程序性细胞死亡在所有多细胞生物体内的动态平衡发展和维持中发挥着不可或缺的作用(62,65). 遗传和分子分析秀丽隐杆线虫人类已经表明细胞自杀的途径是高度保守的(14,56). 虽然进行凋亡的能力似乎是所有细胞固有的，但其敏感性差异显著，并受外部和细胞自主事件的影响(49). 这个过程中的多个步骤受到调控，从细胞表面死亡受体到BCL-2蛋白家族，再到Apaf-1，最后是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，后者通过蛋白质分解分解死亡底物(10). 细胞凋亡有两条主要的效应途径，半胱天冬酶的激活和细胞器功能障碍，其中线粒体功能障碍最为典型(16). BCL-2蛋白家族位于不可逆细胞损伤上游的关键决定点，这些蛋白的大部分活动集中在线粒体水平。BCL-2家族既有促凋亡分子又有抗凋亡分子，其比率在一定程度上决定了对死亡信号的反应(44). 有证据表明，这些分子中有许多具有非活性和活性构象。这些由翻译后修饰所介导的对死亡或生存信号的反应的转变可能最适合于生产成员。
对促凋亡分子的修饰包括磷酸化、二聚化和蛋白水解裂解，通常导致亚细胞移位。BAD属于BCL-2家族的一个发散的“仅BH3结构域”亚群，仅在BH3两亲性α螺旋内具有显著的序列同源性(46,69). 在存在生存因子的情况下，BAD通过两个丝氨酸残基（Ser112和Ser136）上的磷酸化失活，并被固定在与14-3-3结合的胞浆中(70). 因子剥夺后，BAD被去磷酸化激活，并与BCL-X相关L（左）/BCL-2位于包括线粒体在内的膜位点。AKT/PKB/RAC是磷脂酰肌醇3-激酶下游的一种Ser/Thr激酶，对BAD的Ser136具有位点特异性(三,11,12). PKA是一种BAD Ser112位点特异性激酶，通过a激酶锚定蛋白连接到线粒体外膜，该蛋白将激酶底物的相互作用集中在活性BAD起作用的细胞器上(22). 促凋亡分子BAX的激活似乎涉及亚细胞移位和二聚体化(17,24,66). 在活细胞中，BAX的很大一部分是单体的，存在于胞浆中或松散地附着在细胞膜上。死亡刺激导致BAX易位到线粒体，在线粒体中BAX是膜完整的，可作为同型二聚体交联。肿瘤坏死因子受体1/Fas死亡信号后caspase-8介导的裂解激活细胞溶胶BID(18,30,34). 截短的p15（tBID）靶向线粒体，免疫耗竭研究表明tBID是细胞色素释放所必需的c（c）对BCL-2家族分子的活性构象和非活性构象的结构洞察来自于BID和BCL-X的三维结构的比较L（左）(7,38). 一个模型假设BH3结构域的疏水表面被掩埋的分子可能是抗凋亡或非活性促凋亡蛋白。BH3结构域和潜在的其他疏水表面的暴露可能导致活性构象。
该家族的创始人，抗凋亡BCL-2，被发现是携带t（14；18）的人类B细胞淋巴瘤染色体断裂点的原癌基因(1,8,60). BCL-2被磷酸化是对多种治疗的反应，然而关于这种修饰是激活还是灭活该分子的报道各不相同。BCL-2在暴露于化疗紫杉醇和紫杉醇紫杉醇后磷酸化，促进微管聚集(21). 磷酸化似乎发生在BCL-2的非结构环中，因为该环的缺失消除了紫杉醇诱导的磷酸化(5,15,54)而选择性丝氨酸的突变会降低其含量(19). 这个环的缺失增强了BCL-2的抗凋亡能力，认为BCL-2磷酸化会使分子失活。紫杉醇结合类似BCL-2环的肽，表明紫杉烷、微管和BCL-2激酶之间存在特定的物理相互作用(51). 然而，包括长春新碱和长春碱在内的药物通过其他机制损伤微管，甚至诺卡唑导致BCL-2磷酸化的能力增加了这种修饰与G2/M细胞周期块(32,53). 相反，白细胞介素-3（IL-3）是另一种细胞系统中使用的生长和存活因子，导致BCL-2磷酸化(36,47). 这种磷酸化被认为是抗凋亡功能所必需的(27)或需要放松BCL-2的抗增殖作用(47). 多种激酶被提议在这些不同的刺激下介导BCL-2的磷酸化。其中包括紫杉醇激活的Raf-1(2)，苔藓抑制素-1诱导的线粒体定位PKCα(52)、紫杉醇或长春新碱诱导的PKA(55)或Jun N末端激酶/应激激活蛋白激酶（JNK/SAPK），当紫杉醇过度表达或激活时(35,54).
