屏蔽蛋白复合物促进BRCA1-null细胞中DNA末端连接并对抗同源重组

FAM35A/C20orf196复合物与53BP1/RIF1/MAD2L2相互作用并作用于其下游

序列分析表明，FAM35A和C20orf196在脊椎动物中具有很好的保守性。此外，结构预测建模（RaptorX；http://raptorx.uchicago.edu/)发现FAM35A含有一个无序的N末端和一个有序的C末端区域，其中包含三个OB折叠，最后一个C末端OB折叠/FAM结构域包含CXXC型锌指基序(图2a). 值得注意的是，该组织与ssDNA结合蛋白RPA的RPA1亚基和也结合ssDNA的CST复合物的CTC1亚基非常相似²³在这方面，我们注意到，虽然C20或196 N末端（残基1-70）被预测为内在无序，但其C末端部分结构更为复杂，可能含有单翼或双翼螺旋（WH）结构域(图2a)与酵母CST亚单位Stn1中的类似^23,24表明C20orf196和Stn1可能发挥类似或互补的作用。

在单独的窗口中打开

图2

FAM35A和C20或196域、相互作用和IRIF形成。

a、，FAM35A和C20或使用的196个预测域和变体、OB折叠（OB）、FAM域（OB3/FD）。b、，通过mCherry-LacR-C20orf196将FAM35A/衍生物GFP-融合物招募到染色体Lacooperator阵列。所示数据代表3个实验，量化如所示补充图2a.比例尺10µm。c、，（左侧和中间面板）纯化的重组GST-FAM35A直接与重组His-C20orf196相互作用。c、 （右图）通过联合免疫沉淀和免疫印迹分析表达GFP-FAM35A/衍生物和HA-C20orf196的细胞提取物。日期：，V5-FAM35A与GFP-MAD2L2共同免疫沉淀；与C20或196的相互作用如所示补充图2c.e、，IR（5Gy）处理后5 hγH2AX阳性细胞中诱导型GFP-FAM35A（左侧）和GFP-C20orf196（右侧）IRIF的定量。N=4个独立实验，除了（左面板）si53BP1（N=3）、siRIF1和siMAD2L2（N=2）；以及（右侧面板）siCTRL（n=5）、siRIF1（n=3）、siFAM35A（n=3）。f、，如（e）所示，但对于可诱导的GFP-FAM35A N末端；n=4个独立实验，siRIF1除外（n=3）。克，与GFP-FAM35A N末端的内源性MAD2L2共同免疫沉淀。e-f、，条形代表平均值±SEM，单向方差*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.05，ns=不显著（p≥0.05）；在条形图上绘制的单个数据点。统计源数据（包括精确的p值）如所示补充表5所有免疫印迹都是两个独立实验的代表；免疫印迹的未处理扫描如所示补充图8.

通过结合细胞共定位和共免疫沉淀实验，我们确定FAM35A和C20orf196直接相互作用的方式主要是，但不完全是由FAM35AOB3/FAM结构域介导的(图2b-c,补充图2a-b). 由于FAM35A或C20orf196的缺失与BRCA1缺陷细胞中53BP1/RIF1/MAD2L2的缺失有相似的影响，我们测试了这些因素之间可能的相互作用。因此，通过联合免疫沉淀和质谱（MS）研究，我们发现C20orf196和FAM35A都与MAD2L2相互作用，后者是53BP1/RIF1/MAD2L2轴的最远端因子，介导BRCA1缺陷细胞中PARP抑制剂敏感性^6–13(图2d,补充图2c).

在电离辐射（IR）诱导的核病灶（IRIF）中，许多DDR蛋白积聚在DSB位点⁵我们确定FAM35A和C20orf196均形成IRIF，并且通过活细胞成像研究发现，这些蛋白质也被招募到激光微辐射诱导的局部DNA损伤位点(补充图2d). 此外，我们通过共焦显微镜和超分辨显微镜确定FAM35A与已建立的DSB标记物磷酸化组蛋白H2AFX共定位²⁵（γH2AX）和53BP1²⁶(图2e-f,补充图2e). 值得注意的是，siRNA/shRNA-缺失实验证明，虽然53BP1 IRIF和MAD2L2水平以及IRIF没有因FAM35A或C20或196缺失而显著受损(补充图2f-h)FAM35A和C20或196形成IRIF需要53BP1、RIF1和MAD2L2，但不需要PTIP(图2e和补充图3a-c; 注意，GFP标记的FAM35A/C20orf196的总水平受53BP1/RIF1/MAD2L2耗竭的影响最小）。我们还确定，C20或196 IRIF几乎被FAM35A耗尽完全废除，而C20或1196耗尽减少，但没有废除FAM35AIRIF(图2e). 此外，当用DNA拓扑异构酶I抑制剂喜树碱（CPT）处理细胞时，FAM35A形成核病灶；补充图3d). 值得注意的是，FAM35A的N末端对其IRIF的形成是必要的和充分的，这些IRIF依赖于53BP1、RIF1、MAD2L2和C20orf196，并且该区域可以与MAD2共同免疫沉淀(图2f-g,补充图3e-f). 总之，这些发现表明FAM35A和C20orf196作为53BP1/RIF1/MAD2L2分子组装的下游组件²¹DSB现场。

