Beclin–磷脂酰肌醇3-激酶复合物在反式-高尔基网络

摘要

简介

自噬是一种细胞内降解系统，其中细胞质成分被运输到溶酶体/液泡中进行降解(Seglen和Bohley，1992年). 细胞质的一部分首先被一个双膜结构，即自噬体包裹，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，其中的内容物被溶酶体水解酶降解。此前，我们鉴定了大量酵母突变体(自动发电机组)自噬缺陷(Tsukada和Ohsumi，1993年). 的克隆自动发电机组基因显示，除了Apg6p外，其他基因都是新基因，Apg6p与Vps30p相同，Vps30p是一种将羧肽酶Y（CPY）靶向液泡所需的蛋白质(卡梅塔卡等., 1998). 大多数Apg蛋白在哺乳动物细胞中都有相关蛋白，这表明真核生物中自噬的分子机制是保守的。然而，关于哺乳动物细胞自噬的知识有限。最近，发现自噬需要Beclin（Vps30p/Apg6p的人类同源物）和一类（III类）磷脂酰肌醇（PI）3-激酶(梁等., 1999;珀蒂奥等., 2000).

PI 3-激酶参与多种信号转导途径，通过产生信号分子磷脂酰肌醇（PtdIns）3,4,5-三磷酸[PtdIns（3,4_5）P，调节许多不同的生理功能，包括粘附、肌动蛋白重排、细胞生长和细胞存活_三]和PtdIns（3,4）P₂(Toker和Cantley，1997年). 然而，组成性存在的PtdIns（3）P的作用一直不清楚。发现其中一种酵母VPS公司（液泡蛋白分选）基因，视频处理34，编码PI 3-激酶(舒等., 1993)揭示了PtdIns（3）P在囊泡介导的转运中的重要作用。虽然Vps34p是酵母中唯一的PI 3-激酶(舒等., 1993)哺乳动物细胞中存在多种PI 3-激酶，可分为三类(Domin and Waterfield，1997年). III类PI 3-激酶由Vps34p及其哺乳动物同源物组成。这一类的PI 3-激酶特异性磷酸化PtdIns，但不磷酸化PtdIns（4）P或PtdIns（4,5）P₂，因此是PtdIns 3-激酶(Stack和Emr，1994年;伏利尼亚等., 1995). 下文中，我们将Vps34p的哺乳动物同源物称为PtdIns 3-激酶。在哺乳动物细胞中，可溶性溶酶体水解酶在反式-高尔基网络（TGN）(Hille-Rehfeld，1995年). 用两种化学上不同的PI 3-激酶抑制剂沃特曼或LY294002处理培养细胞，导致溶酶体酶错配到细胞表面(棕色等., 1995;戴维森，1995年)表明PtdIns 3-激酶参与溶酶体蛋白转运。

我们最近发现，在酵母中，Vps34 PtdIns 3-激酶形成至少两个多亚单位复合物：一个含有Vps15p、Vps30p/Apg6p和Apg14p，具有自噬功能，另一个含有Vps15p，Vps30p/Apg6p和Vps38p，具有CPY分选功能(木原等., 2001). 在本研究中，我们通过联合免疫沉淀和交联实验表明Beclin与PtdIns 3-激酶相互作用。我们的结果表明，在哺乳动物中，Beclin作为PtdIns 3-激酶复合物的亚单位，在PtdIns（3）P的产生中也发挥着重要作用，这可能对自噬和溶酶体酶转运至关重要。间接免疫荧光显微镜显示，Beclin和PtdIns 3-激酶的膜相关形式定位于反式-高尔基网络（TGN）。在晚期内体中发现了一些PtdIns 3-激酶。这些结果表明，Beclin–PtdIns 3-激酶复合物在TGN处产生PtdIns（3）P，然后在自噬体成分和溶酶体蛋白的分类中发挥作用。

