
  • Yamamoto，A.、Y.Tagawa、T.Yoshimori、Y.Moriyama、R.Masaki和Y.Tashiro。1998。巴氟霉素A1通过抑制大鼠肝癌细胞系H-4-II-E细胞中自噬体和溶酶体之间的融合来阻止自噬液泡的成熟。单元格结构。功能。 23：33–42。[公共医学][谷歌学者]
  • 吉森，T.2004。自噬：细胞内一种受调控的整体降解过程。生物化学。生物物理学。Res.Commun公司。 313:453–458.[公共医学][谷歌学者]
  • Zatloukal，K.，C.Stumptner，A.Fuchsbichler，H.Heid，M.Schnoelzer，L.Kenner，R.Kleinate，M.Prinz，A.Aguzzi和H.Denk。p62是蛋白质聚集性疾病中细胞质内含物的常见成分。美国病理学杂志。 160:255–263.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社