当我们开始这项研究时，我们认为通过结合胰蛋白酶磷酸肽定位和测序来确定紫杉醇诱导的BCL-2的精确磷酸化位点非常重要。非结构环中的三个残基（Ser70、Ser87和Thr69）被磷酸化，这些位点对丙氨酸的改变赋予了对生理死亡信号和微管损伤剂的抵抗力。我们检查了通过淘洗富集的正常循环细胞的不同细胞周期阶段，发现BCL-2在G2/M。此外，G2/M期细胞更容易受到Fas死亡信号的影响，BCL-2 Ser70Ala突变体恢复了耐药性。候选激酶的检测消除了细胞周期蛋白B1-Cdc2复合物，反而揭示了ASK1/JNK1通路在G2/M相。ASK1/JNK1的表达在体内正确地磷酸化了BCL-2，而ASK1、MKK7和JNK1的显性阴性形式（dnASK1、dnMKK7和dnJNK1）抑制了紫杉醇诱导的BCL-2磷酸化。因此，应激活化激酶在G2/正常细胞周期进程中的M期是一个生理过程。紫杉烷处理代表G的收敛2/M阻滞、微管聚合和JNK激活也磷酸化和灭活BCL-2。
材料和方法
质粒。
人类BCL-2（hBCL-2）在pSFFV中的哺乳动物表达质粒如前所述(67). 为了用丙氨酸取代Ser70、Ser87或Thr69，使用了基于PCR-的定点突变试剂盒（Stratagene）。在pSFFV或pcDNA3中构建野生型（WT）和突变体的表达载体。通过亚克隆构建了Ser70 Ser87双突变体和Thr69 Ser70 Ser87-三突变体（AA/A）。将hBCL-2的C末端疏水区替换为合成的寡核苷酸编码六组氨酸标签，并在pET-25（+）载体中亚克隆，从而制备hBCL-2-His细菌表达载体。pcDNA3中的ASK1-血凝素表位（HA）和dnASK1-HA（K709R）在其他地方有描述(25). MKK4和Flag-p38（AGF）表达载体由R.J.Davis提供(13). HA-JNK1表达载体是J.S.Gutkind的礼物(9). pSRα-SEK1-K116R和pSRα-JNK1-APF载体来自G.L.Johnson(28). 质粒pMT3-HA-p38是J.Kyriakis送的礼物(50). pSRα-MKK7和pSRβ-MKK7KL表达载体由西田大肠杆菌提供(41). 细菌谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）–MKK6（K/A）表达载体由H.Saito善意提供(58).
稳定转染。
Jurkat人T细胞或WEHI-231小鼠B细胞在添加10%胎牛血清（FBS）、10 mM HEPES、50μM 2-巯基乙醇、，我-谷氨酰胺、青霉素和链霉素。WEHI-231JM电池由C.B.Thompson提供(5). 通过将20μg线性化质粒电穿孔成10μg质粒，在pSFFV-neo中进行不同结构的转染7细胞在950μF和200 V下。48小时后，在96孔板中开始用1mg G418/ml进行选择。14天后筛选出耐新霉素（Neo）的单细胞克隆。
瞬时转染试验。
293个细胞被保存在补充有10%FBS、青霉素和链霉素的Iscove改良Dulbecco培养基（GIBCO BRL）中。使用8μl脂质体（GIBCO BRL）将生长在六孔培养皿中的293个细胞转染到适当的表达质粒组合中。通过添加空载体pcDNA3，质粒DNA总量保持在1.75μg。转染后24 h收集细胞，如有指示，用1μM紫杉醇处理8 h。细胞裂解物进行Western blot分析。
蛋白质印迹分析。
在50 mM Tris（pH 7.5）–150 mM NaCl–2 mM EDTA–1 mM EGTA–1%Triton X-100中溶解细胞，其中含有蛋白酶抑制剂（1 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]、2μg/ml抑肽酶和2μg/ml亮氨酸蛋白酶）和磷酸酶抑制剂（50 mM NaF和1 mM原钒酸钠），14000×离心去除细胞碎片克样品通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离并转移到膜上。在用3%牛奶和2%牛血清白蛋白在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（PBS）中封闭膜1小时后，将膜与一级和二级抗体（Abs）分别孵育1小时，并用增强化学发光（Amersham）显影。抗-hBCL-2 Abs 6C8和Bcl-2/100（Pharmingen）按1μg/ml使用，抗-HA Ab（12CA5；Boehringer Mannheim）按2μg/ml，抗Flag Ab（Sigma）按5μg/ml用，抗JNK1（C-17）和抗SEK1/MKK4（K-18）Abs（Santa Cruz Biotechnology）按1:200使用，抗人JNK1/JNK2（G151-666）Ab（Pharmingen）按1.5μg/ml，以1:1000使用抗磷酸-SAPK/JNK Ab和抗磷酸p38有丝分裂原活化蛋白（MAP）激酶Ab（新英格兰生物实验室）。
细胞活力测定。
Jurkat细胞用0.001、0.01、0.1或1μM紫杉醇（Sigma）或二甲基亚砜（DMSO）（对照）处理24小时，收集并重悬于PBS中每毫升1μg碘化丙啶（PI）中。FACScan（Becton Dickinson）测量的PI阴性细胞群被评分为可行。Jurkat细胞也用每毫升100 ng的抗Fas抗体CH-11（Upstate Biotechnology）处理，并在指定的时间点通过PI排除法检测细胞活力。用1:100稀释的抗免疫球蛋白M（IgM）抗体BET-2上清液处理WEHI-231小鼠B细胞。
代谢标记和免疫沉淀。
单元格（107)在无磷10%FBS–RPMI 1640培养基中培养，并用1μM紫杉醇处理Jurkat细胞或1μM长春新碱处理WEHI-231细胞12 h，然后添加322 mCi/ml的正磷酸。标记4 h后，用无磷培养基冲洗细胞两次，并在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中溶解（20 mM Tris[pH7.5]，150 mM NaCl，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸，0.1%十二烷基硫酸钠，2 mM EDTA，1 mM EGTA）蛋白酶抑制剂（1 mM PMSF、2μg抑肽酶/ml和2μg亮氨酸蛋白酶/ml）和磷酸酶抑制剂（50 mM NaF和1 mM原钒酸钠）。裂解液以14000×克，用蛋白A珠清除上清液30 min，然后用抗hBCL-2 Ab 6C8在4℃孵育1.5 h。用蛋白A珠子捕获免疫复合物1 h，用RIPA缓冲液洗涤四次，再悬浮在加载缓冲液中，用SDS-PAGE分离。将分离的样品转移到膜上，并通过放射自显影术进行可视化。用Ab Bcl-2/100（Pharmingen）对同一膜进行免疫印迹分析。