结果

Beclin与PtdIns 3-激酶的物理相互作用

Beclin和PtdIns 3-激酶都被证明是自噬所必需的(梁等., 1999;珀蒂奥等., 2000). 然而，Beclin在自噬中的作用尚不清楚。最近，我们发现，Beclin的酵母同源物Vps30p/Apg6p是Vps34 PtdIns 3-激酶的调节亚单位。为了测试Beclin也可以作为PtdIns 3-激酶的亚单位发挥作用的可能性，我们首先研究了PI 3-激酶活性与Beclin的关联。用Triton X-100溶解由HeLa细胞制备的细胞匀浆，并用抗Beclin抗体进行免疫沉淀。然后对免疫沉淀进行PI 3-激酶活性测定。如图所示​图1A，1A、 免疫沉淀物中检测到PI 3-激酶活性（通道2）。使用免疫前血清的对照免疫沉淀物未显示任何PI 3-激酶活性（第1道）。与Beclin相关的PI 3-激酶活性在镁²⁺用以代替Mn²⁺反应混合物中（车道3）。10 nM沃特曼宁（一种著名的PI 3-激酶抑制剂）完全抑制了该活性（图​（图1B，1B、 车道3）。PtdIns 3-激酶具有强烈的阳离子依赖性和对沃特曼的高度敏感性(伏利尼亚等1995年).

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图1。Beclin和PtdIns 3-激酶形成复合物。(A类)用Triton X-100溶解从HeLa细胞制备的细胞裂解物，并使用免疫前血清（第1道）或抗Beclin抗体（第2道和第3道）进行免疫沉淀。免疫沉淀与磷脂酰肌醇[γ]孵育-³²P] 锰存在下的ATP和60µM冷ATP²⁺（车道1和2）或Mg²⁺（车道3）在30°C下保持5分钟。(B类)按照（A）中所述制备的抗Beclin抗体的免疫沉淀物在沃特曼浓度为0 nM（车道1）、1 nM（道路2）、10 nM（通道3）、100 nM（路径4）的情况下，检测PI 3-激酶活性。用薄层色谱法提取并分离标记的脂质，然后用生物成像分析仪BAS2000（富士胶片）进行放射自显影检测。(C类)用Triton X-100溶解从HeLa细胞制备的细胞裂解物，并与蛋白A固定化的抗Beclin抗体（通道2）或抗PtdIns 3-激酶抗体（通道4）孵育。作为对照，使用各自抗体的免疫前血清（泳道1和3）。保留蛋白通过SDS-PAGE分离，并通过抗PtdIns 3-激酶（上面板）和抗Beclin（下面板）抗体的免疫印迹检测。

为了进一步证实Beclin与PtdIns 3-激酶结合，我们进行了联合免疫沉淀实验。用SDS–PAGE分离由Triton X-100溶解的HeLa细胞制备的Beclin或PtdIns 3-激酶的免疫沉淀物，并用抗Beclin和抗PtdIns 3-激酶抗体进行免疫印迹检测。在使用抗Beclin抗体的免疫沉淀物中，除Beclin外，还检测到PtdIns 3-激酶（图​（图1C，1C、 车道2）。使用不含Beclin或PtdIns 3-激酶的免疫前血清控制免疫沉淀物（1区）。PtdIns 3-激酶和Beclin的复合形成也通过使用抗PtdIns 3-激酶抗体的免疫沉淀得到证实（第4道）。接下来，我们进行了交联实验。从HeLa细胞制备细胞裂解物，并用3,3′-二硫代双-（琥珀酰亚胺丙酸酯）（DSP）处理，DSP是一种双功能、氨基反应和硫醇裂解交联剂。交联后，蛋白质在SDS中溶解，用抗Beclin或抗PtdIns 3-激酶抗体进行免疫沉淀，并在交联伙伴被裂解的还原条件下用SDS-PAGE分离。当用抗PtdIns 3-激酶抗体免疫沉淀时，几乎所有的Beclin和PtdIns 3-激酶都在洗脱液中检测到（图​（图2A，2A、 车道4）。在未发生交联的情况下，在流通部分（车道1）中检测到Beclin。相反，当交联时，只有～50%的PtdIns 3-激酶与抗Beclin抗体免疫沉淀（图​（图2A，2A、 车道8）。这些结果表明，所有Beclin都与PtdIns 3-激酶形成复合物，而只有～50%的PtdIns 3-激酶与Beclin形成复合物。

