在细胞生长和增殖过程中，几个基因要么被抑制，要么被激活。这些表达的变化通常与染色质结构的变化有关，染色质结构可以由多种酶诱导，这些酶可以以ATP依赖的方式破坏核小体和/或共价修饰核小体组蛋白(17,29,41,58). 染色质重塑复合物SWI2/SNF2家族不同成员的生化特征表明，有些复合物可以催化ATP依赖性核小体破坏和组蛋白脱乙酰化(48,49,55,59). 与核小体重塑和脱乙酰酶复合物不同，人SWI/SNF（hSWI/SNF）复合物可以单独纯化，也可以与mSin3A/组蛋白脱乙酰酶联合纯化，这表明基于BRG1和hBRM的hSWI/SNF复合物存在不同的池(19,27,42). 最近的工作还表明，标记的BRG1和hBRM复合物包括II型蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5），这些复合物参与MYC/MAX/MAD靶基因的转录抑制计算机辅助设计(32). 这些研究和不同小组的工作表明，ATP依赖的染色质重塑复合物可以与各种组蛋白修饰酶协同作用，调节染色质结构(10,29). 尽管PRMT5与CYCLIN E（循环蛋白E）和计算机辅助设计目前尚不清楚它是否参与调节更广泛的基因谱，以及它是否对细胞生长和增殖有任何影响。
组蛋白甲基化被认为是转录激活和转录抑制的重要修饰。迄今为止，似乎有两种类型的组蛋白甲基转移酶，包括主要在具有赖氨酸特异性甲基化酶活性的蛋白质中发现的SET（Suvar3-9，Zeste增强子，Trithorita）结构域或PRMT的精氨酸特异催化结构域特征(18,45,58). 组蛋白H3和H4中保守赖氨酸残基的差异甲基化可导致不同的转录结果。例如，通过SET7或SET9使H3赖氨酸4（H3K4）甲基化可以激活转录(30,50)而H3K9通过SUV39H1或G9a甲基化可以诱导异染色质蛋白1的结合，并通过触发异染色素的形成促进转录沉默(1,22,28,31). 类似地，PRMT4对H3精氨酸残基的甲基化与转录激活有关，而PRMT5对H3和H4的甲基化则与转录激活相关计算机辅助设计和CYCLIN E（循环蛋白E）转录抑制(4,7,32,39). 目前，PRMT5修饰的组蛋白残基尚不清楚。
PRMT可分为I型PRMT，对精氨酸残基的单甲基化和不对称二甲基化进行催化；II型PRMT则对单甲基化精氨酸和对称二甲基化精胺酸的形成进行催化(57). 在6个PRMT家族成员中，只有PRMT5表现为II型PRMT，可以靶向组蛋白(三,32,34). 除了甲基化和调节参与核输出和信号转导的蛋白质的活性外，PRMT1和PRMT4还被证明甲基化组蛋白H3和H4并激活转录(4,51). 虽然尚未确定PRMT2底物，但似乎PRMT2可以增强雌激素受体的转录活性，并且协同激活依赖于PRMT2的催化活性(35). PRMT3和PRMT6都可以使细胞蛋白甲基化，但它们在体内的功能尚不清楚(8,47).
PRMT5最初于葡萄裂殖酵母作为一种相互作用并积极调节Shk1激酶的蛋白质，是p21的成员Cdc42/Rac公司-活化激酶（PAK），在RAS信号传导中起关键作用(13). 删除ras1（ras1）在裂变酵母中导致细胞形状改变，PRMT5的过度表达部分恢复了野生型形态，表明PRMT5参与RAS诱导的细胞骨架和形态控制途径。此外，第五阶段-与野生型细胞相比，空突变体生长较慢，长度较短，并且二者都能重新表达S.pombe公司或人类PRMT5拯救细胞形态，表明PRMT5在功能上是保守的(12). 酵母双杂交筛选表明，PRMT5可以与多种蛋白质相互作用，包括Janus激酶2（Jak2）、Orb6p激酶以及生长抑素受体1和4，这意味着II型PRMTs可能被不同信号模块的成分靶向或调节(34,40,53). PRMT5也被证明是一种复合物的一部分，该复合物可以结合SmD1和SmD3并使其甲基化，参与剪接体富铀snRNP的生物发生(9,26). 最近，研究表明，PRMT1和PRMT5与IkBα和白介素-8启动子上的转录延伸因子SPT5相互作用和共定位(20). 精氨酸甲基转移酶修饰SPT5并减少其与RNA聚合酶II的关联，这表明PRMT1和PRMT5可能参与调节转录延伸。支持PRMT5在转录抑制中作用的进一步证据来自最近的发现，这些发现表明PRMT5与沉默基因（如白细胞介素-8）或低基础活性基因（包括IkBα、，CYCLIN E（循环蛋白E），以及计算机辅助设计(7,20,32).