免疫沉淀BCL-2的磷酸酶治疗。
BCL-2与来自5×10的Ab 6C8免疫沉淀6用1μM紫杉醇处理表达BCL-2的Jurkat（Jurkat-BCL-2）细胞。免疫复合物与400 Uλ蛋白磷酸酶（λPPase）在1×λPPase（50 mM Tris[pH7.5]，0.1 mM EDTA，5 mM二硫苏糖醇，0.01%Brij 35）中孵育，在30°C下有或没有磷酸酶抑制剂（50 mM-NaF，2 mM原钒酸钠，5 mM-EDTA，5mM EGTA），孵育30分钟。通过添加SDS-PAGE加载缓冲液并煮沸5分钟，终止反应。所得样品在SDS–14%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并进行免疫印迹分析。
磷酸分析和二维（2D）绘图。
免疫沉淀BCL-2来自32用SDS-PAGE分离P标记的Jurkat-BCL-2细胞并转移到膜上。在放射自显影后切除含有磷酸化BCL-2的部分，并用去离子水清洗膜五次。采用Boyle等人描述的方法进行分析(4)，稍作修改。
对于磷酸氨基酸分析，将Immobilion-P（Millipore）上的BCL-2在110°C的200μl 6 N HCl（Pierce）中孵育90分钟。HCl蒸发后，将样品与磷酸氨基酸标准品（冷磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸[Sigma]各1μg）在pH 1.9缓冲液（H2O–88%甲酸-冰乙酸，897:25:78），将混合物应用于薄层色谱（TLC）板（J.T.Baker）上，并使用HTLE-7000电泳系统（加州德尔马CBS）进行分离。电泳在pH 1.9缓冲液中1500 V下进行30分钟，以进行第一维度分离，然后在pH 3.5缓冲液（H2O-乙酸-吡啶，945:50:5）在1300 V下持续20分钟，用于第二维度分离。磷酸化氨基酸的位置通过茚三酮（丙酮中0.25%）染色确定。
对于2D绘图，含有每个磷酸化BCL-2物种的硝化纤维素膜在37°C的100 mM乙酸中用0.5%PVP-360（Sigma）处理30分钟，然后用去离子水洗涤五次，再用50 mM NH洗涤两次4HCO公司三用10μg对甲苯磺酰基苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）-胰蛋白酶（沃辛顿生化）在50 mM NH中消化膜上的蛋白质4HCO公司三在37°C下过夜。然后用另一新鲜的10μg TPCK-胰蛋白酶进行额外2 h的消化。将肽干燥，用去离子水清洗一次，然后用冰上过甲酸处理60 min。通过在pH 1.9的缓冲液中在1000 V、4°C下电泳27分钟，在TLC板上分离得到的第一维胰蛋白酶肽，然后在磷光色谱缓冲液中进行第二维上升色谱(n个-丁醇–吡啶–乙酸–H2O、 75:50:15:60）。放射自显影术用于可视化32P-磷酸肽。
为了使用TPCK-胰蛋白酶和脯氨酸特异性内肽酶进行双重消化，将胰蛋白酶肽与3 U脯氨酸特异性内肽酶（ICN-Biomedicals）在37°C的50 mM NH中培养过夜4HCO公司三（pH 7.6），然后用1 U新鲜酶额外培养2小时。用过甲酸氧化消化的肽，然后进行如上所述的2D映射。
检查32P-标记的胰蛋白酶肽与合成肽，胰蛋白酶混合物32对P-磷酸肽和20μg含有相应磷酸的合成肽进行2D映射。茚三酮显示未标记的肽。
手动排序32P-磷酸肽。
将标记的肽刮取并在pH 1.9的缓冲液中从TLC板上洗脱，冷冻干燥，并在含有0.1%三氟乙酸的30%乙腈溶液中溶解。然后使用Sequelon-AA试剂盒（Millipore）在55°C下将肽偶联到Sequelon-AA膜。如前所述进行人工Edman测序(57)，稍作修改。主要变化是55°C的解理温度，而不是50°C。
离心淘析。
如前所述进行洗脱(33)，稍作修改。简言之，5×108将Jurkat细胞注射到Beckman JE-6B淘洗转子中，并在30°C的RPMI 1640–0.5%FBS中以恒定转子速度（2100 rpm）淘洗，流速从9 ml/min增加到35 ml/min。通过FACScan收集分数（100到150 ml）并分析其细胞周期位置，并分析适当的分数。
体外激酶测定。
用于体外测定JNK1活性，5×106Jurkat细胞在裂解缓冲液（25mM HEPES[pH 7.4]、150mM NaCl、20mMβ-甘油磷酸、2mM EDTA、2mM EGTA、50mM NaF、1mM原钒酸钠、1%Triton X-100）中用蛋白酶抑制剂（1mM PMSF、2μg抑肽酶/ml和2μg亮蛋白肽/ml）裂解。通过离心澄清裂解产物，并用抗JNK抗体C-17（Santa Cruz Biotechnology）免疫沉淀2 h。用蛋白A-Sepharose珠（Sigma）回收免疫复合物，用裂解缓冲液洗涤三次，用激酶缓冲液洗涤两次（25 mM HEPES[pH 7.4]，20 mM MgCl2，20 mMβ-甘油磷酸，0.5 mM EGTA，0.5 mMNaF，0.5 mM-原钒酸钠）和1 mM PMSF。将珠子上的免疫复合物分为两等分；一种用于以GST–c-Jun（79）（圣克鲁斯生物技术）为底物的激酶检测，另一种用于hBCL-2-His为底物检测。通过添加30μl激酶反应混合物（激酶缓冲液加上5μCi的[γ-32P] ATP、20μM未标记ATP、1 mM DTT和1μg底物）。在30°C下孵育20分钟后，通过添加10μl煮沸5分钟的4×SDS-PAGE负载缓冲液终止反应。样品通过SDS-PACE进行解析，并通过放射自显影或磷光成像进行可视化。将珠上免疫复合物的十分之一用于免疫印迹分析，以比较免疫沉淀JNK的数量。为了测量Cdc2激酶活性，使用抗细胞周期素B1抗体GNS-1（Pharmingen）。
免疫复合物激酶检测内源性ASK1活性已在前面描述过(25,43). 采用抗-ASK1抗血清（DAV）进行免疫沉淀。GST-MKK6和GST-p38γKN用于偶联激酶检测，GST-MK K6（K/A）用于单步激酶检测。
重组蛋白的制备。
hBCL-2-His蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）细胞，通过添加1mM异丙基-β-d日-硫代吡喃半乳糖苷，并用Ni-硝基三乙酸琼脂糖（Qiagen）和HiTrap Q柱（Pharmacia Biotech）纯化。GST-MKK6、GST-p38γKN和GST-MKK6（K/A）的制备已在其他地方描述(43,58).
