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自然结构分子生物学。作者手稿；PMC 2016年11月23日发布。
以最终编辑形式发布为：
自然结构分子生物学。2009年3月；16(3): 304–311.
2009年2月22日在线发布。 数字对象标识：10.1038/nsmb.1568
预防性维修识别码：项目经理5120857
NIHMSID公司：NIHMS107472美国国家卫生研究院
PMID：19234465

组蛋白H4R3的PRMT5介导甲基化招募DNMT3A，偶联基因沉默中的组蛋白和DNA甲基化

全照,#1,2 格哈德·兰克,#1 元太仓,1 李海涛,三 罗伯特·莫里茨,4 理查德·辛普森,4 洛蕾塔·塞鲁蒂,1 大卫·J·柯蒂斯,1 丁肖·J·帕特尔,三 C大卫·阿利斯,5 约翰·坎宁安,6和史蒂芬·M·简1,7
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

哺乳动物基因沉默是通过组蛋白甲基化而建立的和DNA，尽管这些修饰发生的顺序保持不变有争议的。以人类β-珠蛋白基因座为模型，我们证明组蛋白H4精氨酸3（H4R3me2s）的对称甲基化精氨酸甲基转移酶PRMT5是后续DNA甲基化所必需的。H4R3me2s是DNA甲基转移酶DNMT3A的直接结合靶点，它通过包含PHD基序的ADD域相互作用。损失H4R3me2s标记通过短发夹RNA介导的PRMT5导联的敲除减少DNMT3A结合、DNA甲基化丢失和基因激活。在成人骨髓中的初级红系祖细胞H4R3me2s标志着非活性甲基化珠蛋白基因与PRMT5的定位一致。我们的这些发现将DNMT3A定义为抑制性表观遗传学的读者和作者标记，从而直接连接组蛋白和基因中的DNA甲基化沉默。

DNA和组蛋白分子的共价修饰染色质为调节基因表达提供了一种可遗传的机制1,2.这些组蛋白标记协同作用，建立明显的抑制或活性染色质状态扩展了遗传密码的信息潜力。积分到这个过程是效应分子，它解释特定的修饰以影响染色质模板募集或稳定下游事件机械三.

虽然组蛋白修饰和DNA甲基化也被证明在许多情况下，这些表观遗传标记的顺序是协同作用的目前尚不清楚是否已确定。在哺乳动物中，DNA的甲基化主要局限于CpG二核苷酸中胞嘧啶环的第五位，最常见的相关染色质被抑制并抑制基因表达4,5.尽管存在一些重叠6，两个已知胞嘧啶DNA甲基转移酶的一般类别：判定元件新生代甲基转移酶，DNMT3A和DNMT3B，负责修饰非甲基化CpG位点和维持甲基转移酶DNMT1将预先存在的甲基化模式复制到新的DNA链上复制7.精确组蛋白修饰和DNA甲基化相关的事件序列因以及不同基因位点，这表明它依赖于上下文。有证据表明DNA甲基化可以影响组蛋白修饰模式在几个模型系统中获得。甲基化转基因在体外在稳定的基因组整合之前，与去乙酰化组蛋白相关，而相同但未甲基化的整合转基因富含乙酰化他的toones8,9.甲基CpG富集区域可能直接招募组蛋白甲基化酶10、或是由甲基-CpG结合蛋白结合，进而招募阻遏物复合物含有组蛋白脱乙酰酶4和组蛋白甲基化酶11,12相反，对真菌、植物的研究和哺乳动物认为H3K9的三甲基化（参考文献。13)，H3K27（参考。14)和H4K20（参考。15)是后续操作的先决条件DNA甲基化。这些过程之间的功能联系似乎可归因于组蛋白赖氨酸甲基化系统和DNA之间的物理联系甲基转移酶，如在H3K9和H3K27的背景下所建立的，其中相关的赖氨酸组蛋白甲基转移酶SUV39h1和EZH2已被证明直接与DNMT1、DNMT3A和DNMT3B相互作用（参考。16–18). 组蛋白精氨酸甲基化也与基因沉默有关，但到目前为止还没有联系精氨酸甲基转移酶和DNA甲基转移酶之间已建立。