FAM35A和C20或196促进NHEJ

自53BP1、RIF1和MAD2L2推动NHEJ以来^6–13，我们测试了FAM35A和C20或196是否发挥了类似的作用。事实上，对于NHEJ因子XRCC4的缺失，53BP1、FAM35A或C20orf196的siRNA缺失通过质粒DNA随机整合到染色体中来检测NHEJ受损²⁷(图3a). 此外，FAM35A或C20或196缺失使人和小鼠细胞对IR过敏(图3b和补充图4a). 53BP1和相关因子促进NHEJ介导的免疫球蛋白重链位点的类开关重组（CSR），这是一个允许B淋巴细胞将抗体产生从一种类型改变为另一种类型的过程²⁸通过CRISPR-Cas9基因编辑小鼠CH12F3（CH12）B淋巴细胞²⁹我们确定，对于53BP1/RIF1/MAD2L2失活^{6,8,10–12,30,31}FAM35A或C20或196的丢失显著降低了CSR(图3c-d和补充图4b-d). 此外，对这些细胞中期染色体扩散的分析表明，FAM35A或C20orf196失活导致染色体断裂和异常CSR的易位症状³² (图3e-f; 来自的备注补充图4e-fCSR效应与细胞增殖缺陷、Aid或种系Sα开关区转录缺陷无关）。

在单独的窗口中打开

图3

FAM35A和C20orf196促进NHEJ和免疫球蛋白类开关重组。

a、，随机质粒整合试验。b、，用IR处理FAM35Ako和C20orf196ko细胞，并分析其克隆存活率，右侧显示AUC。a-b中，条形代表平均值±SEM，单向方差；n=3个独立实验，b中的C20或196ko除外（n=4），单个数据点绘制在条形图上；统计源数据可以在中找到补充表5.c、，小鼠IgM类开关重组和染色体不稳定性的示意图⁺B细胞（带有C的生殖系配置_μ转录）诱导表达AID并进行CSR至IgA（与C的开关配置_α转录）。CSR水平以细胞因子刺激72小时后IgA阳性细胞的百分比来测量，DNA荧光原位杂交（FISH）使用12号染色体特异性涂料（灰色染色体）和伊格用于测量染色体不稳定性的位点特异性探针（红点和绿点）伊格CSR诱导位点。日期：，与野生型（WT）CH12-Cas9细胞相比，Fam35Ako和C20orf196ko CH12-Cas8细胞的CSR水平降低。条形表示平均值±SEM，单向Anova。3个克隆的N=4个独立实验，但53BP1ko+细胞因子除外，其中N=3个克隆，53BP1ko-细胞因子，其中N=2个克隆；在条形图上绘制单个数据点。e、，的代表性图像伊格异常中期的易位和断裂，在f中定量。f、，量化伊格所示CH12-Cas9细胞中期的断裂和移位。水平条代表平均值，Fisher精确检验；n=2个独立实验，Fam35ako和C20orf196ko除外，其中n=3。对于a、b、d和f，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns=不显著（p≥0.05）；统计源数据，包括这些面板的精确p值，可以在补充表5.

FAM35A和C20orf196拮抗DNA末端切除

为了进一步探索FAM35A和C20orf196的功能，我们在含有端粒相关因子TRF2（TRF2ts）的温度敏感等位基因的小鼠细胞中进行了检测。TRF2ts在高温下失活导致染色体末端失去保护，并导致NHEJ介导的端粒融合(图4a)^6,33令人惊讶的是，通过使用短发夹RNA（shRNA）介导的mRNA沉默，我们发现FAM35A或C20或196缺失减少了这种染色体融合，就像MAD2L2缺失引起的那样(图4b,补充图5a-b).

在单独的窗口中打开

图4

FAM35A和C20orf196促进端粒介导的融合并限制DNA末端切除。

a、，TRF2ts实验装置示意图。b、，shRNA缺失FAM35A（左面板）或C20或196（右面板）可减少未标记端粒介导的染色体融合。横线表示平均值。实验进行了两次，每个条件下计数的染色体数≥1300条，并在条形图上绘制了个人数据点；源数据可以在中找到补充表5.c、，FAM35Ako和C20orf196ko RPE1细胞用BrdU（10μM）标记48小时，然后用1µM喜树碱（CPT）处理1小时，预提取、固定并在非变性条件下对BrdU进行染色，以显示ssDNA。中心线位于中线、箱限位于25的框线和胡须图^第个/75^第个百分位数和胡须±1.5xIQR；单向Anova；n=3个独立实验。日期：，由于Fam35a或C20或f196沉默，IR诱导的pRPA（S4/8）在MEF中增强。横线表示平均值。实验进行了两次，每个数据点绘制在条形图上；源数据可以在中找到补充表5.e、，RPE1-FAM35Ako或-C20orf196ko细胞显示超DNA末端切除（用1μM喜树碱处理细胞1h）。来自3个独立实验的代表性图像。比例尺10µm。（f）RPE1-FAM35Ako或-C20orf196ko细胞显示过度DNA末端切除的BLM和CtIP依赖性标记。中心线位于中线、箱限位于25的框线和胡须图^第个/75^第个百分位数和胡须±1.5xIQR；单向Anova；n=3个独立实验。克，与激光微辐射后2小时固定和染色的野生型（WT）RPE1细胞相比，FAM35Ako和C20orf196ko细胞BLM增加。左侧面板中显示的代表性图像和右侧面板中的量化图像。比例尺10µm。中心线位于中线、箱限位于25的框线和胡须图^第个/75^第个百分位数和胡须±1.5xIQR；单向Anova；n=3个独立实验。对于c、f和g，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns=不显著（p≥0.05）；包含精确p值的统计源数据可以在补充表5.