结果
由于丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸化，微管损伤药物诱导BCL-2迁移。
当通过SDS-PAGE和免疫印迹法评估时，包括紫杉醇在内的微管损伤药物导致BCL-2迁移率改变（图。A） ●●●●。为了证明所有这些变化都是由于磷酸化引起的，Jurkat-BCL-2细胞被标记为32P-正磷酸，用抗hBCL-2 Ab 6C8免疫沉淀，SDS-PAGE后印迹到膜上。放射自显影术检测到的三条离散条带与同一膜的免疫印迹显影后发现的三条活动性移位的上条带精确对应（图。A） ●●●●。用λ-PPase处理免疫沉淀BCL-2可将移动的迁移率转换为底部的非磷酸化迁移率（图。B） ●●●●。这些数据证实，所有BCL-2迁移率的变化都可以归因于磷酸化，磷酸化可以通过免疫印迹法进行监测。
BCL-2在体内被丝氨酸和苏氨酸磷酸化。（A） 紫杉醇诱导的BCL-2迁移率的改变是由于磷酸化。BCL-2是从32用紫杉醇（+）或二甲基亚砜（−）处理过的P-正磷酸盐标记的Jurkat-BCL-2细胞，使用抗hBCL-2 Ab 6C8，用SDS-PAGE分离，并转移到硝化纤维素膜上。放射自显影后，用抗hBCL-2 Ab Bcl-2/100对同一膜进行Western分析。三个人32通过免疫印迹法，P标记带（箭头）对应于三条迁移带。非磷酸化BCL-2的位置用破折号表示。（B） λP酶治疗免疫沉淀BCL-2。用紫杉醇处理的Jurkat-BCL-2细胞的免疫沉淀BCL-2与λPPase在30°C下孵育30分钟，有或没有磷酸酶抑制剂（50 mM NaF、2 mM原钒酸钠、5 mM EDTA和5 mM EGTA）。对所得样品进行Western blot分析。（C） BCL-2的磷酸分析。BCL-2是从32用紫杉醇处理的P标记Jurkat-BCL-2细胞，用SDS-PAGE分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜上的每个放射性带（图。A） 用盐酸水解。氨基酸组成通过TLC板上的二维电泳测定。环形区域表示磷酸丝氨酸（P-Ser）、磷酸苏氨酸（P-Thr）和磷酸酪氨酸（P-Tyr）的位置，通过茚三酮染色显示；1、2和3分别代表波段1、2、3的结果。
为了确定哪些氨基酸残基被磷酸化，对这三条带进行磷酸化氨基酸分析。在带1和带2中，丝氨酸残基负责磷酸化（图。C） 而除丝氨酸残基外，带3在苏氨酸上被磷酸化（图。C） ●●●●。因此，紫杉醇诱导丝氨酸和苏氨酸残基上的BCL-2磷酸化。
鉴定BCL-2环区中的Ser70、Ser87和Thr69作为磷酸化位点。
值得注意的是，放射自显影术显示带2的强度强于带1，而西方分析显示其强度可比（图。A） ●●●●。此外，通过放射自显影法测得的条带3的强度与条带1的强度之比大于通过免疫印迹测得的强度。这些观察结果表明，带2和带3具有多个磷酸化位点。为了确定精确的磷酸化位点，在TLC板上进行2D定位，并对BCL-2胰蛋白酶肽进行手动Edman降解测序。用SDS-PAGE从体内标记的Jurkat-BCL-2细胞的裂解液中分离出免疫沉淀BCL-2，并将其印迹到硝化纤维素膜上，用胰蛋白酶消化带1、2和3。根据电荷和疏水性在TLC板上分离胰蛋白酶肽。波段1（图。A） 在2D地图上发现了一个点（图。A） 当进行人工测序时，其释放出绝大多数放射性，在第二个循环时，与膜结合的放射性相应减少（图。B） ●●●●。BCL-2具有两种胰蛋白酶肽，其丝氨酸位于第2位，分别位于氨基酸23至26和69至98。这些可以区分，因为前者没有脯氨酸，而后者有七个。用胰蛋白酶和脯氨酸特异性内肽酶双重消化改变了TLC板上带1的迁移（数据未显示），表明胰蛋白酶肽69-98被磷酸化，Ser70是磷酸化位点。合成肽与磷酸化-Ser70的结合证实了这一点（图。A） ●●●●。
紫杉醇在BCL-2（A）2D定位和带1合成磷酸肽复合研究中诱导Ser70、Ser87和Thr69磷酸化。BCL-2免疫沉淀自32用紫杉醇处理P标记的Jurkat-BCL-2细胞，用SDS-PAGE对其大小进行分级，并转移到硝化纤维素膜上。带1的胰蛋白酶肽（图。A） 在pH 1.9下通过电泳和色谱法在TLC板上分离。对应于带1的合成pS70磷酸肽迁移并通过茚三酮染色在TLC板上显示。此外，pS70肽与胰蛋白酶肽的混合物在TLC板上显示出结合（未显示）。（B） 带1胰蛋白酶磷酸肽的手动测序。这个32将P标记的肽从TLC板上洗脱，缀合到Sequelon AA膜上，并进行人工Edman降解。在每个循环结束时，测量膜上的放射性（闭合方块）或释放到液体中的放射性（开口棒）。如上所述，（C和D）2D绘图、合成磷酸肽迁移和带2的手动测序。如上所述，合成磷酸肽迁移的（E和F）2D映射和带3的手动测序。从TLC板（A、C和E）上的放射性斑点中洗脱来自条带1、2和3的色氨酸肽，并进行磷酸分析，确认其组成。