以人类β-珠蛋白基因座为模型，我们现在报告了组蛋白精氨酸甲基化和DNA甲基化和基因沉默之间的联系。这种联系的核心是蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMT5，它对称二甲基化物H4R3。我们表明，这种组蛋白修饰可以作为直接靶向结合DNMT3A，从而提供一种新的机制抑制性组蛋白修饰和DNA甲基化相互协调。

结果

PRMT5诱导γ-珠蛋白基因上的H4R3me2s标记

β-珠蛋白基因座是分析其作用的范例表观遗传修饰在组织和发育调控中的作用特异性基因表达。在人类和灵长类中，编码胎儿的基因（γ） 珠蛋白在出生后逐渐沉默，表现出甲基化近端启动子和5'中的CpG二核苷酸簇成人骨髓中的非翻译区19.鉴定参与基因沉默的蛋白质编码γ-珠蛋白（γ-基因），我们用质谱分析表达Flag-taged的红细胞系（K562）的免疫沉淀物近端γ启动子结合转录因子NF-E4与γ基因的激活和抑制有关20。我们确定了一些表达Flag-NF-E4的细胞特异性蛋白在转染对照细胞的Flag免疫沉淀物中检测到仅表达Flag表位的载体(图1a). 蛋白甲基转移酶PRMT5（参考。21)特别有趣，因为高度相关的蛋白PRMT1已被证明在激活成人β-珠蛋白基因22.PRMT5与基因沉默有关，这增加了PRMT因子在调节中发挥协调作用的可能性珠蛋白基因亚型的胎儿-成人转换。我们确认了互动NF-E4和PRMT5之间的相互免疫沉淀未转染细胞(图1b).谷胱甘肽S-转移酶（GST）证明这种相互作用是直接的下拉，并要求N末端一半的残留物在49和100之间NF-E4型(补充图1a在线）。这两种蛋白质是定位于近端γ-启动子（P-1，其含有NF-E4结合位点），通过染色质免疫沉淀（ChIP）使用针对内源性蛋白质(图1c).PRMT5和NF-E4与γ启动子远上游区域的结合是未检测到，但检测到与P-1（P-2）和转录起始位点（TSS）下游区域延伸至外显子2（P+1至P+3）(补充图1b). 分析将描述质谱鉴定的其他蛋白质其他地方。

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PRMT5对称二甲基化组蛋白H4R3基因编码γ-珠蛋白(一)SDS-PAGE凝胶的SimplyBlue安全染色转染K562细胞的α-标记抗体免疫沉淀物在质谱分析之前，NF-E4-标记或单独载体（对照）。这个对应于PRMT5、NF-E4、多泛素化NF-E4的条带（参考。52)和已知的PRMT5伙伴蛋白核仁蛋白和pICln如图所示。哈希标记表示对应于常见的背景蛋白包括角蛋白、微管蛋白和核糖体蛋白。星号表示免疫球蛋白链。PRMT5肽序列鉴定如下所示。(b条)内源性PRMT5和来自K562细胞的NF-E4。(c（c）)内源性PRMT5和通过ChIP分析，NF-E4带有γ启动子。(d日)在体外K562中Flag免疫沉淀物的甲基转移酶分析表达PRMT5-f的细胞和表达PRMT5Δ-f的K562细胞。放射自显影（上面板）和考马斯汀凝胶（下面板）分别显示。(e（电子）)用游离组蛋白进行HMTase分析在里面d日用组蛋白H4R3me2s抗体免疫沉淀或正常兔IgG，并在相应的沉淀。CPM，每分钟计数。(（f）)H4R3me2s富集γ-启动子通过ChIP在表达PRMT5-f或PRMT5Δ-f。误差条显示s.d。