TRF2ts系统中53BP1、RIF1或MAD2L2缺失的影响与这些抵消DSB切除的因素有关^6–13,34因此，我们探讨了FAM35A和C20orf196是否也具有此功能。事实上，对于53BP1/RIF1/MAD2L2失活^6–13,35用RPA和喜树碱处理后预提取细胞核中ssDNA染色强度测定人类细胞中FAM35A或C20orf196的缺失增强了DSB切除(图4c-e; FAM35A、C20或196缺失不会改变激光微辐射诱导DNA损伤部位的RPA1动力学，补充图5c). 根据这种由典型通路介导的切除，它被切除促进因子RBBP8（CtIP）或BLM的缺失所减少(图4f). 此外，我们还确定，FAM35A或C20或196耗尽增强了BLM向激光微辐射位点的募集(图4g). 类似地，如小鼠细胞中53BP1缺失所示⁶IR处理后，这些细胞中FAM35A或C20orf196缺失导致DNA末端切除标记Ser4/8磷酸化RPA2水平升高(图4d). 结合我们的其他发现，这些数据确定FAM35A和C20orf196是53BP1/RIF1/MAD2L2介导的染色体NHEJ的关键成分，并表明其前NHEJ功能与限制DSB切除有关。

FAM35A OB折叠区与ssDNA相互作用并促进IR存活

与我们对FAM35A和RPA1之间结构相似性的预测一致，FAM35AC末端可以通过与ssDNA寡核苷酸的相互作用从细胞提取物中检索到(图5a). 根据RPA与ssDNA结合的关键类似残基，对RPA1的序列比对和FAM35A的结构建模确定了两个Trp（W）残基，预测它们位于蛋白-ssDNA界面(图5b,补充图5d). 根据这一预测，我们通过电泳凝胶迁移率分析（EMSA）发现，细菌表达的纯化的FAM35A C末端区域优先与ssDNA结合，而不是与双链DNA结合(图5c,补充图5e)当两个Trp残基突变为Ala（W489/W640A；图5c). 此外，全长FAM35A携带这些突变^{W489/W640A型})仍与C20或196交互(补充图5f)并且在细胞中形成IRIF，这些IRIF始终低于野生型FAM35A蛋白(图5d). 这表明，在通过其N末端区域招募IRIF后，FAM35A C末端ssDNA结合区域可能允许进一步招募、保留和/或稳定FAM35A。此外，与野生型蛋白质不同，FAM35A^{W489/W640A型}当重新引入FAM35A无效细胞时，没有产生显著的IR抗性(图5e). 在平行研究中，FAM35A C末端的表达并不补充FAM35A-空细胞的IR超敏反应。此外，无论细胞是否表达内源性FAM35A，FAM35A N端的表达都会使细胞对IR过敏，这意味着FAM35A的N端IRIF形成结构域可能对NHEJ具有显性负面影响(图5f; 在野生型背景下，FAM35A衍生物的过度表达不会影响奥拉帕林的敏感性，补充图5g).

在单独的窗口中打开

图5

FAM35A OB折叠介导ssDNA相互作用，是IR抗性所必需的。

a、，残基W489/W640突变为A的FAM35A示意图（顶面板）。W489和W640位置野生型FAM35A的预测3D结构（左下面板）。FAM35A W489/W640促进细胞提取物中ssDNA的高效结合（右下角）。b、，yRPA1与FAM35A C端子对齐；对yRPA1 ssDNA结合至关重要的氨基酸和FAM35A中相应的氨基酸残基被装箱。c（c），EMSA在含有10nM ssDNA或dsDNA的天然（非变性）凝胶上，以及所示纯化、细菌表达的FAM35A C末端或W489/W640A突变的µM中。日期：，可诱导GFP-FAM35A W489/W640A未能有效形成IRIF（IR 5Gy后12小时）。比例尺10µm。来自3个独立实验的代表性图像。e、，在克隆存活试验中补充FAM35A衍生物的FAM35Ako RPE1细胞；右侧面板显示AUC。f、，在克隆形成分析中，FAM35A N端而非C端或全长的过度表达使野生型细胞对IR敏感；右侧面板显示AUC。e-f、，条形代表平均值±SEM，单向方差*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，***p<0.0001，ns=无显著性（p≥0.05）；n=3个独立实验，e中第2组和第4组除外（n=2），单个数据点绘制在条形图上；包含精确p值的统计源数据可以在补充表5所有免疫印迹都是两个独立实验的代表；免疫印迹的未处理扫描如所示补充图8.

FAM35A和C20orf196拮抗BRCA1缺陷细胞的HR

PARP抑制剂产生复制相关的DNA损伤，需要BRCA1介导的HR才能有效修复¹⁹53BP1/RIF1/MAD2L2的缺失部分恢复了BRCA1缺陷细胞修复此类损伤的能力^6–13这导致了一个模型，其中BRCA1和53BP1/RIF1/MAD2L2分别在引导DSB流向HR或NHEJ方面发挥拮抗作用。因此，我们推测BRCA1可能拮抗FAM35A/C20或196的作用。因此，FAM35A和C20或196 IRIF，而不是53BP1 IRIF在BRCA1耗竭后在数量和强度上显著增强，但在BRCA2耗竭后没有显著增强(图6a-b,补充图6a-b).