波段2也在2D地图上显示了一个放射性斑点（图。C） ●●●●。人工测序显示与膜结合的放射性降低，相应释放32第二次循环时的P（图。D） ●●●●。然而，大约一半的放射性仍然留在膜上，表明同一胰蛋白酶肽中还有另一个磷酸化位点。由于磷酸分析仅鉴定出丝氨酸残基（图。C） 这些发现共同表明Ser87是第二个磷酸化位点。含有磷酸化-Ser70和磷酸化-Ser 87的合成肽的迁移证实了这些磷酸化位点的分配（图。C） ●●●●。
波段3的2D绘图也显示了一个放射性斑点（图。E） ●●●●。含磷-Thr69-、磷-Ser70-和磷-Ser87合成肽的人工测序和组合确定第一个位置Thr69为第三个磷酸化位点（图。E和F）。
为了确认这些磷酸化位点的分配和体内使用，我们生成了Jurkat人类T细胞克隆和WEHI-231小鼠B细胞克隆，表达WT-hBCL-2、丙氨酸取代的Ser70（S70A）或Ser87（S87A），或所有三个磷酸化位点，包括Thr69和两个Ser残基（AA/A）。在体内用标记细胞32P-正磷酸盐和BCL-2用抗hBCL-2 Ab 6C8免疫沉淀。如图所示。A、 S70A BCL-2现在只显示了一条磷酸化带。S87A BCL-2突变体在Jurkat细胞中显示出一条突出的和一条微弱的磷酸化带，在WEHI-231细胞中显示了一条单一带。BCL-2三重突变体（AA/A）消除了BCL-2的所有磷酸化。因此，微管损伤药物诱导的BCL-2磷酸化位于Ser70、Ser87和Thr69的非结构环区。
BCL-2磷酸化位点的取代进一步增强了抗凋亡活性。（A） Jurkat克隆和WEHI-231克隆稳定表达BCL-2的WT或丙氨酸取代的磷酸化位点，包括Ser70（S70A）、Ser87（S87A）或所有三个磷酸化位点（包括Thr69加上两个丝氨酸（AA/A））或空载体（Neo）。Jurkat克隆用1μM紫杉醇处理细胞，WEHI-231克隆使用1μM长春新碱处理细胞，并在体内标记32正磷酸盐。BCL-2经免疫沉淀，SDS-PAGE分离，转移到膜上。放射自显影后，使用相同的膜进行免疫印迹。箭头表示磷酸化BCL-2，破折号表示非磷酸化BCL-2。Western分析中携带AA/A或Neo的Jurkat细胞的残余移位带代表Jurkat的内源性hBCL-2。（B） 通过Western blot分析不同Jurkat或WEHI-231克隆与抗hBCL-2 Ab 6C8和抗β-肌动蛋白Ab（C至E）的等效细胞的裂解产物，确定Jurkat和WEHI-232克隆中BCL-2的表达水平。Jurkat克隆（C和D）或WEHI231克隆（E）的细胞活力分析。用不同剂量的紫杉醇或抗Fas抗体（100 ng/ml）（D）刺激表达可比较WT、S70A、S87A、AA/A BCL-2或Neo对照载体的Jurkat克隆24小时（C），而用抗IgM抗体（1:100稀释的BET-2上清液）处理WEHI-231克隆（E）。使用流式细胞术通过PI排除来确定存活率。结果表示三次分析的平均值。另一组表达WT或突变BCL-2的独立克隆显示出类似的结果。
BCL-2磷酸化位点的替换导致抗凋亡功能的增强。
为了评估BCL-2磷酸化和抗凋亡功能之间的关系，鉴定了稳定表达WT BCL-2可比水平的Jurkat克隆和WEHI-231克隆以及三个BCL-2突变体（图。B） ●●●●。Jurkat克隆用紫杉醇剂量递增处理，当评估存活率时，每个克隆都显示出剂量依赖性细胞死亡（图。C） ●●●●。与Neo对照组相比，WT BCL-2仅产生最小的耐药性（1.0μM紫杉醇时为～35%，而非～28%）。然而，在紫杉醇治疗后，所有三个BCL-2突变体均显示出比WT BCL-2更强的抗凋亡功能。表达三个突变体S70A、S87A和AA/A的Jurkat克隆在抗Fas Ab激活后显示出几乎相同的抗凋亡功能增强（24小时存活率为～35%至40%），而WT BCL-2为～15%（图。D） ●●●●。在用抗IgM抗体治疗的WEHI-231细胞中，所有三种突变的BCL-2结构体也比WT BCL-2更有效（72小时时为-45%至50%，而不是-30%）（图。E） ●●●●。这些数据表明，即使在单个位点（S87或S70）消除磷酸化也能在广泛的死亡刺激后提高分子的抗凋亡功能。
内源性BCL-2通常在G时磷酸化2/循环电池中的M。
由于紫杉醇在G2/在细胞周期的M期，我们询问其对BCL-2磷酸化的诱导是否反映了对正常发生的BCL-2在G期磷酸化的过度反应2/M。为了评估BCL-2在整个细胞周期中是否正常磷酸化，我们通过离心淘洗检测了特定细胞周期阶段富集的Jurkat细胞内的内源性BCL-2。富含洗脱液的G1-、S-和G2/对来自异步生长Jurkat T细胞的M期细胞进行BCL-2磷酸化评估。典型的磷酸化运动移位带在G区显著2/M期人口，但S期人口较少，G期人口不明显1-相位传感器（图。A） ●●●●。