PRMT5是一种II型精氨酸甲基转移酶，与通过建立抑制性组蛋白标记实现基因沉默，包括H4R3，H2AR3的对称二甲基化（参考文献。21,23)和H3R8（参考。24). 鉴定组蛋白底物PRMT5在K562细胞中，我们衍生出一个表达标记PRMT5的细胞系（PRMT5-f）促进活性酶的免疫沉淀。这个来自该线的标记免疫沉淀剂接受标准放射性利用游离组蛋白进行组蛋白甲基转移酶活性测定，证明组蛋白H4的放射标记(图。1天，游离组蛋白）。为了确保甲基化底物对PRMT5甲基转移酶活性具有特异性，我们还推导出了一个含有标记的PRMT5突变形式的品系，其中五种氨基酸S-腺苷-我-蛋氨酸结合基序已被删除（PRMT5Δ-f）25.用该品系的标记免疫沉淀诱导组蛋白H4甲基化明显减弱，我们观察到的微弱信号可能反映了少量内源性PRMT5二聚化为PRMT5Δ-f（参考。25) (图1d，游离组蛋白）。标签的可比数量两种分析中使用的沉淀物中都含有蛋白质(图1d，免疫印迹：α-标志）。未观察到甲基转移酶活性来自未转染细胞的旗子沉淀（数据未显示）。在这种情况下，PRMT5的其他已知底物（组蛋白H2A和H3）的甲基化没有检测到。纯化核小体时，这种底物特异性是相同的从K562细胞中提取组蛋白(图1d，K562核小体）。确认PRMT5在本试验中诱导H4R3me2s修饰，我们培养三具有抗H4R3me2s抗体的H-甲基化组蛋白或具有免疫沉淀前的正常兔IgG。实质性水平在H4R3me2s产生的沉淀物中检测到放射性来自PRMT5-f标记组蛋白的抗体，但不来自PRMT5D-f反作用(图1e). 一致有了这一发现，抑制性H4R3me2s标记在细胞中的γ-启动子（和TSS下游的结合延伸）表达PRMT5-f但不表达PRMT5Δ-f，尽管这两种蛋白都结合稳健地到达近端启动子位点(图。第1页和补充图1b).

PRMT5介导γ基因转录沉默

确定是否对PRMT5影响γ基因表达，我们进行了定量实时PCR表达PRMT5-f的细胞和表达PRMT4-f的细胞的（Q-RT-PCR）分析PRMT5Δ-f(图2a).两种标记蛋白的表达具有可比性（免疫印迹：α-Flag）相当于载体控制细胞中内源性PRMT5的水平（免疫印迹：α-PRMT5）。PRMT5水平的增加导致γ基因表达的三倍下调PRMT5Δ-f的表达诱导γ基因增加两倍转录本与病媒对照(图2a，左）。检查减少的影响PRMT5表达，我们使用稳定表达的短发夹RNA（shRNAs）（PRMT5-kd）。转染表达载体的细胞含有序列用作控制（Scr）。蛋白质印迹证实PRMT5蛋白与对照组相比，PRMT5-kd细胞中的水平降低了90%以上打乱对照，但未观察到对对照蛋白微管蛋白的影响，PRMT1和GATA-1(图2b,右侧）。PRMT5的敲除导致γ基因的六倍诱导表达式与加扰向量的比较(图2b，左）。这种影响是具体的，因为K562细胞红系分化的其他标志物（GATA-1、糖蛋白A与Scr相比，PRMT5-kd细胞中的v-myb）保持不变控制(图2b，对；补充图2在线）。与γ基因一致表达数据显示，H4R3me2s抑制标记在PRMT5-kd细胞中的γ启动子和RNA聚合酶II定位与Scr控制相比增加了五倍(图2c). 我们试图确定NF-E4在PRMT5中通过产生敲除来调节γ基因表达这一因素的影响。尽管使用了几种不同的shRNA结构不能调节内源性蛋白质的水平。

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PRMT5介导γ基因的转录沉默。(一)PRMT5-f、PRMT5Δ-f或载体控制K562细胞的提取物用抗Flag或PRMT5抗体进行western blot分析（右侧）。核糖核酸用基因特异性引物对这些细胞进行Q-RT-PCR分析编码γ-珠蛋白，信号根据HPRT mRNA进行标准化级别（左侧面板）。(b条)K562细胞表达shRNA用western blot分析PRMT5（PRMT5-kd）或一个加扰序列（Scr）（右面板显示抗体）和Q-RT-PCR（左面板），如a。误差条显示s.d(c（c）)H4R3me2s富集用ChIP法检测PRMT5-kd和Scr细胞中的γ启动子。误差线显示s.d。