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图2。Beclin和PtdIns 3-激酶的交联。(A类)用DSP（3、4、7和8道）或其溶剂二甲基亚砜（1、2、5和6道）在4°C下处理总细胞裂解液2小时。用SDS溶解蛋白质，并使用蛋白A固定化抗PtdIns 3-激酶（PtdIns3-K）（1-4道）或Beclin（5-8道）抗体进行免疫沉淀。用1×SDS样品缓冲液（62.5 mM Tris–HCl pH 6.8，2%SDS，10%甘油，微量溴酚蓝）洗脱免疫沉淀物。用5%2-巯基乙醇处理后，用SDS-PAGE分离蛋白质，然后用抗Beclin（上面板）和抗PtdIns 3-激酶（下面板）抗体进行免疫印迹检测。(B类)从HeLa细胞制备的细胞裂解物通过10万离心进行亚细胞分离克持续1h。对膜（1和3道）和上清液（2和4道）部分进行SDS-PAGE，然后用抗PtdIns 3-激酶（1和2道）和抗Beclin（3和4道的）抗体进行免疫印迹。(C类)膜（1-4车道；100 000克，30分钟，颗粒）和可溶部分（车道5–8；100 000克，30分钟，上清液）用DSP（泳道3、4、7和8）或二甲基亚砜（泳道1、2、5和6）处理。用SDS溶解蛋白质，并使用蛋白质A固定的抗PtdIns3-激酶抗体进行免疫沉淀。在还原条件下用SDS-PAGE分离免疫沉淀物，然后用Beclin抗体进行免疫印迹检测。F和E分别表示流经和洗脱压裂。

Beclin和PtdIns 3-激酶的定位

为了揭示Beclin和PtdIns 3-激酶的定位，我们通过离心法检测了它们的亚细胞分布。从HeLa细胞制备的细胞匀浆在100 000下离心克，并通过免疫印迹分析所得上清液和颗粒组分。在上清液部分中发现约40%的PtdIns 3-激酶（图​（图2B，2B、 车道2），60%位于颗粒部分（车道1）。Beclin也在两个组分之间进行了分离，但Beclin在上清液组分中的含量略高（54%）（图​（图2B，2B、 车道4），而颗粒部分（46%）（车道3）。这些结果表明约一半的Beclin和PtdIns 3-激酶分布在一些膜室中。

为了研究Beclin的可溶性或膜相关形式是否与PtdIns 3-激酶相互作用，我们使用总膜和可溶性部分进行了交联实验。如图所示​图2C，2C、 所有Beclin，无论其定位如何，都与PtdIns 3-激酶交联。因此，Beclin与PtdIns 3-激酶稳定相关。这些结果表明，Beclin–PtdIns 3-激酶复合物在胞浆和膜之间循环。

为了确定Beclin–PtdIns 3-激酶复合物在HeLa细胞中的精确定位，进行了间接免疫荧光显微镜检查。HeLa细胞被固定，然后用抗Beclin抗体进行免疫染色。通过共焦成像，Beclin在整个细胞液中被检测到，并且也集中在核周区域（图​（图3A，三A、 左侧面板）。固定前用洋地黄素渗透去除胞浆，改善了膜相关Beclin的染色（图​（图3D三D和3E，左侧面板）。接下来，我们用TGN标记物syntaxin 6抗体对HeLa细胞进行双重染色。我们观察到Beclin与syntaxin 6的明显共定位（图​（图3A，三A、 右侧面板）。这些结果表明Beclin在HeLa细胞中定位于TGN。Beclin的TGN定位并非针对所用细胞系。在BNL CL.2细胞中，Beclin也以与突触蛋白6重叠的核周模式染色（图​（图3B）。三B） ●●●●。此外，另一个众所周知的TGN标记TGN38与Beclin在H-4-II-E细胞中共定位（图​（图3C）。三C） ●●●●。已知使用微管聚合抑制剂诺卡唑进行处理可以分散TGN(Reaves和Banting，1992年). 在这些条件下，Beclin仍然与分散的突触合蛋白6正结构有关（数据未显示）。在酵母中，一种Beclin同源物Vps30p/Apg6p被提议在关键步骤发挥作用，以使CPY的分选受体Vps10p从内体再循环到TGN/晚期高尔基体。因此，除了TGN外，重要的是确定Beclin是否也定位于内体。为了验证这一点，我们用Beclin和EEA1（早期内体标记物，溶血磷脂酸（LBPA），晚期内体标记）对HeLa细胞进行双重染色(小林寺等., 1998)或转铁蛋白受体（TfR），一种循环内体标记。几乎没有观察到Beclin与这些内体标记物的共扩增（图​（图3D-F）。三D–F）。从这些结果中，我们得出结论，Beclin仅定位于TGN，而不定位于内体。