我们对PRMT5影响基因表达和细胞生长与增殖的机制的了解非常有限。我们之前已经报道了PRMT5与标志标记的BRG1和hBRM复合物的结合，并表明hSWI/SNF结合的PRMT5可以比高乙酰化形式更有效地甲基化低乙酰化的H3和H4。在这项研究中，我们提供了进一步的证据来证明PRMT5与内源性BRG1和hBRM复合物共纯化，并证明免疫纯化的重组和hSWI/SNF相关的PRMT5靶向相同的H3和H4精氨酸残基。我们还表明，PRMT5通过甲基化H3R8和减少参与肿瘤抑制的基因的表达，能够刺激细胞生长和锚定物非依赖性生长。这些结果表明，BRG1和hBRM-相关的PRMT5是细胞生长和增殖的重要调节因子。
材料和方法
质粒结构。
使用pBS（KS+）/标记的PRMT5生成正反义（AS）PRMT5的逆转录病毒表达载体，如前所述(32). 通过将从pBS（KS+）/Fl-PRMT5中切除的2-kbp BamHI-EcoRI片段插入BamHI/EcoRI线性化的pBabe-puromycin中，构建质粒pBabe/Fl-PRMT 5。为了产生抑制PRMT5表达的逆转录病毒载体，将PCR-扩增的1.1-kbp PRMT5 DNA片段（+39至+1140）反向插入经BamHI和SalI消化的pBabe-puromycin中。5′引物（5′-ACGCGTCGAC公司GTGATTGGCTACTATCAAGGAATC-3′）被修饰为包含SalI限制位点（下划线），而3′引物（5′-CGCGGATCC公司CATATGTCTGAGATTCCAGATTGTC-3′）包括一个BamHI限制位点（带下划线）。对于PRMT5的体外转录和翻译耦合，用SacII线性化pBS（KS+）/Fl-PRMT5以删除标记表位。通过从pBS（KS+）/CehBRM-NTP中切除5-kbp EcoRI DNA片段，构建了一个用于表达催化活性标记hBRM的逆转录病毒载体(6)并将其插入EcoRI-线性化pBabe-puromycin中。
内源性和标记的hSWI/SNF复合物的纯化，重组标记的野生型和突变型PRMT5，以及质谱。
为了纯化内源性BRG1和hBRM复合物，将300 mg HeLa核提取物加载到用BC100（20 mM HEPES[pH7.9]，100 mM KCl，5 mM MgCl预先平衡的30 ml BioRex 70柱上2、20%甘油、1 mM EDTA、0.25 mM二硫苏糖醇、0.5 mM苯甲基磺酰氟）。接下来，用补充了越来越多KCl的BC100缓冲液洗脱结合蛋白，并通过Western blotting分析收集的组分中是否存在PRMT5、BRG1和hBRM。峰组分（0.5 M和0.8 M KCl）在将含有PRMT5和hSWI/SNF复合物装入两个单独的DE52柱之前，将其与BC100混合并透析。如BioRex 70柱所述对两个柱进行洗脱，并通过Western印迹分析收集的级分是否存在含有PRMT5的hSWI/SNF复合物。来自两个DE 52色谱柱的0.3 M KCl组分包含大多数内源性hSWI/SNF复合物，用于免疫沉淀分析。将大约100μg的每个混合峰分数与10μl免疫前或免疫抗PRMT5抗体在4°C下孵育4小时。然后，将预先封闭在0.5 mg牛血清白蛋白（BSA）/ml中的蛋白A琼脂糖珠在4°C下过夜添加到每个反应混合物中。样品在4°C下培养8至10 h，收集珠子并用1 ml洗涤缓冲液（40 mM Tris-HCl[pH8.0]，250 mM NaCl，0.5%NP-40）洗涤三次。结合蛋白在十二烷基硫酸钠（SDS）-8%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并通过Western blotting进行分析。如前所述，纯化标记的hSWI/SNF复合物和Sf9表达的标记野生型和突变型PRMT5(32,42,43). 如前所述，通过质谱法鉴定了HeLa和INI1组分中凝胶纯化的70-kDa带(32).
体外翻译和免疫沉淀分析。
通过将2μg线性化质粒DNA与25μl TNT-偶联兔网织红细胞裂解物在含有[35S] 蛋氨酸和半胱氨酸（NEN）符合制造商的说明（Promega）。在体外翻译的PRMT5通过孵育约60×10而免疫沉淀三至70×10三在含有免疫沉淀缓冲液（20 mM Tris-HCl[pH7.4]，100 mM NaCl，5 mM MgCl）的250μl反应混合物中加入抗体的cpm2，1 mM EDTA，0.05%NP-40，1%抑肽酶）。在冰上培养1小时后，添加75μl 50%蛋白a琼脂糖珠浆料，并在4°C下培养反应混合物过夜。按照免疫纯化hSWI/SNF复合物的描述清洗样品，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影术分析结合蛋白。
组蛋白和肽甲基化分析。
在含有15 mM HEPES（pH 7.9）、100 mM KCl、5 mM MgCl的25μl反应混合物中，使用HeLa核心组蛋白（2.5μg）、乙酰化或非乙酰化组蛋白N末端肽（4μg2，20%甘油，1 mM EDTA，0.25 mM二硫苏糖醇，0.5 mM苯甲基磺酰氟和2.75μCiS公司-[三H] 腺苷甲硫氨酸（SAM）（Amersham Pharmacia Biotech.，Inc.）。在30°C下孵育1.5小时后，如前所述，可观察到HeLa核心组蛋白(32). 当使用乙酰化肽时，用40 mM丁酸钠补充反应混合物。在Whatman P-81滤纸上发现含有组蛋白N末端肽的反应混合物，并用10 ml 0.1 M碳酸钠缓冲液（pH 9.0）洗涤五次，以去除未合并的物质[三H] 通过闪烁计数检测甲基化肽。
细胞培养、增殖和转化分析。
HeLa S3、NIH 3T3和标记的显性阴性BRG1和hBRM细胞系在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中培养。HeLa S3和带鞭毛标记的INII-11细胞系在国家细胞培养中心（Biovest International，Inc.）生长。表达显性负性标记BRG1的HeLa S3细胞系如前所述(42). 如前所述，产生了表达突变标记hBRM的HeLa S3细胞系(43). 为了产生表达Fl-PRMT5、AS-PRMT6或MYC和RAS的细胞系，5×105通过使用Lipofectamine（Invitrogen，Inc.）将2μg pBabe/Fl-PRMT5、pBabe/AS-PRMT5或pBabe-潮霉素/MYC和pBabe-潮霉素/RAS转染NIH 3T3细胞5 h。转染后两天，在3μg嘌呤霉素/ml或480U潮霉素/ml存在下，选择表达Fl-PRMT5、AS-PRMT4或MYC/RAS的耐药细胞2周，并通过逆转录酶PCR（RT-PCR）和Western blotting分析来评估内源性PRMT5水平。在筛选了几个克隆后，NIH 3T3/AS-PRMT5克隆15被用于后续实验，因为内源性PRMT5的表达被RT-PCR定量减少了90%以上。