在单独的窗口中打开

图6

FAM35A或C20或196缺失可恢复BRCA1缺陷细胞的HR。

a、，BRCA1或BRCA2耗竭后（5Gy后5h）U2OS细胞中GFP-FAM35A（左侧面板）和GFP-C20或196（右侧面板）IRIF的定量。条形表示平均值±SEM，单向Anova；n=3个独立实验，FAM35A siCTRL（n=4）、FAM35AsiBRCA2（n=2）和C20或196 siCTRR（n=5）除外；在条形图上绘制单个数据点。b、，在有或无BRCA1缺失的U2OS细胞中对53BP1和可诱导GFP-FAM35A IRIF进行定量（5Gy，指示时间点）。条形代表平均值±SEM，单向方差；n=4个独立实验，除53BP1 1.5h siCTRL（n=2）、53BP1 1.5 h siBRCA1和53BP1 16h siCTRR（n=3）、FAM35A 1.5h siCTRL（n=5）外；在条形图上绘制单个数据点。c、，如图所示，在Cyclin A（CycA）阳性RPE1ko细胞系中RAD51 IRIF（5Gy后5.5小时）的代表性图像（左面板）和量化（右面板）。条形代表平均值±SEM，单向方差；n=3个独立实验，在条形图上绘制单个数据点。比例尺10µm。日期：，FAM35A/C20orf196在激光诱导DNA损伤部位2小时后恢复BRCA2募集巴西航空公司1-空单元格（有关量化，请参阅补充图6e). 比例尺10µm。e（电子），用指定的siRNAs处理的U2OS-TLR细胞的HR检测（有关门控策略，请参见补充图6f). 条形代表平均值±SEM，单向方差；n=4个独立实验，在条形图上绘制单个数据点。f、，FAM35A/C20orf196失活可减轻BRCA1ko细胞自发染色体畸变的形成。图中显示了中期扩散的代表性图像，并进行了量化；条形图表示平均值，n=2个独立实验，FAM35Ako和C20或196ko（n=1）除外，在条形图上绘制单个数据点。克用指示的RPE1ko和补体细胞系进行Olaparib克隆存活试验。条形代表平均值±SEM，单向方差；n=4个独立实验，第4组和第5组（n=3）和第3组（n=2）除外；AUC如所示补充图6g对于a-c和e，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns=不显著（p≥0.05）；包含精确p值的统计源数据可以在补充表5.

总之，我们的结果表明，FAM35A/C20orf196作用于BRCA1和53BP1/RIF1/MAD2L2相反功能之间的接口，以调节DSB修复途径的选择。虽然这种作用至少可以部分通过控制DSB切除来实现，但DSB切除在BRCA1缺陷细胞中调节不当且动力学较慢^11,36，我们推断FAM35A/C20orf196也可能导致BRCA1缺陷细胞DNA损伤部位BRCA2介导的RAD51负载的严重缺陷^11,35,37事实上，对于53BP1失活，FAM35A或C20orf196的缺失恢复了RAD51 IRIF的形成巴西航空公司1-空单元格(图6c). 在探索这种效应的机制时，我们发现，在没有BRCA1的情况下，通过DNA损伤部位的RPA募集来测量，FAM35A和C20orf196敲除细胞的切除水平仍然较高(补充图6c-d). 此外，FAM35A/C20orf196的缺失也减轻了BRCA1缺陷细胞中BRCA2向DNA损伤位点募集的受损(图6d,补充图6e). 因此，研究基于细胞的染色体红绿灯报告（TLR）HR系统^38,39确定BRCA1缺陷细胞中FAM35A或C20orf196的缺失使HR恢复到与在此情况下53BP1缺失时获得的HR相似的水平(图6e,补充6f). 此外，去除FAM35A或C20orf196可挽救BRCA1敲除细胞的自发基因组不稳定表型(图6f). 基于我们的发现，FAM35A N末端区域在很大程度上调节了其对IRIF的定位(图2f,补充图3e-f)引入FAM35A N端而非C端，增强了BRCA1/FAM35A-空细胞的PARP抑制剂敏感性(图6g,补充图6g). 此外，在BRCA1基因敲除细胞中，FAM35A的失活与53BP1的失活相关，这与PARP抑制剂的耐药性有关(补充图6h). 综合考虑我们的研究结果，我们建议将C20orf196和FAM35A分别命名为SHLD1和SHLD2，或统称为“Shieldin复合体”，因为它可以保护DSB免受不当活动的影响，并促进适当的DSB修复模式。

细胞培养

将U2OS、U2OS衍生、HEK293、HEK2903T-LentiX细胞培养为³⁹.RPE1 p53缺失FRT⁴⁸在添加17 ml NaHCO的F-12（Ham’s F-12；Sigma-Aldrich）中培养RPE1 p53缺失FRT衍生细胞_三7.5%/500ml（Sigma-Aldrich）。所有培养基均添加10%（v/v）胎牛血清（FBS；BioSera）、100 U/ml青霉素、100µg/ml链霉素（Sigma-Aldrich）和2 mM L-谷氨酰胺。SUM149PT细胞在添加5%（v/v）FBS（BioSera）、10 mM HEPES、1μg/ml氢化可的松、5μg/ml胰岛素、抗生素的火腿F12营养混合物（ThermoFisher）中培养。为了维持和选择稳定表达GFP或GFP标记构建物的RPE1 FRT p53无效或U20S Trex细胞，使用2μg/ml速溶素（Sigma-Aldrich）和0.5 mg/ml G418（Invitrogen）。U2OS-TLR按³⁹除RPE1 p53缺失FRT衍生细胞外，稳定表达诱导构建物的U20S Trex细胞与1µg/ml多西环素（Sigma-Aldrich）培养24-48h以诱导GFP构建物的表达。所有细胞最初都是从ATCC细胞库中获得的，并且常规测试为无支原体。U2OS和RPE1细胞系最近通过Affymetrix SNP6拷贝数分析进行了鉴定。Trf2-/-；p53-/-；如前所述的TRF2（Ile468Ala）MEF（TRF2ts MEF）^33,49.CH12F3（CH12）²⁹和CH12-Cas9细胞系在补充有10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、50µM 2-巯基乙醇、1xMEM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和10mM HEPES的RPMI 1640中培养。

人类稳定细胞系的产生和敲除

通过转染含有GFP标记结构和pOG44（分别为1:4）的pcDNA5/FRT/TO-neo，产生稳定表达可诱导GFP标记构建物的U2OS Trex或RPE1 p53缺失FRT衍生细胞。在48小时时使用0.5mg/ml G418（Invitrogen）开始选择。通过转染“All-in-one”质粒在RPE1 p53阴性细胞中产生敲除⁴⁸使用MoFlo（Beckman Coulter）通过GFP表达进行单细胞排序。扩增单个克隆，提取基因组DNA并通过PCR、TOPO克隆和测序进行筛选。Fam35a和C20orf196的已验证小鼠胚胎干细胞（mESC）敲除物来自Haplobank(www.haplobank.at网站).