细胞周期中BCL-2的磷酸化。（A） 内源性BCL-2在G时的磷酸化2/M相。洗脱Jurkat-Neo细胞以富集G1、S和G2/M分数并与异步单元进行比较（续）。细胞裂解物用抗BCL-2单克隆抗体6C8进行免疫沉淀（IP），随后用抗hBCL-2抗体BCL-2/100进行Western blot。G中细胞的百分比1、S和G2/利用FACScan和CELLQUEST软件通过PI染色测定M。（B） Ser70在循环细胞中被磷酸化。对表达WT、S70A或S87A BCL-2的Jurkat克隆进行淘洗并进行Western分析。（C） G处具有磷酸化BCL-2的细胞2/M表现出对凋亡的敏感性增加。对表达WT或S70A BCL-2的Jurkat克隆进行淘洗，并对典型的G1-、S-和G2/将富含M的组分与异步细胞进行比较（续）。用每毫升100纳克抗Fas抗体处理细胞，6小时后通过PI排除法测定细胞活力。当异步细胞的存活率设置为100%时，值表示每个部分的相对存活率。值是重复分析的方法。
Ser70是细胞周期中正常磷酸化的主要位点。
来自G的内源性BCL-22/Jurkat细胞中富含M的部分仅显示一条迁移带，与正常细胞周期进程中的单一磷酸化位点一致。为了确定这个磷酸化位点，对表达WT、S70A或S87A BCL-2的Jurkat克隆进行淘洗，并对富含细胞周期的部分进行分析。在G中观察到一个离散的迁移带2/WT和S87A克隆的M分数，但S70A克隆中没有，这表明Ser70是循环细胞中的主要磷酸化位点（图。B） ●●●●。
为了确定细胞在整个细胞周期中对凋亡的敏感性是否不同，用抗Fas抗体处理淘洗的部分，并测定细胞活力。G2/与非同步群体相比，表达WT BCL-2的M富集细胞对细胞死亡的易感性增加（～155%）（视为对照，表示为100%相对细胞死亡）（图。C） ●●●●。证据表明，这增加了G的敏感性2/M归因于表达BCL-2 S70A的Jurkat克隆提供的BCL-2磷酸化。BCL-2 S70A的存在恢复了对G的抗性2/抗Fas抗体刺激的M细胞分数（图。C） ●●●●。
细胞周期蛋白B1-Cdc2不是BCL-2激酶。
这些发现表明内源性BCL-2被G激活的激酶磷酸化2/M。虽然BCL-2磷酸化位点S70和S87与Cdc2底物的磷酸化共识位点仅弱匹配，但Cdc2将是一个明显的候选位点（S/T-P-X-R>S/T-P）(40). 为了测试这种可能性，来自淘析富集G的细胞裂解物1、S或G2/用抗细胞周期素B1抗体免疫沉淀Jurkat细胞M组分，以重组BCL-2-His或组蛋白H1为底物进行体外激酶检测。正如预期的那样，Cdc2在G时被激活2/M和磷酸化其经典底物组蛋白H1，但没有磷酸化BCL-2（图。A） ●●●●。这表明Cdc2不是负责任的激酶，尽管它被紫杉醇激活并参与乳腺癌细胞的凋亡(68).
G公司2/体外M激活的ASK1-JNK1通路和BCL-2的JNK1-磷酸化。（A） G公司2/M激活的细胞周期蛋白B1-Cdc2复合物不磷酸化BCL-2。淘洗过的G1（分数[Fr]3）、S（Fr 8）和G2/裂解Jurkat细胞的M（Fr 11）组分，并用抗细胞周期素B1免疫沉淀（IP）。对底物组蛋白H1的磷酸化进行了评估。还评估了该激酶复合物对重组hBCL-2-His的活性。箭头表示基板的位置。使用FACScan和CELLQUEST软件通过PI染色分析细胞周期状态。（B） 染料木素和staurosporine抑制paclitaxel诱导的BCL-2磷酸化。用各种激酶抑制剂对表达WT BCL-2的Jurkat细胞进行预处理，包括50μM PD98059（第3条车道）、10μM SB203580（第4条车道），10μM SB202190，每毫升20纳克雷帕霉素（第12道）或二甲基亚砜（第1、2和8道）60分钟，然后用（+）或不用（-）紫杉醇处理6小时。通过Western blot分析检测BCL-2磷酸化。（C） 体外激酶（IVK）测定。ASK1-JNK1通路在G激活2/循环细胞M期，JNK1在体外磷酸化BCL-2。用抗ASK1（DAV）血清或抗JNK1抗体免疫沉淀Jurkat细胞淘洗组分的裂解液。ASK1复合物与GST-MKK6孵育，然后与GST-p38γKN作为底物孵育以测量激酶活性。以GST–c-Jun（79）为底物测定JNK活性。重组hBCL-2-His也与JNK1复合物孵育。基板的位置由开口箭头表示。激酶活性的倍数激活是通过荧光图像分析检测到的，其活性为G1设置为1.0。免疫沉淀物的西方分析证实，每个组分中的激酶蛋白数量相等（未显示）。
为了获得有关BCL-2激酶的信息，我们测试了一系列激酶抑制剂，以确定它们是否影响BCL-2磷酸化。Jurkat-BCL-2细胞用各种激酶抑制剂预处理，然后暴露于紫杉醇（图。B） ●●●●。Staurosporine（广谱Ser/Thr激酶抑制剂）和genistein（酪氨酸激酶抑制剂）均显著抑制了紫杉醇诱导的BCL-2磷酸化。相比之下，磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂（沃特曼和LY 294002）、MEK抑制剂（PD98059）、p38抑制剂（SB203580和SB202190）、p70 S6激酶抑制剂（雷帕霉素）和PKA抑制剂（Rp-cAMP）并没有实质性损害BCL-2的磷酸化。因此，该抑制剂研究表明蛋白酪氨酸激酶和Ser/Thr激酶参与了紫杉醇诱导的BCL-2磷酸化。