为了测量不同细胞系的增殖率5将细胞接种到直径为6厘米的培养板中，并允许其生长6天。每个细胞系用复制板重复增殖三次，每2天计数一次。测量溴脱氧尿苷（BrdU）掺入，106根据制造商（Becton Dickinson）的说明，用10μM BrdU处理细胞4.5或9小时。接下来，用1μl异硫氰酸荧光素结合的抗BrdU抗体孵育细胞，该抗体在提供的1×BD-Perm/Wash缓冲液中以1:50稀释。然后用1 ml 1×BD-Perm/Wash缓冲液将样品洗涤两次，并将其重新悬浮在1 ml含有20μl 7-氨基放线菌素D的染色缓冲液中，然后用荧光激活细胞分选（FACS）分析细胞。为了确定表达AS-PRMT5的NIH 3T3细胞是否发生凋亡，2×105在用FACScalibur流式细胞仪（Becton Dickinson）对DNA含量进行FACS分析之前，细胞被镀并生长4天。
为了评估NIH 3T3/Fl-PRMT5和NIH 3M3/AS-PRMT5的锚定依赖性生长潜力，4×10三细胞被放置在直径为10厘米的平板上。7天后，通过将细胞固定在10%缓冲福尔马林溶液中并用0.1%结晶紫染色，使菌落可见。用于分析锚具独立生长，2×102如前所述，将细胞接种在含有0.3%琼脂的Dulbecco改良Eagle培养基中的6厘米直径培养板中(11). 用三倍平板测试每个细胞系在软琼脂中的生长能力。对菌落进行了计数，并显示了三个不同实验的平均值。
RT-PCR和微阵列分析。
根据制造商的说明，使用Trizol试剂（Invitrogen，Inc.）从NIH 3T3、NIH 3T3/AS-PRMT5、NIH 2T3/Fl-PRMT5、HeLa S3、标记的显性-阴性BRG1和标记的显性/阴性hBRM细胞系中制备RNA。在含有20 pmol特异3′引物、3.5 mM MgCl的20μl反应混合物中使用约10至20μg总RNA2、1 mM脱氧核苷三磷酸、1×Taq-Pol缓冲液（Invitrogen，Inc.）、15 U禽成髓细胞病病毒RT（Promega，Inc.）和2.5 U RNasin。在含有2.5 U的50μl反应混合物中，使用特定引物对0.2μl或2.0μl的RT反应混合物进行PCR扩增塔克聚合酶（Invitrogen，Inc.）和2μCi的[α-32P] dCTP。扩增片段通过5%聚丙烯酰胺凝胶电泳从非特异性产物中分离出来，并用分子动力学荧光成像仪进行定量。使用特定引物对扩增以下基因：NM23型（+103到+313），ST7标准（+448至+717），RRM1型（+181到+591），循环蛋白B2（+172到+489），细胞周期蛋白E2（+69至+409），NF-κB（+393至+762），气体安全标准2（+275至+595），CDC20型（+161至+540），川东北4（+151到+542），T1l令吉（+796到+1112），全部1（+186至+432），SERPIN E1系列（+368至+798），PRMT5项目（+1093至+1306），甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH公司)（+178至+578），以及β-肌动蛋白（+140至+585）。
使用从耐嘌呤霉素NIH 3T3或NIH 3T/AS-PRMT5细胞中分离的10μg总RNA进行微阵列分析。Affymetrix MG-U74Av2高密度表达芯片包括6000个cDNA克隆和8000个表达序列标签，用于识别PRMT5水平降低时其表达发生改变的基因。该分析由俄亥俄州立大学综合癌症中心微阵列设施进行(网址：http://www.dnaarrays.org). 基因表达水平由基因芯片PM探针强度通过增强的双阵列版本的Li-Wong PM-only算法估计(5). 增强算法（i）缩放所有PM和MM探针强度，以最小化缩放MM探针强度分布中的阵列间差异，（ii）将阵列间方差分析应用于缩放PM探针强度，以便估计PM特定灵敏度，（iii）通过对每个探针集内PM探针灵敏度估计值的标度PM探针强度进行回归，估计基因表达水平，以及（iv）在每个探针集中测试一个probelevel通用线性模型，以估计P（P）阵列间差异基因表达的值。估计P（P）根据Bonferroni校正的要求，值可以低于0.05几个数量级，该校正适用于同时检测数千个基因的显著差异表达(16).
抗体和蛋白质印迹分析。
蛋白质在SDS-8-10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到硝酸纤维素上，并使用抗hSWI/SNF亚基、抗PRMT5和抗flag M2兔多克隆抗体进行检测，这些抗体已在前面描述(32,42,43). 测试抗H3（Me2)在使用ECL试剂（Pharmacia Amersham Biotech.Inc.）开发Western blots之前，在硝化纤维素上发现由Covance，Inc.生成的R8抗体甲基化和非甲基化H3肽。抗-MAD和抗H3AcK9分别从圣克鲁斯生物技术公司和Upstate生物技术公司购买。
染色质免疫沉淀（ChIP）分析。