质粒和克隆

请参见补充表3.

siRNA与质粒转染

siRNAs从MWG或IDT中获得，并根据制造商的协议使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）转染。根据制造商的方案，使用TransIT-LT1（Mirus Bio）进行质粒转染。对于siRNA和DNA联合转染，质粒在siRNA处理后8小时转染。请参见补充表4.

随机质粒整合试验

按照前面的描述执行²⁷.

使用化学试剂、电离辐射和激光微辐射诱导DNA损伤

按照前面的描述执行³⁹.

FRAP与缔合动力学

按照前面的描述执行⁵⁰.

TLR分析

交通灯报告器（TLR）分析和此处使用的构造已在前面详细描述^38,39.

细胞周期分析

按照前面的描述执行³⁹.

克隆原性存活试验

按照前面的描述执行^27,39.

全细胞提取物和免疫印迹

按照之前的描述执行³⁹为了检测磷酸-RPA（pS4/S8-RPA2），通过在2xSDS缓冲液中刮取细胞，然后使用4-12%双三凝胶（Invitrogen）进行SDS-PAGE，制备裂解物，并使用SuperSignal West Pico PLUS（Thermo Scientific）进行免疫印迹。使用IRDye800CW和IRDye680标记的二级抗体在奥德赛红外成像仪（LI-COR）上进行检测。使用ImageJ对斑点进行量化。所有蛋白质浓度均采用BCA分析（Pierce）测定。所有抗体都列在补充表2.

免疫沉淀

如前所述，所有免疫沉淀程序执行两次³⁹。如图所示的联合免疫沉淀图2d（FAM35A），293T细胞与pMSCV-blas-eGFP-MAD2L2和pLX304-blast-V5-Empty或pLX304-V5-FAM35A。转染后72h的细胞暴露于25Gy IR，然后恢复3h。使用GFP-Trap_MA珠（ChromoTek），并根据制造商的方案进行免疫沉淀。对于C20或196(补充图2c)，293T细胞用pMSCV-blas-3xFlag-hMAD2L2和pcDNA5.1-GFP或pcDNA5.1-GFP-C20或f196共转染。转染后72小时，细胞暴露于25Gy IR，然后恢复3小时。用冷PBS洗涤后，在补充有上述相同抑制剂的1ml裂解缓冲液（50mM Tris HCl pH7.4；150mM NaCl；1mM EDTA；1%Triton X-100）中裂解细胞。在冰上培养30分钟，然后离心（16000 g），将预先用TBS（50mM Tris HCl，150 mM NaCl pH7.4）清洗过的反标记M2磁珠（M8823，Sigma-Aldrich）添加到裂解液中，并在4°C下旋转过夜。免疫复合物经5min煮沸洗脱。

DNA下拉实验

有关程序的详细说明，请参见³⁹使用具有以下序列的寡核苷酸：

5'BiosG/ATCGCATTGGCATTGGAATGCAGACGACTGATCGAGCTGATTCGATCGCTGATCCGATCGTATCCGTACATATCGAT-3'（IDT）

体外GST下拉

用冰镇PBS清洗葡硫酮琼脂糖珠（GE Healthcare），并用添加10%细菌裂解物（非诱导BL21细胞，用PBS/溶菌酶裂解）的PBS封闭30分钟，然后在结合缓冲液（10mM Tris pH7.5，150 mM NaCl，0.5%NP40，0.5 mM EDTA，0.5%BSA）中重新悬浮。将纯化的GST（细菌表达）、GST-FAM35A（Novus Biologicals）和His-C20orf196（Creative BioMart）以2 pmol添加到珠子中，并在4°C下培养30分钟。用10 mM Tris，pH 7.5，250 mM NaCl，0.5%NP40，0.5 mM EDTA洗涤珠子5次，并用100 mM Tris-pH 8，20 mM还原谷胱甘肽，120 mM NaCl在4°C下旋转15分钟洗脱。将洗脱液煮沸5分钟，装入4-12%Bis-Tris凝胶（Invitrogen）并进行western印迹。用指示的抗体探测斑点。