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图3。Beclin将定位到TGN。赫拉(A类,D类,E类和F类)，BNL CL.2级(B类)和H-4-II-E电池(C类)生长在盖玻片上。在（C、D和E）或（A、B和F）用3%多聚甲醛固定后，用洋地黄素使细胞渗透。细胞被抗Beclin（A–F，左面板）和抗syntaxin 6（A和B，中面板）、抗TGN38（C，中面板。在合并的图像（右侧面板）中，黄色表示共同定位。棒材，10µm。

接下来，我们用免疫荧光显微镜检查了PtdIns 3-激酶的亚细胞定位。首先对HeLa细胞进行渗透去除胞浆，然后进行固定和免疫荧光染色。与Beclin一样，PtdIns 3-激酶在两种HeLa中均显示出核周染色模式（图​（图4A4A和C，左侧面板）和H-4-II-E电池（图​（图4B，4B、 左侧面板）。在未经预渗透的细胞的胞浆中也检测到PtdIns 3-激酶（数据未显示）。然后，我们用抗PtdIns 3-激酶抗体和其他一些细胞器标记物对预渗透细胞进行双重染色。PtdIns 3-激酶的染色模式与syntaxin 6的染色模式显著重叠（图​（图4A）4A） 和TGN38（图​（图4B）。4B） ●●●●。另一方面，EEA1没有与PtdIns 3-激酶共同定位（数据未显示）。虽然大多数LBPA阳性结构都不是PtdIns 3-激酶阳性，但检测到PtdIns 3-激酶与LBPA的部分共定位（图​（图4C）。4C） ●●●●。这些结果表明，PtdIns 3-激酶定位于TGN，尽管在晚期内体中存在一小部分。

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图4。PtdIns 3-激酶的免疫荧光定位。希拉牌手表(A类和C类)和H-4-II-E电池(B类)进行透化、固定，然后进行免疫染色。用抗PtdIns 3-激酶（A–C，左图）和抗突触合蛋白6（A，中图）、抗TGN38（B，中图）或抗LBPA（C，中图）抗体双重标记细胞。棒材，10µm。

讨论

尽管20世纪60年代电子显微镜在哺乳动物细胞中发现了自噬(Seglen和Bohley，1992年)，其分子基础尚不清楚。最近，有研究表明Beclin和PtdIns 3-激酶参与哺乳动物的自噬(梁等., 1999;珀蒂奥等., 2000)，但它们的确切作用仍不清楚。在这里，我们证明Beclin与PtdIns 3-激酶形成复合物。间接免疫荧光显微镜显示Beclin–PtdIns 3-激酶复合物定位于胞质溶胶和TGN。由于PtdIns3-激酶的底物PtdIns是一种脂质分子，因此PtdIns-3激酶复合物必须在膜上发挥作用，而不是在胞浆中。因此，我们认为Beclin–PtdIns 3-激酶复合物在TGN膜上产生PtdIn（3）P。

我们最近发现，在酵母中，Vps30p/Apg6p与Vps34p相互作用，后者由适配器蛋白Apg14p或Vps38p介导(木原等., 2001). 这些观察结果表明Beclin/Vps30p–PtdIns 3-激酶/Vps34p复合物的功能是保守的。我们推测Beclin和PtdIns 3-激酶的相互作用也可能由假定的衔接蛋白介导。可以想象，TGN中PtdIns（3）P的产生是酵母和哺乳动物自噬过程中的一个基本步骤，尽管目前酵母中复合物的定位尚不清楚。

我们在TGN上发现了Beclin–PtdIns 3-激酶复合物，这可能导致该复合物对TGN上的自噬体成分进行分类。在自噬体中检测到一些在高尔基体中一定已糖基化的蛋白质(山本等., 1990); 另一方面，邓恩（1990）据报道，这些隔间含有一些内质网膜蛋白。因此，一些自噬体蛋白可能是由TGN提供的，而另一些则来源于内质网。此外，PtdIns（3）P本身可能是自噬小体形成所必需的脂质。需要进一步研究这一模式。