如前所述制备交联染色质(32). 简单地说，在室温下用1%甲醛处理90-95%的10-cm直径汇合板10分钟，并在将甘氨酸添加到0.1 M的最终浓度后，在1 ml裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH8.1]、100 mM NaCl、5 mM EDTA、0.5%SDS、蛋白酶抑制剂）中收集。通过离心收集染色质，并将其重新悬浮在250μl免疫沉淀缓冲液（100 mM Tris-HCl[pH8.6]，5 mM EDTA，0.3%SDS，1.7%Triton X-100，蛋白酶抑制剂）中，然后进行超声处理。在4°C下，使用特定抗体在40μl预封闭蛋白A珠（0.5 mg BSA/ml，0.2 mg鲑鱼精子DNA/ml）存在下免疫沉淀溶解的大块染色质，其中包含大小从0.25到1.5 kbp不等的DNA片段。用300μl混合胶束缓冲液（20 mM Tris-HCl[pH8.1]，100 mM NaCl，5 mM EDTA，5%[wt/vol]蔗糖，0.2%Triton X-100，0.2%SDS），缓冲液250（50 mM HEPES[pH7.5]，250 mM NaC1，1 mM EDTA0.1%脱氧胆碱酯酶，0.2%Triton X-100），LiCl洗涤剂缓冲液（10 mM Tris-HCl[PH8.0]、250 mM氯化锂、1 mM EDTA、0.5%脱氧胆碱酯类、0.25%NP-40）和Tris-EDTA（pH 7.6）。苯酚和氯仿萃取后，DNA重新悬浮在30μl Tris-EDTA（pH 7.6）中。使用特异性引物在含有2μCi的50μl反应混合物中扩增启动子序列32]数字CTP。
结果
PRMT5可以与内源性BRG1和基于hBRM的hSWI/SNF复合物相互作用。
我们之前已经使用标记的BRG1和hBRM细胞系表明，可以发现PRMT5与亲和纯化的hSWI/SNF复合物相关(32). 为了排除PRMT5仅在BRG1和hBRM过度表达时才与hSWI/SNF复合物相互作用的可能性，我们分析了其与内源性hSWI/SNF复合体的关联（图。). HeLa核提取物在BioRex 70柱上进行分离，洗脱的蛋白质用抗PRMT5、抗BRG1和抗hBRM抗体进行Western blotting分析。先前的工作表明，基于BRG1和hBRM的hSWI/SNF复合物在磷酸纤维素11上铜化(21). 与这些结果一致，我们发现BRG1和hBRM在0.5 M和0.8 M KCl下具有系数。此外，PRMT5与两种染色质重塑ATP酶共同作用。当在DE52柱上进一步纯化hSWI/SNF富集组分时，PRMT5与BRG1和hBRM在0.3 M KCl下共稀释，表明其与内源性BRG1及hBRM ATP酶复杂。为了证明PRMT5与hSWI/SNF复合物紧密相关，我们用免疫前或免疫性抗PRMT5抗体免疫沉淀部分纯化的BRG1和hBRM复合物，并通过Western blotting检测BRG1与hBRM的存在。BRG1和hBRM在0.3 M KCl存在下与PRMT5共免疫沉淀，表明PRMT5与内源性BRG1-和hBRM-基hSWI/SNF复合物紧密相关。在BioRex 70、DE 52、Mono S和反标记M2柱上分离标记INI1核提取物时，也观察到类似的结果，进一步支持了PRMT5与BRG1和hBRM复合物的特异性紧密关联（数据未显示）。
PRMT5与内源性BRG1和hBRM复合物共存。将HeLa核提取物（300mg）装载在25ml BioRex 70柱上。收集过流（FT）后，如图所示，用增加的盐浓度清洗柱。收集组分并用抗PRMT5、抗BRG1或抗hBRM抗体进行Western blotting分析。汇集来自BioRex 70柱的峰级分（0.5M KCl洗脱的级分4至28和0.8M KCl洗脱的级分4至12），并对BC100缓冲液进行透析。将透析蛋白加载到两个DE 52柱上，并按照BioRex 70柱所述进行洗脱。使用免疫前（PI）或免疫（I）抗PRMT5抗体合并峰值分数（0.3 M KCl）并进行免疫沉淀。经过大量洗涤后，用所示抗体进行蛋白质印迹分析。
虽然通过常规色谱纯化可以监测PRMT5与hSWI/SNF复合物的结合，但通过该方法纯化的活性组分数量非常有限。因此，我们使用带鞭毛标记的INII-11细胞系纯化含有PRMT5的BRG1和hBRM复合物(43). 将Fl-INI1或HeLa核提取物与反标记M2亲和凝胶孵育，并在广泛洗涤后，用标记肽洗脱保留的蛋白质。然后通过银染色和Western印迹分析收集的组分（图。). 除了先前鉴定的hSWI/SNF亚基外，PRMT5在含有BRG1和hBRM的级分中富集，但在使用HeLa核提取物纯化的对照级分中不富集（图。). 为了排除PRMT5与flag抗体非特异性相互作用的可能性，我们在缺乏hSWI/SNF亚基的情况下进行了免疫沉淀实验。在体外翻译和35S标记的PRMT5与琼脂糖珠、抗标记M2珠或免疫前或免疫性抗PRMT5抗体孵育。正如预期的那样，PRMT5仅在存在抗PRMT5抗体的情况下进行免疫沉淀，这表明PRMT5不会与抗标记抗体发生交叉反应（图。). 我们还通过质谱法在免疫纯化的Fl-hSWI/SNF复合物中鉴定了PRMT5，但在HeLa组分中未鉴定出PRMT5（数据未显示）。这些结果与我们之前的结果完全一致，表明PRMT5可以与特定的hSWI/SNF亚单位相互作用(32)，并确认PRMT5与内源性hSWI/SNF复合物的关联。
带有标记INI1复合物的PRMT5辅酶。将HeLa S3或Fl-INI1核提取物（180 mg）与抗标记M2亲和凝胶孵育，用20倍摩尔过量的标记肽洗脱hSWI/SNF复合物。用银染法（A）或免疫印迹法（B）和特异性抗体分析洗脱的复合物。使用20μg Fl-INI1核提取物（输入，通道1）、15μl HeLa核提取物洗脱组分（Ctrl，通道2）和15μl洗脱标记的hSWI/SNF（Fl-hSWI/SNF）复合物（通道3）进行蛋白质印迹分析。（C） PRMT5不会与抗标记抗体发生交叉反应。在体外翻译和35S标记的PRMT5与琼脂糖珠或与琼脂酶珠交联的抗标记M2抗体孵育。作为对照，还包括免疫前（PI）和免疫（I）抗PRMT5抗体。按照A组所述清洗免疫沉淀复合物，并通过放射自显影术进行可视化。（D） 重组和hSWI/SNF-相关的PRMT5可使组蛋白H3和H4甲基化。H1缺失的HeLa核心组蛋白与Fl-hSWI/SNF复合物、亲和纯化野生型（WT）Fl-PRMT5或突变型（Mut）Fl-PMMT5/G367A-R368A在含有[三H] SAM。通过考马斯蓝染色观察组蛋白，并通过放射自显影检测甲基化产物。（E） 通过Western blot分析，随着免疫纯化的Fl-hSWI/SNF组分（100、200和400 ng）或Sf9表达和亲和纯化的Fl-PRMT5（6.25、12.5和25 ng）数量的增加，对Fl-hSWI/SNF复合物中PRMT5的水平进行定量。星号表示长时间接触抗PRMT5蛋白印迹。（F） 组蛋白H3和H4 N末端尾部的甲基化如面板D所述。反应混合物被发现在Whatman P-81滤纸上，甲基化肽被液体闪烁计数定量，如材料和方法所述。作为对照，显示BSA和H3肽（aa 60至84）的甲基化。