重组蛋白纯化和电泳迁移率变化分析（EMSA）

使用相同的方法纯化野生型和突变型FAM35A C末端结构域。收集的细胞在50 mM Tris pH 8.0、5%甘油、150 mM NaCl、2 mMβ-巯基乙醇、10mM咪唑、蛋白酶抑制剂（罗氏）和40 g/ml脱氧核糖核酸酶I（西格玛）中通过超声分解。在30000g离心30分钟后，将上清液加载到含有Ni-NTA亲和树脂（Qiagen）的重力柱上，该树脂与50 mM Tris pH 8.0、5%甘油、150 mM NaCl、2 mMβ-巯基乙醇和10 mM咪唑预平衡。在用相同的缓冲液洗涤小球10倍柱体积后，使用50 mM Tris pH 8.0、5%甘油、150 mM NaCl、2 mMβ-巯基乙醇和100 mM咪唑洗脱蛋白质。用Q柱（GE healthcare）缓冲液A（20 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，5%甘油和2 mMβ-巯基乙醇）透析洗脱液，并加载到5 ml Q柱上。在缓冲液B（20mM Tris pH 8.0，1M NaCl，5%甘油和2mMβ-巯基乙醇）的梯度中洗脱蛋白质。收集含有FAM35A蛋白的组分，并通过Superdex 200 10/300色谱柱（GE Healthcare）进一步纯化，该色谱柱在缓冲液GF（20 mM Tris pH 8，150 mM NaCl，5%甘油和5 mM DTT）中平衡。纯化每个步骤中的蛋白质样品在4-12%双三凝胶（Invitrogen）上进行分析。将最终纯化样品浓缩并储存在-80°C下。正向和反向90-bases DNA寡核苷酸（IDT）（F:6-FAM（6-羧基荧光素）-ATCGCATTGGCATTGCAATGCGATACGACTGAGCTAGCTGAGCTGATTCCGGCTTATTCCGGTACATATCGAT）；R： 将6-FAM-ATCCGATGTATGTAGTACAGGAATAGCCGGATATCAGCTAGTGTACCTCGATCAGTGTATCCATCATCATCATGCAATGCAT溶解在退火缓冲液（10 mM Tris pH 8.0、50 mM NaCl和1 mM EDTA）中，使最终浓度达到100μM。DNA寡核苷酸F被用作EMSA的ssDNA。混合等体积的DNA寡核苷酸F和R并退火（加热至95°C 2分钟，冷却至25°C超过45分钟）以生成dsDNA。每20μl EMSA反应包含10 nM的ssDNA/dsDNA，与不同浓度的蛋白质在20 mM Tris-HCl pH 7.5、50 mM KCl、5%（v/v）甘油、100μM DTT、10μg/ml BSA中孵育。样品在37°C下孵育15分钟，然后在0.5xTBE缓冲液中的5%聚丙烯酰胺天然凝胶上进行4°C电泳。台风9000（GE Healthcare）对DNA进行了可视化。

用于质谱分析的GFP-Trap下拉

HEK293T细胞在含有L-精氨酸和L-赖氨酸或L-精氨碱的SILAC培养基中培养[¹³C₆,¹⁵N4]和L-赖氨酸[¹³C₆,¹⁵N个₂]（剑桥同位素实验室）如前所述⁵¹转染后48小时，在补充有蛋白酶、磷酸酶抑制剂和N-乙基马来酰亚胺的改良RIPA缓冲液（50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、1%NP-40、0.1%脱氧胆酸钠）中裂解细胞。通过在4°C下16000×g离心15分钟来清除裂解液，并使用QuickStart-Bradford蛋白质分析（BioRad）估计蛋白质浓度。根据SILAC条件，将20µl预先平衡的GFP-Trap-A珠（ChromoTek）添加到2 mg裂解液中，并在4°C下旋转培养1小时，然后用改良的RIPA缓冲液进行3次洗涤。将结合的蛋白质在补充有1mM二硫代苏糖醇的NuPAGE®LDS样品缓冲液（Life Technologies）中洗脱，在70ºC下加热10分钟，并在室温下用5.5mM氯乙酰胺烷基化。将样品加载到4-12%梯度SDS-PAGE凝胶上，使用胶体蓝染色试剂盒（Life Technologies）对蛋白质进行染色用胰蛋白酶在凝胶中消化。从凝胶中提取肽并在反相C18 StageTips上脱盐⁵².

质谱分析

如前所述，在配备EASY-nLC 1000（Thermo Scientific）的四极轨道质谱仪（Q Exactive Plus，Thermo科学）上分析肽组分⁵³将肽样品加载到C18反相色谱柱上，用含0.1%甲酸的8~40%乙腈线性梯度洗脱2小时。质谱仪以数据相关模式运行，在MS和MS2采集之间自动切换。Orbitrap中获得了测量全扫描MS光谱（m/z 300–1650）。十种最强烈的离子被HCD依次分离和破碎⁵⁴在Orbitrap质量分析仪中获得碎片光谱。使用MaxQuant（开发版本1.5.2.8）分析原始数据文件⁵⁵。使用Andromeda搜索引擎，在包含92578个人类蛋白质序列的数据库中搜索母离子和MS2光谱，该序列来自2016年12月发布的UniProtKB⁵⁶在MS模式下以6 ppm的质量容限、HCD MS2模式下以20 ppm的质量容限、严格的胰蛋白酶特异性和最多允许三次误滤进行光谱搜索。半胱氨酸氨基甲酰化被搜索为固定修饰，而蛋白质N-末端乙酰化、蛋氨酸氧化、半胱氨酸的N-乙基马来酰亚胺修饰被搜索为可变修饰。根据后验错误概率对数据集进行过滤，以获得低于1%的错误发现率，该错误发现率使用目标恢复方法进行估计⁵⁷.

免疫荧光和显微成像

对γH2AX、RAD51、RPA、ssDNA（BrdU）、BLM、BRCA2、FANCD2、Cyclin A和GFP（FAM35A和C20orf196）进行共焦成像，如³⁹对于RAD51和Cyclin A，省略了预提取步骤，固定后将细胞在PBS中0.2%Triton X-100（Sigma）中渗透15分钟。使用Deltavision OMX 3D-SIM System V3 BLAZE（GE Healthcare公司的Applied Precision）采集超分辨率图像，该系统配备3台sCMOS摄像机、405、488、592.5nm二极管激光照明、Olympus Plan Apo N 60x 1.42NA油物镜以及标准激发和发射滤波器组。使用所述照明模式的三个角度和五个相移，依次对每个通道进行成像⁵⁸。以0.125μm z步长采集截面。在SoftWoRx软件版本6.5.2（Applied Precision，GE Healthcare公司）中重建原始OMX数据并注册通道。使用斐济的自定义脚本（Butler R）测量GFP-FAM35A信号相对于53BP1信号的Voxelwise近邻距离(https://github.com/gurdon-institute/OMX-空间分析). 该脚本使用Kapur的最大熵阈值法映射信号量⁵⁹和使用精确的签名3D欧氏距离变换测量距离，内部距离设置为零，以便在直方图上显示。对于所有图像，比例尺=10μm。