Beclin在溶酶体蛋白转运中的作用尚未被研究。然而，由于溶酶体酶转运也需要PtdIns 3-激酶(棕色等., 1995;戴维森，1995年)Beclin–PtdIns 3-激酶复合物可能以类似于酵母复合物的方式在这种转运和自噬中发挥作用(Herman和Emr，1990年;卡梅塔卡等., 1998;木原等., 2001). 因此，目前尚不清楚最近是否报道了Beclin依赖性抑制肿瘤发生(梁等., 1999)只是由于自噬。肿瘤的发生可能是由溶酶体蛋白转运的损伤，或其和自噬的损伤引起的。

在这项研究中，我们发现几乎所有的Beclin都与PtdIns 3-激酶复合，而只有～50%的PtdIns 3-激酶与Beclin相关。此外，我们观察到PtdIns3激酶与晚期内体标记LBPA部分重叠，而Beclin仅定位于TGN。这些发现意味着，PtdIns 3-激酶也可能独立于Beclin在其他膜转运事件的内体中发挥作用。Wortmann治疗抑制内化Semliki Forest病毒向溶酶体的传递(马蒂斯等., 1996). 电子显微镜显示PtdIns（3）P集中在晚期内体的内膜上(吉洛利等., 2000). 因此，另一种PtdIns 3-激酶复合物可能在内吞和多泡体形成中发挥作用。Beclin可能将PtdIns3-激酶锚定在TGN上，或者是复合物的自噬调节成分。总之，我们发现Beclin与PtdIns 3-激酶形成复合物并定位于TGN。这些发现对于理解特定脂质参与自噬体的形成和细胞器的起源非常重要。

方法

细胞培养。HeLa细胞、来自大鼠肝癌的H-4-II-E细胞和来自小鼠胚胎正常肝的BNL CL.2细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中生长，补充有5 U/ml青霉素和50µg/ml链霉素，在5%的CO中₂37°C培养箱。

抗体。针对表达为His的重组全长Beclin蛋白和PtdIns 3-激酶蛋白，制备了抗Beclin和抗PtdIns3-激酶抗血清₆-Myc或他的₆-融合蛋白。使用的其他抗体包括抗突触素6（Transduction Laboratories）、抗EEA1（Transducation Laboratory）、抗TGN38（Affinity Biogents Inc.）、抗LBPA（6C4；小林寺等., 1998)，抗TfR（N-2；吉森等., 1988)、Cy2标记的山羊抗兔IgG抗体（Amersham Pharmacia Biotech）和Cy5标记的山羊抗体（Amersham Pharmacia-Biotech）。

PI 3-激酶活性的免疫沉淀。悬浮在缓冲液A（50 mM HEPES–NaOH pH 7.5，100 mM NaCl，3 mM EGTA，10%甘油，1 mM PMSF，10 mM 2-巯基乙醇）中的HeLa细胞通过超声波溶解并用1%Triton X-100溶解，然后在10万℃下离心克持续30分钟。将上清液分为300µl小份，每个小份与蛋白A–Sepharose结合的抗血清孵育^TM公司CL-4B（Amersham Pharmacia Biotech）在4°C下放置2小时。然后对免疫沉淀物进行前面描述的PI 3-激酶分析(沃尔什等., 1991).

交叉链接。悬浮在缓冲液B中的HeLa细胞[50 mM HEPES–NaOH pH 7.5，20%甘油，150 mM NaCl，1 mM PMSF，0.1 mM二硫苏糖醇（DTT）]通过超声波溶解，并使用DSP进行交联，如前所述(木原等., 1996).

亚细胞分离。HeLa细胞在缓冲液C[20 mM Tricine-NaOH pH 7.8，8%蔗糖，1 mM EDTA，1 mMPMSF，1 mM-DTT，1×蛋白酶抑制剂混合物（完全，不含EDTA-；罗氏）]中清洗、采集和溶解，通过具有8µm孔的聚碳酸酯过滤器挤压，方法如下：Vida和Gerhardt（1999）通过光学显微镜观察显示，大多数细胞被破坏，细胞器明显完好无损。过滤废水在300℃下离心克5分钟以清除细胞碎片。上清液在10万下离心克持续1h以生成颗粒和上清液部分。

其他方法。如前所述进行免疫荧光显微镜分析(吉森等., 2000). 如图图例所示，固定前后用50µg/ml洋地黄素使细胞渗透5分钟。如前所述进行免疫印迹(吉森等., 2000). 如前所述进行共免疫沉淀(木原等., 2001).

致谢

参考文献