hSWI/SNF-相关PRMT5优先甲基化H3精氨酸8和H4精氨酸3，并被H3K9或K14乙酰化抑制。
PRMT5是一种II型精氨酸甲基转移酶，可以靶向参与信号转导、转录延伸和剪接的蛋白质(9,20,26,34). 最近，PRMT5也被证明可以使组蛋白甲基化；然而，其目标站点的身份仍然未知。使用免疫纯化的鞭毛标记的hSWI/SNF（Fl-hSWI/SNF）复合物，我们检测了PRMT5是否能甲基化H1缺失的HeLa核心组蛋白，并检测了其是否存在[三H] SAM（图。). BRG1-和hBRM-相关的PRMT5能够甲基化组蛋白H3和H4，但不能甲基化H2A和H2B。类似地，当Sf9表达和亲和纯化的标记野生型PRMT5（Fl-PRMT5）与四个核心组蛋白孵育时，H3和H4都被甲基化。相反，催化失活的Fl-PRMT5（G367A/R368A）无法甲基化HeLa核心组蛋白。值得注意的是，基于蛋白质印迹分析和银染，检测H3和H4甲基化需要7到9倍的重组Fl-PRMT5（图。数据未显示），表明与BRG1和hBRM复合物的结合增强了PRMT5甲基化酶活性。
大多数组蛋白翻译后修饰发生在组蛋白H3和H4的N末端尾部(17,45,58). 为了测试hSWI/SNF-associated PRMT5是否能甲基化组蛋白N末端尾部，我们在甲基化分析中使用了包含组蛋白H3和H4的前20个氨基酸（aa）的高纯度肽（纯度>95%）。重组和hSWI/SNF相关的PRMT5都能够特异性甲基化N-末端H3和H4肽，但不能特异性甲基化BSA或对照肽，后者在组蛋白H3的球状结构域内含有四个精氨酸残基（aa 60至84）（图。). 催化失活的Fl-PRMT5（G367A/R368A）无法甲基化H3和H4的N末端尾部。这些结果表明，H3和H4甲基化是由PRMT5催化的，并不是由于存在污染的组蛋白甲基转移酶。
由于PRMT5是一种精氨酸特异性甲基化酶，我们试图确定其在H3和H4 N末端尾部的靶位点。我们使用具有特定精氨酸-丙氨酸突变的H3和H4肽作为甲基化检测的底物（图。). 当hSWI/SNF-相关PRMT5与等量的未标记野生型和突变肽孵育时，只有H3R8A和H3R2A/R8A/R17A没有甲基化（图。). H3R2A和H3R17A这两个单点突变肽都被hSWI/SNF-相关的PRMT5有效甲基化，这表明H3R2或H3R17都不是PRMT5介导的H3甲基化的关键。为了进一步证实hSWI/SNF-相关PRMT5对H3R8的特异性，我们测试了重组Fl-PRMT5甲基化野生型和突变型H3肽的能力（图。). Fl-PRMT5能够甲基化野生型H3、H3R2A和H3R17A，但不能甲基化H3R8A和H3R2A/R8A/R17A。这表明H3精氨酸8是PRMT5甲基化的主要位点。使用类似的方法鉴定PRMT5甲基化的H4精氨酸残基（图。). 当重组或hSWI/SNF-相关的PRMT5与带有R3A取代的H4 N-末端肽孵育时，缺乏甲基化，表明H4精氨酸3优先被PRMT5甲基化。综上所述，这些结果表明，重组和hSWI/SNF-相关的PRMT5靶向H3和H4 N末端尾部的特定精氨酸残基。
重组和hSWI/SNF-相关的PRMT5可以特异性地甲基化H3R8和H4R3。在单一位置（2、8或17）或所有三个位置都含有精氨酸到丙氨酸突变的野生型和突变型H3肽与Fl-hSWI/SNF复合物（a）或标记野生型PRMT5（B）在含有[三H] SAM。类似地，用Fl-hSWI/SNF复合物（C）或Fl-PRMT5（D）培养具有单点突变（R3A、R17A或R19A）或三点突变（R 3A/R17A/R19A。如上所述，在K9或K14乙酰化的（E）H3肽与Fl-hSWI/SNF孵育。作为对照，显示BSA和野生型H3肽。
先前的研究表明，H3K9甲基化会干扰赖氨酸乙酰化，我们最近发现，高乙酰化的HeLa核心组蛋白不能被BRG1和hBRM相关的PRMT5有效地甲基化(32,36). 为了评估保守的H3赖氨酸残基的乙酰化是否会影响PRMT5介导的精氨酸甲基化，我们在甲基化分析中使用乙酰化的H3肽作为底物（图。). 乙酰化的H3K9和H3K14均未被hSWI/SNF-相关PRMT5甲基化，表明H3赖氨酸乙酰化抑制精氨酸8甲基化。
PRMT5调控基因的鉴定。
PRMT5与Shk1激酶相互作用，参与Ras和Cdc42依赖性信号传导，从而参与酵母细胞形态的控制。然而，人们对其在哺乳动物细胞中控制细胞周期进展和增殖的作用知之甚少。在确定PRMT5可以甲基化H3和H4 N末端尾部的特定精氨酸残基后，我们想确定其靶基因并研究其对其表达的影响。因此，我们建立了一种反义NIH 3T3细胞系PRMT5项目通过RT-PCR测定，转录水平降低了90%以上（图。). 当我们测量GAPDH公司mRNA水平无明显变化，β-肌动蛋白在反义PRMT5细胞系中未受影响（数据未显示）。为了确定反义结构的转录是否可以降低PRMT5蛋白水平，我们进行了Western blot分析。与RT-PCR结果一致，反义细胞系中内源性PRMT5水平降低了2.6倍，而MAD水平未受影响（图。). 这些结果表明，反义结构可以特异性地减少第五阶段表达式。
正反义（AS）PRMT5细胞系的特性。（A） 在NIH 3T3和AS-PRMT5细胞系中评估内源性PRMT5的表达。使用20μg来自NIH 3T3细胞（1至3道）或AS-PRMT5细胞（4至6道）的总RNA进行RT-PCR，并使用针对任一种细胞的特异引物PRMT5项目或GAPDH公司使用2μl（1、3、4和6道）或0.2μl（2和5道）各自的20μl RT反应混合物进行PCR。Control（Ctrl）表示PCR缺少5′底漆（通道1和4）。用于确定PRMT5转录水平的引物位于敲除PRMT5（+39至+1165）序列的下游（+1093至+1306）。（B） 用抗PRMT5和抗MAD抗体进行Western blotting分析NIH 3T3和AS-PRMT5细胞全细胞提取物的增加量（10、20和40μg）。为了定量目的，在同一个印迹上分析Sf9表达和亲和纯化的Fl-PRMT5的增加量（6.25、12.5和25 ng）。星号表示长时间接触抗PRMT5和抗MAD蛋白印迹。（C和D）RT-PCR按照面板A的描述进行，使用针对所示上调基因（C）和下调基因（D）的特异性引物。作为控制，GAPDH公司还对水平进行了分析。