PRMT5和DNMT3A在基因沉默中的协同作用

四个CpG二核苷酸的甲基化立即位于转录起始位点对γ基因沉默至关重要这些CpG位于PRMT5结合区19,26,27鉴于此，我们检查了γ-基因的DNA甲基化是否在PRMT5-f中发生改变，使用亚硫酸氢盐DNA的PRMT5Δ-f、PRMT5-kd或加扰控制（Scr）细胞排序(图3a).与珠蛋白基因表达在在大部分未诱导的K562细胞中，我们观察到四种细胞的甲基化紧邻γ-珠蛋白转录起始点两侧的CpG二核苷酸21%的克隆来源于打乱的对照细胞。该频率在PRMT5-f细胞的四个位点中的三个位点增加，35%的显示甲基化的克隆。相反，所有CpG二核苷酸的甲基化在来自PRMT5-kd细胞的克隆中被废除。它也被废除了在所有来自PRMT5Δ-f细胞的克隆中，这表明PRMT5的酶活性，而不仅仅是其对γ-珠蛋白启动子对DNA的表观遗传修饰至关重要此设置。在6个月内，DNA甲基化水平（95%）没有变化b基因转录起始位点（−415到+110）两侧的CpG为在PRMT5-kd、PRMT5Δ-f或加扰控制单元中观察到(补充图3a在线）。

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PRMT5和DNMT3A在基因沉默中发挥协同作用。(一)干扰PRMT5表达对人类DNA甲基化的影响γ基因。每行显示单个CpG的甲基化状态来自至少40个克隆个体序列分析的二核苷酸亚硫酸氢盐修饰后γ基因的PCR产物PRMT5-f、PRMT5Δ-f、PRMT-kd和扰码控制（Scr）K562细胞。三条直线与Scr之间的差异非常显著(P（P）<0.01）。左边的数字代表CpG二核苷酸相对于γ基因。结果在条形图中进行了量化。ND，不是可检测。(b条)DNMT3A而不是DNMT1或DNMT3B，与来自K562细胞的PRMT5-f共免疫沉淀。高盐萃取（420 mMNaCl）用于细胞提取物制备。(c（c）)K562细胞内源性DNMT3A和PRMT5的共免疫沉淀。高盐提取液（420 mM NaCl）用于细胞提取物制备。(d日)γ-启动子处的DNMT3A结合通过PRMT5-f和PRMT5Δ-f细胞中的ChIP。误差条显示s.d(e（电子）)用ChIP在PRMT-kd和Scr中测量γ启动子处的DNMT3A结合单元格如上所示。(（f）)表达shRNA至DNMT3A的K562细胞用western blot分析（DNMT3A-kd）或一个加扰序列（Scr）指示的抗体（右侧面板）和Q-RT-PCR，以及针对γ-珠蛋白基因，信号根据HPRT mRNA水平标准化（左面板）。(克)DNMT3A敲除对DNA甲基化的影响人类γ基因，详见一. The difference between the两条线意义重大(P（P）< 0.02).

为了确定PRMT5影响DNA甲基化的机制，我们初步检测了蛋白甲基转移酶是否直接相关DNA甲基转移酶。我们分析了来自用DNMT1、DNMT3A和DNMT3B抗体免疫印迹法检测PRMT5-f细胞，以及证明DNMT3A与PRMT5共同免疫沉淀(图3b). 我们使用确认了这一点用未转染细胞提取物制备内源性蛋白抗体(图3c). 这个DNMT3A作为PRMT5相互作用蛋白的鉴定表明，它可能负责PRMT5诱导胎儿珠蛋白背景下的DNA甲基化基因沉默。为了解决这个问题，我们检查了DNMT3A与ChIP检测PRMT5-f和PRMT5Δ-f细胞中的γ启动子(图3d). 与我们的一致甲基化研究表明，DNMT3A与γ基因的结合显著减少在PRMT5Δ-f细胞中与表达PRMT5-f的细胞进行比较。DNMT3A与对照组相比，PRMT5-kd细胞中的结合也显著减少加扰控制单元(图。第三版). 为了评估DNMT3A在γ-基因沉默中的作用，我们使用shRNA方法敲低K562蛋白的表达细胞（DNMT3A-kd）。DNMT3A水平降低至加扰控制的30%(图3f，右侧）诱导γ基因表达水平增加五倍(图3f，左）。这是伴随着γ-基因CpG甲基化的两倍减少(图3g)，但没有β-基因的变化(补充图3b).