ASK1和JNK1在G处激活2/M、 和JNK1磷酸化BCL-2。
BCL-2磷酸化位点符合MAP激酶和JNK/SAPK底物的一致模体，但缺乏对激酶抑制剂（PD98059、SB203580和SB202190）的反应表明ERK和p38不可能是BCL-2激酶。紫杉醇已被证明可导致JNK/SAPK激活(64). 其候选性由免疫复合物激酶试验支持，该试验采用内源性JNK免疫沉淀法，从用茴香霉素（10μg/ml）或紫外线（300 J/ml）处理的Jurkat细胞中进行2)持续30分钟。免疫沉淀、活化的JNK磷酸化重组BCL-2-His及其标准底物GST–c-Jun（数据未显示）。因为BCL-2在G2/在正常循环细胞中，我们接下来测试JNK在G2/并且能够磷酸化BCL-2。JNK从淘洗Jurkat细胞的细胞周期富集组分中进行免疫沉淀，并进行体外激酶分析。来自G的JNK2/M组分的活性是G组的三倍1以c-Jun为底物进行检测，也证明对磷酸化重组BCL-2更有效。
ASK1是MAP3K（MAP激酶激酶）亚家族的成员，激活JNK通路，是肿瘤坏死因子和Fas-Daxx诱导凋亡所必需的(6,25). ASK1也被微管损伤剂激活(64). 因此，我们检测了Jurkat细胞的细胞周期部分中的ASK1活性。ASK1活性在G时大约高出6倍2/M比G1相位（图。C） ●●●●。
ASK1/MKK7/JNK1通路负责体内BCL-2的磷酸化。
为了确定ASK1-JNK途径是否在体内磷酸化BCL-2，我们用BCL-2表达载体、ASK1载体和/或增加数量的JNK1载体共同转染293个细胞。JNK1以剂量依赖的方式诱导BCL-2磷酸化，但依赖于ASK1的存在（图。A） ●●●●。外源性JNK1的激活通过抗磷酸化JNK特异性抗体（图。A） ●●●●。单独转染ASK1可通过激活内源性JNK介导BCL-2适度磷酸化（图。A） ●●●●。相反，p38激酶与ASK1共转染或不共转染对BCL-2磷酸化几乎没有效果（图。A） ，与激酶抑制剂数据一致（图。B） ●●●●。
ASK1-JNK1途径在体内磷酸化BCL-2。（A） 体内JNK1对BCL-2的剂量依赖性磷酸化。用20ng hBCL-2或对照载体以及指示量的HA-ASK1、HA-JNK1和/或HA-p38转染293细胞，如图所示。通过添加补偿量的空载体pcDNA3，转染DNA的总量保持不变。24 h后，通过Western分析检测细胞的BCL-2磷酸化、每个激酶的表达水平以及JNK和p38的激活。开放箭头表示激活的内源性JNK（p46和p54）。（B） 体内ASK1-JNK1通路的底物特异性。将WT或磷酸化位点突变BCL-2表达载体（20 ng）与ASK1（500 ng）和JNK（750 ng）或pcDNA3共转染到293细胞中。通过Western分析评估转染24小时后产生的裂解物的BCL-2磷酸化。（C） dnASK1、dnMKK7和dnJNK1抑制BCL-2磷酸化。如图所示，WT BCL-2（20 ng）与dnASK1（500 ng）、dnSEK1（500mg）、dnMKK7（500 ng。通过添加pcDNA3使转染的DNA总量标准化。16 h后，将紫杉醇添加到最终浓度为1μM的溶液中，再培养细胞8 h。通过免疫印迹法测定BCL-2磷酸化和显性阴性（dn）激酶的表达水平。
通过比较突变株和WT BCL-2的共转染，检测转染ASK1/JNK1磷酸化BCL-2正确位点的准确性。ASK1/JNK1导致WT BCL-2的两个迁移带移位，表明Ser70和Ser87的单磷酸化和双磷酸化（图。B） ●●●●。与此一致的是，单位点突变体（S70A和S87A）揭示了单个移位部分。双（S70A S87A）或三AA/A（T69A S70A S87A）突变体缺乏任何迁移率变化，这证实ASK1/JNK1磷酸化了在G2/或通过紫杉醇治疗。
为了评估内源性ASK1/JNK1途径是否与BCL-2磷酸化有关，我们在该途径中使用了主要的负性激酶（图。C） ●●●●。没有单一的显性负性激酶表达载体能够抑制紫杉醇诱导的BCL-2磷酸化。然而，通过共同转染dnASK1、dnMKK7和dnJNK1抑制通路中的多个步骤，可以显著抑制BCL-2的磷酸化。值得注意的是，dnSEK1不如dnMKK7有效（图。C） ●●●●。这些数据支持BCL-2磷酸化中的ASK1/MKK7/JNK1轴。
讨论