为了鉴定PRMT5调控的基因，我们使用来自耐嘌呤霉素NIH 3T3和反义PRMT5细胞系的RNA进行了比较微阵列分析。我们发现227个基因上调，而只有43个基因下调，这表明更多的基因被PRMT5抑制（见补充材料中的表S1和S2）。差异表达序列列表包括参与细胞粘附和信号传导、细胞周期进展、代谢途径、蛋白质降解和染色质重塑的基因。在反义细胞系中，一些参与促进细胞周期进展的基因以及具有抗增殖特性的基因被去表达，表明PRMT5负调控其表达。在具有抑癌活性的基因中，致瘤性抑制剂7(ST7标准),非定向23(NM23型),生长抑制特定1和2(气体传感器1和气体安全标准2），赖氨酰氧化酶样(氧化锌)、和视网膜母细胞瘤样-1（p107）被解压2.5至5倍。类似地，细胞周期调节器，如川东北4,循环蛋白B2,细胞周期蛋白E2，以及CDC20型在反义细胞系中也被诱导了2到4倍（见补充材料中的表S1）。验证通过微阵列分析确定的基因转录水平是否真的受到PRMT5项目，我们对一组上调或下调的基因进行了RT-PCR分析（图。). 所有肿瘤抑制基因和细胞周期诱导基因的去表达程度与微阵列分析确定的相同。同样，激活缺陷基因，如髓磷脂转录因子1样(T1l令吉),来自染色体1q的ALL1融合基因(全部1)、和丝氨酸蛋白酶抑制剂E1(SERPIN E1系列)也受到三到四倍的影响，这与转录谱分析结果一致（见补充材料中的表S2）。因此，PRMT5调节基因的表达，这些基因的表达已被证明在不同的人类癌症中发生改变。
PRMT5刺激细胞增殖并诱导凤尾鱼非依赖性生长。
由于PRMT5负调控细胞周期诱导物和抑癌基因的表达，我们通过建立一个过度表达标记PRMT5（Fl-PRMT5）的细胞系，并将其生长特性与反义PRMT5细胞系（as-PRMT4）的生长特性进行比较，来检测其对细胞生长和增殖的影响（图。). 与NIH 3T3相比，AS-PRMT5细胞的生长速度慢了两到三倍，表明正常细胞生长和增殖需要PRMT5。与之形成鲜明对比的是，过度表达Fl-PRMT5的细胞比NIH 3T3细胞生长快三到四倍，其增殖速度与MYC/RAS转化的NIH 3T3细胞的增殖速度相似。为了理解为什么AS-PRMT5和Fl-PRMT4表现出不同的行为并显示出不同的生长特征，我们测量了它们结合BrdU的能力，并通过FACS分析分析了它们的DNA含量（图。). AS-PRMT5细胞与BrdU结合的效率不如NIH 3T3和Fl-PRMT4细胞，并且没有细胞死亡的证据。这些结果表明，AS-PRMT5细胞增殖减少不是由于诱导细胞死亡，而是由于从G1至S相。
PRMT5诱导细胞生长和增殖。（A） 用2×105材料和方法中所述的单元格。实验重复了三次，数据点代表六块平板的平均计数。包括标准偏差，但误差条太小，无法显示在图表上。（B） 用抗flag抗体通过Western印迹分析来自指示细胞系的约40μg全细胞提取物，以检测flag标记的PRMT5细胞系中Fl-PRMT5的表达。用抗PRMT5或抗MAD抗体剥离并探测相同的印迹。（C） 如材料和方法中所述，在与BrdU孵育4.5或9小时后，测定NIH 3T3、AS-PRMT5和Fl-PRMT4细胞中BrdU的掺入。通过FACS分析确定BrdU阳性细胞的百分比。（D） NIH 3T3、AS-PRMT5和Fl-PRMT5细胞生长4天，用碘化丙啶染色，用FACS分析每个细胞系的DNA含量。显示了细胞周期每个阶段的细胞百分比，包括发生凋亡的细胞（A）。
由于Fl-PRMT5细胞具有较高的增殖率，这是转化细胞的一个特征，我们测试了PRMT5的过度表达是否可以促进集落形成（图。). 当等量的正反义PRMT5细胞以依赖于锚的方式培养时，只有过表达Fl-PRMT5的细胞才能以与MYC/RAS转化细胞相当的速度形成集落。同样，当在软琼脂中培养正反义PRMT5细胞时，Fl-PRMT5和MYC/RAS转化细胞都能形成集落。然而，反义PRMT5和NIH 3T3细胞不能以非依赖于锚的方式生长。此外，与MYC/RAS转化的NIH 3T3细胞相比，Fl-PRMT5的过度表达使菌落数量增加了三倍（图。). 这些结果表明，PRMT5可以刺激细胞生长和增殖，并诱导转化。
PRMT5的过度表达刺激了锚定依赖性和非依赖性生长。（A） 约4×10三在含有10%胎牛血清的培养基中培养耐嘌呤霉素NIH 3T3、AS-PRMT5、Fl-PRMT5或耐潮霉素MYC/RAS转化细胞系的细胞，7天后用结晶紫染色菌落。（B） 等号（2×102)在软琼脂中培养10天。以大约35倍的放大倍数显示转化细胞的形态和大小的代表性图片。菌落形成试验一式三份，重复三次。下图所示的数字代表九个平板的平均菌落数。
PRMT5直接目标ST7标准和NM23型抑癌基因。
先前的研究表明，靶基因启动子区的PRMT5募集与转录抑制相关(7,20,32). 为了进一步了解PRMT5调节细胞增殖和诱导转化的机制，我们分析了通过微阵列分析在NIH 3T3、AS-PRMT5和Fl-PRMT5细胞系中确定的基因表达（图。). 我们专注于ST7标准和NM23型因为我们能够通过RT-PCR证实这两个基因在AS-PRMT5细胞系中都被解除表达（图。). 此外，两种抑癌基因的表达降低与多种癌症有关，包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、头颈癌、胃癌、胰腺癌和肾细胞癌(14,23,24,52,56). 我们还检测了髓磷脂转录因子1样(MYT1年)其在AS-PRMT5细胞中表达不足。正如预期，ST7标准和NM23型在AS-PRMT5细胞系中分别上调2.5倍和3.8倍，而T1l令吉被下调五倍（图。). 当我们检查ST7标准,纳米23，以及T1l令吉在过度表达Fl-PRMT5的细胞中的转录物，我们发现ST7标准和NM23型分别被压抑了两倍和四倍。这与反义结果和早期的观察结果一致，表明PRMT5参与转录抑制(7,32). 当我们检查T1l令吉在Fl-PRMT5细胞系中的表达，我们发现其水平增加了五到六倍，表明PRMT5也参与诱导基因表达。