DNMT3A特异性结合组蛋白H4R3me2s

PRMT5酶活性对DNMT3A招募的重要性表明PRMT5的甲基转移酶结构域是参与两种蛋白质之间的相互作用。为了解决这个问题，我们使用了GST下拉分析，用于分析35S放射性标记在体外将DNMT3A转录并翻译为GST-PRMT5和GST-PRMT5Δ(图4a).令人惊讶的是，在野生型和突变型之间没有观察到差异蛋白质，这意味着PRMT5的酶功能可能导致DNMT3A通过替代机制进行招募。一种可能性是PRMT5诱导的H4R3me2s修饰可直接招募DNMT3A。检查为此，我们使用COOH末端生物素标记的肽下拉分析含有未甲基化Arg3残基的组蛋白H4的20-mer N-末端肽，对称甲基化或不对称甲基化。我们确认了对称H4R3me2s抗体免疫印迹甲基化(图4b，免疫印迹：α-H4R3me2s）。我们培养了等量的每种肽(图4b，考马斯染色）耦合用K562细胞的核提取物制成链霉亲和素珠，清洗珠和用DNMT3A抗体通过免疫印迹分析洗脱液(图4b，免疫印迹：α-DNMT3A）。观察到DNMT3A与H4R3me2s肽结合，但不含非甲基化或不对称甲基化肽。DNMT3A该蛋白包含一个与DNA和染色质结合有关的PWWP结构域含有植物同源结构域（PHD）锌的ATRXDNMT3-DNMT3L（ADD）结构域可能介导与其他蛋白质相互作用的手指基序（包括组蛋白）和C末端催化结构域三,28–30。我们证明了DNMT3A和H4R3me2s之间的相互作用是直接和特定的，使用下拉三肽和放射性标记的分析在体外转录和翻译的DNMT3A(图。4c类). 然后，我们绘制了DNMT3A所需的区域与H4R3me2s肽结合。未观察到与N末端的结合蛋白质的三分之一（氨基酸1-354）。较大的N末端片段（1–587）包含ADD的GATA和PHD域，但缺少相邻的C末端螺旋线，其水平与全长蛋白质(图4c).这些发现表明DNMT3A与H4R3me2s肽的结合是通过残基354和587之间的区域介导，该区域包含大多数ADD域的。因此，我们使用全长ADD（479–610）和PWWP（281–424）域生成为GST融合蛋白(图4d).观察到ADD结构域与H4R3me2s肽的特异性结合，但不含未修饰或H4R3me2a肽。未观察到与PWWP域。作为附加控制，我们包括一个未修改的N端组蛋白H3肽作为DNMT3L的ADD结构域已被证明与组蛋白H3（参考。31). ADD的绑定用该肽也观察到DNMT3A的结构域。DNMT3A的意义在这种情况下，与组蛋白H3的结合尚不清楚，因为H4R3me2s标记的缺失足以消除DNMT3A与PRMT5-kd中γ启动子的结合单元格(图3e).

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DNMT3A与携带R3me2s修饰的组蛋白H4特异性结合。(一)的绑定35标有S的在体外转录并翻译（IVTT）DNMT3A至纯化GST、GST-PRMT5和GSTPRMT5D。顶部面板，放射自显影仪；底部面板，考马斯。输入表示30%的在体外分析中使用的翻译DNMT3A。(b条)DNMT3A与组蛋白H4 N端肽的结合Arg3残基未甲基化、对称甲基化或不对称甲基化甲基化。特异结合蛋白用western blot显示SDS-PAGE后的抗DNMT3A抗体。输入代表10%的蜂窝分析中使用的提取物。合成肽的H4R3me2s修饰免疫印迹证实。考马斯染色显示20%（w/v）SDS-PAGE凝胶上的三个肽。(c（c）)肽下拉分析，如中所述b条，带有35S标记片段DNMT3A如示意图所示。数字是指氨基酸。1–354构造包含PWWP模块，但缺少相邻的C端子螺旋动机。1-587结构包含ADD的GATA和PHD域，但缺少相邻的C端螺旋。(d日)肽下拉分析中描述的b条，含纯化GST、GST-DNMT3A（281-424，包含PWWP域）和GST-DNMT3A（479–610，包含ADD域）。特异性结合蛋白通过抗GST的蛋白质印迹显示SDS-PAGE后的抗体。输入代表5%的GST融合蛋白用于分析。合成肽的H4R3me2s修饰由免疫印迹。考马斯染色显示四种肽。