BCL-2的磷酸化是BCL-2家族分子翻译后修饰如何相互转换活性构象到非活性构象的又一个例子。然而，有关磷酸化是否激活的文献中存在不确定性(36)或失活(21)BCL-2的抗凋亡功能。因此，我们选择首先对BCL-2的体内磷酸化位点进行详细的2D定位和序列鉴定，然后对其进行个体和集体替换。Ser70、Ser87和Thr69被证明被磷酸化，并且都位于BCL-2α1和α2螺旋之间的非结构环区域。三个迁移带分别对应于一个、两个或三个磷酸化位点。磷酸化位点的数量似乎取决于激酶激活的强度。在正常细胞周期进程中，Ser70是主要的磷酸化位点。Haldar等人(19)和Srivastava等人(55)还注意到Ser70是对微管损伤剂的主要磷酸化位点。我们还注意到，继紫杉醇之后，Ser70在Ser87之前被磷酸化（未显示），尽管此事件序列不是专性的，因为Ser87在S70A突变中被磷酸化。由于紫杉醇或长春新碱对微管的损伤或生理性抗IgM或抗Fas Ab信号的损伤，单个S70A和S87A突变体以及三个AA/A突变体均表现出增强的抗死亡活性。BCL-2磷酸化失活的证据与磷酸化BCL-2不太可能与BAX分子异源二聚体的观察结果一致(47,55). 这与最初的建议一致，即BCL-2的磷酸化将失活(20). 我们的发现与另一种系统的观察结果不一致，在这种系统中，S70A BCL-2突变体在NSF/N1.H7细胞（一种IL-3依赖性细胞系）中表现出较少的保护作用(27)，尽管我们发现S70A突变体能够保护另一个IL-3依赖性系FL5.12(第44页). 值得注意的是，这里研究的所有BCL-2突变体（S70A、S87A和三重AA/A）都显示出大致相当的保护作用，这表明这三个位点可能协同作用来调节BCL-2。有趣的是，这些突变体提供的保护，包括BCL-2 AA/A，它消除了所有磷酸化，并不像报道的缺乏非结构环的突变体那样完整(5,54). 虽然这可能意味着环的修饰超出了磷酸化，但也可以想象，环缺失更有效地将BCL-2锁定在活性构象中，而磷酸化只影响活性构象和非活性构象之间的平衡。
BCL-2在G区的磷酸化2/正常循环细胞的M期表明，BCL-2的磷酸化是一个正常的生理过程，而不仅仅是对微管损伤的反应。具有多种作用的药物，包括诺卡唑、紫杉烷和长春碱，都能导致BCL-2磷酸化，这表明在G2/M可能是常见事件。在G时灭活BCL-2的目的是什么2/M？细胞周期进展和BCL-2之间存在相互关系的先前证据。在IL-3依赖细胞中，BCL-2的磷酸化与进入细胞周期的时间相关(47).Bcl-2型-缺陷T细胞表现出加速的细胞周期进入，但有增加细胞凋亡的风险。相反，BCL-2的过度表达延迟了进入S期和明显位于限制点的T细胞，这反映在激活后IL-2的生成减少(31,37,45,61). 如果BCL-2在G处有类似的阻止作用2/M、 其释放可能需要磷酸化。或者，这里提出的证据支持另一个模型：细胞在G期更容易受到死亡信号的影响2/M和该特征可归因于BCL-2的磷酸化。因此，降低G2/M将确保消除染色体分离异常的细胞。为了支持这个模型，BCL-X的过度表达L（左）已经注意到导致四倍体增加(39).
我们的发现表明，相同的ASK1/JNK途径负责正常细胞周期相关和紫杉醇诱导的BCL-2磷酸化（图。). 这表明BCL-2对微管损伤药物的磷酸化反应可能只是一个过度的正常过程，仅次于其G2/M被捕。另外，导致BCL-2磷酸化的相同药物（紫杉烷、长春碱、诺可唑和秋水仙碱）也激活ASK1/JNK激酶途径，这可能存在更密切的关系(64). 在我们的研究中，该途径中没有一个显性负激酶能够阻断紫杉醇诱导的BCL-2磷酸化，这与其他观察结果一致(63). 然而，该途径每一步的联合显性阴性（dnASK1/dnMKK7/dnJNK1）都能有效地干扰BCL-2磷酸化。与此一致，WT ASK1/JNK1的联合过表达能够在体内磷酸化BCL-2。据报道，JNK家族介导促凋亡和抗凋亡反应，可能反映了细胞类型的特异性(26). 这由支持Jnk1/Jnk2双缺陷胚胎，显示区域特异性凋亡，后脑死亡减少，前脑凋亡增加(29). 尽管p38被认为是有丝分裂纺锤体检查点的组成部分，但SEK1和p38均无明显作用(59). 最近，活化的JNK1/2被证明与MAP3K，MLK（混合谱系）Ser/Thr激酶共定位，沿着微管点状结构。潜在的兴趣是，MLK与驱动蛋白运动蛋白KIF3家族相互作用(42). 为了进一步支持微管和细胞死亡途径之间的直接关系，另一个BCL-2家族成员BIM与LC8动力蛋白轻链蛋白结合(48). 在这种情况下，包括线粒体在内的细胞器通过微管相关的运动蛋白沿着微管运输(23). BCL-2定位于线粒体、内质网和核膜，沿着微管的运输将这些细胞器排列在中期板上，以便在有丝分裂时将它们平等地分离给子细胞。因此，与这些细胞器相关的BCL-2可以与微管中发现的活化JNK途径激酶并置。因此，导致微管功能障碍的药物将激活相同的MAP3K/JNK通路，促进包括BCL-2在内的正常底物的磷酸化（图。).
BCL-2磷酸化中ASK1/MKK7/JNK1途径的示意图。ASK1是一种MAP3K，被细胞外和细胞内刺激激活以诱导JNK通路激活。JNK磷酸化BCL-2，使其抗凋亡功能失活。TNFR1，肿瘤坏死因子受体1。