BRG1和hBRM-相关的PRMT5直接参与ST7标准和纳米23（A）用特异性引物对来自Fl-PRMT5、NIH 3T3或AS-PRMT4细胞系的10μg总RNA进行RT-PCRT1l令吉,NM23型,ST7标准，以及GAPDH公司使用RT反应混合物的2μl（1、3、4、6、7和9道）或0.2μl（2、5和8道）对每个基因进行PCR。Ctrl表示不带5′底漆的PCR（通道1、4和7）。使用来自Fl-PRMT5、NIH 3T3或AS-PRMT5细胞的交联染色质进行（B、C和E）ChIP分析，如材料和方法中所述，使用免疫前（PI）或免疫（I）抗PRMT5或抗标记抗体（B）、抗H3（Me）2)R8抗体（C）或抗H3AcK9抗体（E）。作为对照，显示模拟（无染色质反应混合物）和无抗体（Ab）（有染色质但无抗体的反应混合物）反应。对于模拟反应、no-Ab反应、PI反应和I反应，扩增10μl洗脱DNA，并分析15μl每种PCR混合物。对于输入通道，PCR扩增0.6μl洗脱DNA，并在凝胶上加载10μl。使用特定引物对扩增T1l令吉（−258至+214），NM23型（−211至+254），以及ST7标准（−228至+209）序列。（D） 抗H3（Me）的特异性2)用1μg和2μg对称甲基化的H3R8肽、非甲基化的N末端和内部H3肽或BSA通过Western blot分析测定R8。
并非所有已确定的基因都可能成为PRMT5的直接靶点。一些基因可能受到间接机制的调节。使用ChIP分析，我们分析了PRMT5是否直接参与ST7标准,NM23型，以及T1l令吉（图。). 内源性PRMT5与ST7标准和NM23型PRMT5水平降低时上调。当我们评估PRMT5与ST7标准和NM23型启动子在反义细胞系中，缺乏PRMT5的招募。与此形成鲜明对比的是，在过度表达Fl-PRMT5的细胞中，外源性表达的PRMT5被招募，伴随着增加ST7标准和NM23型转录抑制（比较图中的面板A和B。). ChIP实验还表明，与ST7标准和NM23型，内源性PRMT5和Fl-PRMT5与T1l令吉启动子，表明MYT1年不是PRMT5的直接目标。
PRMT5甲基化物H3R8ST7标准和NM23型启动子区域并抑制H3K9乙酰化。
尽管PRMT5本地化为ST7标准和NM23型启动子区，是否能甲基化组蛋白尚不清楚。在确定H3R8在体外优先被PRMT5甲基化后，我们检测了该残基在ST7标准,NM23型，以及T1l令吉启动子区域。ChIP分析使用的抗体可以特异识别对称的二甲基化H3R8，但不能识别非甲基化H3肽（图。). 当抗H3（Me2)R8抗体与NIH 3T3细胞的交联染色质孵育ST7标准和NM23型检测到但未检测到MYT1年（图。). 类似地，当来自过度表达Fl-PRMT5的细胞的染色质使用抗H3（Me2)R8，ST7标准和NM23型检测到启动子序列，而T1l令吉序列不是。然而，当使用AS-PRMT5细胞的染色质进行ChIP分析时，抗H3（Me2)R8未能免疫沉淀ST7标准和NM23型启动子区域。这些结果以及微阵列和RT-PCR数据表明ST7标准和NM23型当PRMT5水平降低时被解除表达，表明H3R8的甲基化在转录抑制ST7标准和NM23型抑癌基因。
体外组蛋白N末端尾部甲基化分析表明，H3K9乙酰化抑制精氨酸8甲基化（图。). 为了评估H3K9的乙酰化是否会影响H3R8甲基化，反之亦然，我们检测了NIH 3T3细胞以及表达Fl-PRMT5和as-PRMT5的NIH 3T3细胞中H3K9乙酰化的水平（图。). 与体外甲基化试验一致，在过度表达Fl-PRMT5的细胞中，H3K9乙酰化被抑制，而在AS-PRMT五细胞中，在ST7标准和NM23型发起人。因此，这些发现表明H3K9乙酰化和H3R8甲基化之间存在负交互作用。
ST7标准和NM23型肿瘤抑制剂是基于BRG1和hBRM的hSWI/SNF复合物的直接靶点。
我们已经证明，PRMT5与BRG1和基于hBRM的hSWI/SNF复合物相关（图。和) (32). 因此，我们测试了BRG1和hBRM是否也被招募到PRMT5靶基因的启动子区域（图。). 使用来自Fl-PRMT5、NIH 3T3或AS-PRMT4细胞的交联染色质，我们发现BRG1与ST7标准和T1l令吉但不是NM23型（图。). 对hBRM招募的分析表明，它与T1l令吉和纳米23但不是ST7标准（图。). 与BRG1不同，BRG1的招聘ST7标准启动子区域独立于PRMT5水平，hBRM与NM23型启动子似乎依赖于PRMT5的存在（比较Fl-PRMT5、NIH 3T3和AS-PRMT4面板）。总之，这些结果表明，不同的基因需要不同的含有PRMT5的染色质重塑复合物进行调控。
BRG1和hBRM被差异地募集到甲基化ST7标准和NM23型发起人。从异步Fl-PRMT5、NIH 3T3和AS-PRMT5细胞系制备交联染色质，并按照图所示进行ChIP分析。带有免疫前（PI）或免疫（I）抗BRG1（A）和抗hBRM（B）抗体。作为对照，显示模拟和非抗体（Ab）反应。（C） 用30μg突变（Mut）BRG1或hBRM细胞系的核提取物通过Western blotting测定催化活性BRG1和hBRM的水平。使用HeLa S3核提取物作为对照，并使用指示的抗体检测蛋白质。（D）T1l令吉,NM23型,ST7标准，以及GAPDH公司如图所示，通过RT-PCR分析转录水平。使用来自HeLa细胞或表达突变BRG1或hBRM的HeLa电池的RNA。使用RT反应混合物的2μl（1、3、5和7道）或0.2μl（2、4和6道）进行PCR。Ctrl表示不带5′底漆的PCR（车道1）。
验证基于BRG1和hBRM的hSWI/SNF复合物是否会影响ST7标准,NM23型，以及T1l令吉表达，我们分析了这些直接靶基因在表达催化失活BRG1或hBRM的细胞中的转录水平（图。). 两者ST7标准和T1l令吉在突变BRG1的存在下，分别被二到三倍和三倍地去压制（图。).T1l令吉在表达催化活性hBRM的细胞中也被释放2.5倍；然而，NM23型在突变hBRM细胞中未受影响。这些结果表明，虽然某些PRMT5靶基因直接受BRG1和hBRM染色质重塑器的影响，但其他靶基因可能受更精细的机制调控。
讨论
我们之前已经使用表达标记的BRG1或hBRM的细胞株表明，PRMT5与标记的hSWI/SNF复合物紧密相关(32). 在本研究中，我们提供了更多证据表明，PRMT5与从HeLa或标记的INI1细胞系纯化的内源性BRG1和基于hBRM的hSWI/SNF复合物相互作用。我们还表明，hSWI/SNF-相关PRMT5与重组PRMT5一样，可以特异性地甲基化组蛋白H3和H4。H3R8或H4R3突变为丙氨酸可消除组蛋白N末端尾部的甲基化，表明这两个残基都是重组和hSWI/SNF-相关PRMT5甲基化的首选位点。我们已经通过微阵列分析鉴定了PRMT5靶基因，并表明PRMT5通过调节细胞周期诱导物和肿瘤抑制基因的表达来控制细胞生长和增殖。通过使用正、反义细胞系，我们发现BRG1和hBRM-相关的PRMT5直接参与了ST7标准和NM23型抗癌基因。我们的研究结果表明，PRMT5通过维持适当水平的抑癌基因来控制细胞生长和增殖。