多重荧光原位杂交（M-FISH）

随后进行人24色多重FISH（M-FISH）探针制备和载玻片处理⁶⁰对于每个人类细胞样本，根据M-FISH分类和DAPI带型对10-30个中期进行核型分析。如前所述，使用BAC探针对中期传播进行FISH⁶¹并手动计数。对于类开关重组（CSR）分析，如前所述在中期扩散上进行DNA FISH⁶¹并手动计数。每个基因型至少评估470个中期，每个条件至少使用2个独立克隆。对于使用Alexa488-（CCCTAA重复序列）肽核酸定制探针（PN-TC060-005，Panagene/Eurogentec）进行端粒去盖、细胞采集、中期扩散的制备和端粒FISH，如前所述进行中期染色体分析⁶这些数据代表2个独立的实验，每个条件下≥1300条染色体，在盲法基因型后手动计数。

端粒融合分析：MEFs病毒转导

细胞像以前一样转导⁴⁹使用从MISSION shRNA文库（Sigma）获得的pLKO-puro shRNA慢病毒，对抗描述的或未翻译的小鼠基因（“空”）。端粒NHEJ的评估.TRF2ts MEF在39°C的非许可温度下生长24小时，以灭活TRF2并因端粒去盖而诱导NHEJ依赖的染色体端到端融合。

类别开关重组分析：CH12和CH12-Cas9细胞系

CH12-Cas9细胞系是通过转导CH12-Cas9细胞而产生的，CH12-Cas8细胞是用HEK293T中包装的慢病毒颗粒进行自旋感染制成的。质粒：pKLV2-EF1aBsd2Acas9-W、pxPAX2（添加基因#12260）、VSV-G和pMD2.G（添加基因#12259）。转导一周后48小时开始选择Blastidin（10μg/ml）。用于类开关重组分析的sgRNA表达质粒。秒gRNA被用于靶向Fam35a、C20orf196和Mad2l2/Rev7小鼠基因（每个靶基因2个sgRNAs，序列列于补充表4将.sgRNAs克隆到pKLV翻转的U6gRNA_CCDB_PB_BbsI_PGKpuro2ABFP载体中⁶².生成野生型和敲除型CH12-Cas9细胞克隆。53bp1空CH12细胞克隆（来自Fred Alt的礼物）如前所述⁶³用2.2μg的sgRNA-1和sgRNA2以及0.6μg的piggyBac转座酶表达载体对1200万CH12-Cas9细胞进行核感染⁶⁴，使用Amaxa Nucleofector、Nucleofector®Kit V解决方案（Lonza）和程序X-001。两天后，用3μg/ml嘌呤霉素筛选BFP阳性/耐嘌呤菌素的CH12-Cas9细胞，为期一周。然后将细胞单细胞稀释成96个平板，进一步培养并通过PCR进行筛选，并使用中列出的PCR引物进行Sanger测序补充表4.分类开关重组和细胞增殖分析。将CH12细胞以50000个细胞/ml的速度接种在添加了抗CD40抗体（1μg/ml，Miltenyi）、IL-4（20 ng/ml，Millenyi）和TGF-β（1 ng/ml）的完整RPMI中，以诱导IgM向IgA转换。3天后，使用IgA-PE抗体（eBiosciences）和Canto II分析仪（BD Bioscinces）通过流式细胞术分析细胞的类别转换。使用Casy细胞计数器（Roche）对活细胞进行计数。在三个独立的实验中，对3xwild-type（WT）、3xFam35a敲除（Fam35a）、3x20orf196敲除（C20或f196）、2x53bp1敲除（53bp1）和3xMad2l2敲除（Mad2l 2）进行了CSR和增殖测定。RT-PCR分析。 伊格,α种系转录本(αGLT)和援助如前所述，对mRNA进行定量¹²底漆列于补充表4.

患者源性肿瘤异种移植

如前所述，PDX是从同意的乳腺癌或卵巢癌患者样本中生成和建立的⁴⁰该研究得到了剑桥郡2 REC国家研究伦理服务局（REC参考号：08/H0308/178）和瓦尔德赫布伦医院临床调查伦理委员会（PR（AG）183/2012）的适当批准。STG201是本研究中使用的PDX模型，是一种BRCA-null模型，以BRCA1启动子甲基化、BRCA1 mRNA和蛋白表达缺失为特征。我们之前已经证明其在体内和PDX衍生细胞中对PARP抑制剂（包括奥拉帕林）的敏感性。STG201也与深层分子和药物敏感性注释有关⁴⁰和http://caldaslab.cruk.cam.ac.uk/bcape/所有其他PDX均来自乳腺或卵巢肿瘤巴西航空公司1-突变携带者或BRCA1型启动子超甲基化引起的表观遗传沉默⁴¹.PDX127未显示BRCA1的任何联合表达，但在FAM35A和C20orf196表达中均较低。5个PARPi敏感的PDX中没有一个表现出低水平的C20orf196、FAM35A或53BP1缺失，也没有BRCA1亚型。该研究符合所有涉及动物使用和人类参与者的研究相关道德规范。