PRMT5靶向H3和H4 N末端尾部的特定精氨酸残基。
H3和H4 N-末端尾部含有高度保守的残基，可以乙酰化、甲基化或磷酸化。最近的研究表明，特定赖氨酸和精氨酸残基的乙酰化和/或甲基化在转录调控中起着关键作用(2,7,30,31,38,51). 此外，修饰位点之间似乎存在一定程度的相互作用，最终结果是增强或抑制转录(15,25,36,46). 通过组蛋白赖氨酸修饰调节染色质可及性已被广泛研究，并且越来越明显的是，控制组蛋白赖胺酸乙酰化和/或甲基化的相同原理可能适用于组蛋白精氨酸甲基化。
我们之前已经表明，高乙酰化的H3和H4不能通过重组和hSWI/SNF相关的PRMT5有效地甲基化，这表明赖氨酸乙酰化可能会干扰精氨酸甲基化(32). 与这个概念一致，我们发现使用修饰的N末端H3肽，H3K9或K14的乙酰化阻止H3R8甲基化（图。). 此外，我们已经表明，在体内H3K9乙酰化和H3R8甲基化之间存在一定水平的串扰（图。). 虽然目前尚不清楚PRMT5如何抑制转录，但H3R8的甲基化可能会在空间上阻碍K9的可及性，并限制其激活乙酰转移酶的可获性。这种机制将为保持H3K9的低乙酰化和转录被抑制提供另一种途径。值得注意的是，PRMT5还以H4R3（GRG）为靶点，已知其被转录激活物PRMT1甲基化(51). 在这种情况下，一种不同的监管机制可能正在发挥作用。当H4R3被单甲基化时，PRMT5将催化其对称二甲基化。或者，如果H4R3没有甲基化，PRMT5仍然能够将反应推向对称的二甲基化。在任何一种情况下，H4R3从非甲基化或单甲基化形式转化为对称的二甲基化形式都会改变其转录激活潜能并使其转录惰性。
我们已经鉴定了PRMT5靶向的精氨酸残基，并表明H3R8和H4R3优先被重组和hSWI/SNF-相关PRMT5甲基化。H3和H4 N末端尾部的甲基化是特定的，因为BSA和内部H3肽（包含位于H3球状结构域内的四个精氨酸残基）均未显示任何甲基化。我们不能排除PRMT5甲基化其他位点的可能性，并且由于色谱后修饰肽的回收率低，通过液相色谱-质谱法鉴定额外H3和H4位点的尝试失败。
我们已经证明H3R8在ST7标准和NM23型NIH 3T3和Fl-PRMT5细胞中的启动子区域，但AS-PRMT4细胞系中没有启动子区域。我们还使用了市售抗H4（Me2)ChIP分析中的R3抗体，但我们无法确定H4R3是否甲基化。我们不能排除H4R3在ST7标准和NM23型促进剂，尤其是自商业抗H4（Me2)在ChIP分析中未测试R3抗体。因此，重要的是确定H3R8和H4R3的甲基化是否必须同时发生才能抑制ST7标准和NM23型基因表达或精氨酸甲基化是否足以诱导转录抑制。需要更多的实验来区分这些可能性，我们正在开发抗H4（Me2)R3抗体将允许我们监测PRMT5直接靶基因启动子区该位点的对称甲基化。
BRG1和hBRM相关的PRMT5通过调节ST7标准和NM23型抑癌基因。
为了研究PRMT5在转录调控中的作用，我们通过微阵列分析分析了AS-PRMT5细胞中的全局基因表达。我们发现，当PRMT5水平降低90%时，更多的基因被解除表达，这与其在转录抑制中的作用一致。我们验证了几个上调或下调的基因的差异表达（图。). 根据微阵列结果，我们预计AS-PRMT5细胞系的生长速度将快于对照NIH 3T3细胞，因为许多细胞周期调节因子包括细胞周期蛋白E2,循环蛋白B2，以及川东北4其在多种人类肿瘤中的表达已被证明增强，但其表达上调(33,37,54). 然而，增殖结果表明，AS-PRMT5细胞的生长速度是NIH 3T3细胞的两倍，而过度表达PRMT5的细胞表现为MYC公司/拉斯-转化NIH 3T3细胞。由于PRMT5与转录抑制有关，并且在反义细胞系中也发现一些抑制恶性生长的基因上调，因此我们推断PRMT5可能能够通过降低抑癌基因的表达来促进生长。事实上，分析其中两个抑癌基因的转录水平，ST7标准和NM23型在表达正反义PRMT5的细胞系中，发现当PRMT5水平降低时，这两个基因都被解除表达，而当PRMT4水平升高时，这两者都被抑制（图。).
ST7标准被鉴定为人类染色体7q31.1上的一个抑癌基因，该区域经常与不同人类癌症的杂合性缺失相关(57). 重新引入7号染色体的完整拷贝已被证明可以抑制高度恶性的人类前列腺癌PC3细胞系的致瘤生长，并且对回复克隆的分析证实7q包含负责肿瘤抑制的序列。进一步的7q31定位和再表达研究表明ST7标准是一种真正的肿瘤抑制剂，可以抑制裸鼠PC3细胞的致瘤性(56). 我们还观察到NM23型在过度表达PRMT5的细胞中，转录水平降低。高转移细胞显示低水平的NM23型，显示核苷二磷酸激酶活性(44). 此外，重新引入NM23型K-1735TK黑色素瘤细胞具有高转移性，可降低其在软琼脂中形成集落的能力，并降低裸鼠原发性肿瘤形成的发生率(23). 这些研究表明ST7标准和NM23型参与了肿瘤抑制，并证实了我们的结果，即当ST7标准和NM23型在过度表达PRMT5的细胞中，PRMT5水平降低，它们以依赖或独立于锚定物的方式过度增殖并形成集落的能力增强。我们知道，当PRMT5水平降低时，还有其他基因的表达受到影响，它们也可能参与调节细胞生长和增殖。因此，我们正在通过克隆与PRMT5结合的基因组序列来识别更多的直接靶基因。
我们已经表明，PRMT5直接参与ST7标准和纳米23转录抑制。我们还确定，虽然BRG1是专门招募到ST7标准启动子，hBRM靶向NM23型。作为对照，我们已经表明，尽管T1l令吉在反义细胞系中水平波动，PRMT5不直接参与其调节。此外，我们发现BRG1和hBRM都与T1l令吉发起人。使用表达催化非活性hBRM的细胞系，我们已经证明T1l令吉被解除压制，而NM23型未受影响。原因尚不清楚NM23型突变型hBRM的表达没有改变。一种可能的情况是突变型hBREM的表达可能导致负调控因子的去表达，负调控因子可以抑制纳米23表达式。或者，第二个染色质重塑器可能在功能上补偿hBRM，从而维持转录抑制NM23型.进一步的实验旨在确定参与调节的转录调控因子NM23型表达将有助于阐明基于hBRM的hSWI/SNF复合物在NM23型转录调控。当我们检查ST7标准和T1l令吉在表达突变BRG1的细胞中，我们发现这两个基因都被去表达，证实了BRG1在直接靶基因转录抑制中的作用。BRG1-和hBRM-相关的PRMT5参与抗癌基因的转录调控，这一事实使得这种II型蛋白精氨酸甲基转移酶成为癌症治疗中一个有吸引力的靶向分子。