体内获得性耐药性的产生

如前所述，随机化后（50mg/kg，5天/周），将AZD2281（Olaparib/Lynparza）作为PARP抑制剂（50mg/kg，5IW）给予免疫功能低下的荷瘤小鼠⁴⁰为了对皮下植入物的反应进行分类，我们修改了RECIST标准，以持续奥拉帕林治疗后肿瘤体积变化百分比为基础：完全反应（CR），最佳反应≤-95%；部分反应（PR），-95%<最佳反应≤-30%；稳定期疾病（SD），-30%<最佳反应≤+20%；进行性疾病（PD），治疗第21天肿瘤体积变化百分比>+20%。PARPi耐药PDX表现为PD，而PARPi敏感模型表现为SD、PR或CR。对于STG201，在治疗25天后收集时间匹配的溶媒和奥拉帕林治疗的样品（PARPi初始PDX），并进行RNA提取和测序处理。研究中的几只小鼠继续接触奥拉帕林，直到肿瘤再生。其中一个耐药肿瘤在治疗126天后连续传至新的宿主小鼠（PARPi耐药PDX），并用进一步的载体或olaparib进行治疗。治疗58天后，确认耐药表型，并收集样本并进行RNA测序，如下所述。生长曲线显示每个试验组至少5个独立肿瘤体积的平均和标准偏差。所有实验程序均由剑桥大学动物福利和伦理审查委员会以及瓦尔德赫布伦医院临床调查伦理委员会和动物使用委员会批准。RNA测序。按照制造商的说明，使用Qiagen-miRNeasy或RNeasy-Mini试剂盒（Cat ID，217004或74104）从所有样品中提取RNA。使用TruSeq Stranded mRNA HT试剂盒或Total RNA Library Prep试剂盒和Ribo-Zero Gold（Cat ID，RS-122-2103或RS-122-2301，Illumina）制备Illuminia测序文库。500克RNA完整性数（RIN）大于8的总RNA用于文库制备。样品按照制造商的HS（高样品）说明（零件号15031048 Rev.E，Illumina）进行处理，在DNA片段富集步骤中使用12或15个PCR循环。使用KAPA文库定量试剂盒Illumina ROX Low（Cat ID，KK4873，KAPA Biosystems）对所有文库进行定量并进行归一化。按照制造商的指示，将库集中在等体积中，并将池用于HiSeq4000测序流动池上的聚类。对双诱导文库使用150bp或100bp配对序列运行类型进行测序。在比对之前，读取的测序质量是使用Trim-Galore！（v0.4.2）http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/然后，如Callari等人或Ahdesmaki等人所述⁶⁵使用STAR（v2.5.2b）将读取结果与人类（hg19）和小鼠（mm10）的联合参考基因组对齐^66,67使用featureCounts（v1.5.2）将计数分配给基因组特征，从而使用比对分数准确区分来自人类和小鼠的读数⁶⁸。对多个测序运行的计数进行合并，然后使用edgeR包进行归一化^69,70.

代码可用性

OMX分析中使用的自定义FIJI脚本可以在以下位置找到https://github.com/gurdon-institute/OMX-Spatial-Analysis网站.

用于CRISPR-Cas9屏幕的MAGeCK命令为：

mageck test-k counts.csv-c DMSO-t WC_2461-n WC_2461

mageck test-k counts.csv-c DMSO-t WC-673-n WC-673

mageck test-k counts.csv-c DMSO-t WC-2281-n WC-2281

我们感谢所有SPJ实验室成员的支持和建议，感谢剑桥大学的同事N.Lawrence对OMX超分辨率显微镜的支持，感谢R.Butler对计算图像分析和编程的帮助。我们感谢S.Selivanova和S.Hough在质粒扩增、样品制备和组织培养维护方面的帮助，K.Dry的广泛编辑协助，F.Muñoz Martinez在CRISPR-Cas9敲除生成方面的协助，L.Radu在蛋白质纯化方面的协助，C.Lord（伦敦癌症研究所）针对SUM149PT细胞，D.Durocher（加拿大多伦多大学）针对U2OS LacSceIII细胞，F.Alt（美国哈佛大学）针对CH12F3细胞和P53结合蛋白1淘汰CH12F3细胞克隆，T.Honjo（日本京都大学）获得使用CH12F4细胞系的许可，以及雅各布斯实验室的J.Serrat获得技术援助。SPJ实验室主要由英国癌症研究（CRUK）计划拨款C6/A18796和威康信托（WT）研究员奖206388/Z/17/Z资助。核心基础设施资金由CRUK拨款C6946/A24843和WT拨款WT203144提供。SPJ从剑桥大学领取薪水。HD由WT Clinical Fellowship 206721/Z/17/Z资助。TWC由剑桥国际奖学金资助。D.P.由英国癌症研究生奖学金C6/A21454资助。PB实验室由德国研究基金会的Emmy Noether计划（BE 5342/1-1）和欧洲委员会的Marie Curie职业整合拨款（630763）支持。LP实验室由WT（研究员奖104641/Z/14/Z）和医学研究委员会（项目拨款MR/N000161/1）资助。CC实验室得到了CRUK的资助。JJ实验室得到了欧洲研究委员会拨款ERC-StG 311565、荷兰癌症协会拨款KWF 10999和荷兰科学研究组织（NWO）的支持，作为荷兰国家路线图大型研究设施的一部分，蛋白质@工作（荷兰癌症研究所蛋白质组学设施项目编号184.032.201）。LD实验室由巴斯德研究所、国家癌症研究所（#PLBIO16-181）和欧洲癌症研究委员会资助（启动拨款协议#310117）。WW是巴斯德-巴黎大学（PPU）国际博士项目的一部分，该项目得到了中国CNBG公司的资助。QW由Wellcome信托基金资助（200814/Z/16/Z to T.L.B）。VS实验室工作由西班牙经济和创新部的Salud Carlos III研究所（ISCIII）资助，该研究所部分由欧洲区域发展联邦储备基金（PI17-01080 to VS）、欧洲研究区域网、Transcan-2（AC15/00063）、与阿斯利康英国有限公司的非商业研究协议支持，以及来自Agència de Gestiód’Ajuts Universitaris i de Recerca（AGAUR，2017 SGR 540）和Orozco家族的结构性资金。VS获得了ISCIII（CP14/00228，MV15/00041）和FERO基金会对CC实验室的工资和差旅支持。