我们将这些发现与检测DNMT3A结合的研究进行了比较PRMT5的截短突变体(补充图4a在线）。在与H4R3me2s肽相比，仅观察到与PRMT5的弱结合含有ADD结构域的突变体（351-912）。绑定到级别与全长蛋白的N末端相比碎片（1-354）。已确认的孤立PWWP和ADD域的分析这些发现(补充图4b).

PRMT5在发育性珠蛋白基因沉默中的作用

确定H4R3me2s标记在人类身上是否明显γ-珠蛋白启动子在初级人类发育特异性模式中的表达我们从脐血和成人骨髓中分离出红系祖细胞。正如预期的那样，编码γ-珠蛋白的基因在脐血与骨髓的Q-RT-PCR比较(补充图。5在线）。ChIP分析显示成人骨髓红细胞γ启动子H4R3me2s标记祖细胞与脐血祖细胞的比较(图5a). 这是伴随着成人γ启动子RNA聚合酶II减少细胞。然后我们检查了PRMT5和NF-E4结合的分布，以及穿过骨髓红细胞β-珠蛋白基因座的H4R3me2s标记使用ChIP分析抗PRMT5、抗NF-E4和抗H4R3me2s的祖细胞抗体(图5b). 我们使用位点控制区（LCR）超敏反应的引物对跨越区域位点（HS1–HS4）、e-珠蛋白、γ-珠蛋白和β-珠蛋白启动子和克γ-基因和A类γ基因。我们检测到高水平的PRMT5、NF-E4和转录不活跃的γ启动子和e启动子处的H4R3me2s，但在这些成体细胞的b启动子处没有。我们还观察到LCR的HS3水平，但其他过敏部位或基因间区域。

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PRMT5在发育性珠蛋白基因沉默中的作用。(一)H4R3me2型通过ChIP测定γ启动子处RNA聚合酶II的富集脐血和成人骨红系祖细胞的染色质组分骨髓。(b条)PRMT5、NF-E4和H4R3me2的本地化用ChIP测定红细胞染色质组分中的β-珠蛋白基因座来自成人骨髓的祖细胞。沉淀的DNA用β-珠蛋白基因座指示区域的特异性引物。HS、，过敏部位；Pro，启动子；G/A公司γ、 基因间区之间克γ-珠蛋白和A类γ-珠蛋白基因。错误条形图显示s.d(c（c）)红系中PRMT5的细胞定位免疫荧光显示脐血和成人骨髓祖细胞用抗PRMT5抗体和DAPI核染色。比例尺，10微米。

进一步研究PRMT5在发育性沉默中的作用γ基因，我们通过脐血和骨髓红系祖细胞的免疫荧光(图5c). PRMT5具有以前的研究表明，在小鼠生殖细胞广泛表观遗传重编程的时间32。我们证明在骨髓祖细胞中，蛋白质主要是核蛋白，而主要定位于脐血祖细胞的细胞质中。这些研究结果表明，PRMT5可能通过另一种机制发挥发育特异性在调节人类基因表达中的作用β-珠蛋白基因座。

讨论

除了它们在影响染色质致密化方面的直接作用外新出现的范式表明，组蛋白的翻译后修饰也作为效应分子的直接靶标。这些效应器（或“读者”）引起下游功能后果，包括（i）染色质结构的重塑或稳定，（ii）进一步介绍通过与“作者”的互动实现翻译后修饰和（iii）其他基因调节作用33我们的研究为这一范式提供了重要的补充通过定义抑制性组蛋白修饰H4R3me2s和DNA甲基化。我们表明DNMT3A在这方面既是读者又是作者通过直接结合H4R3me2s标记并诱导DNA甲基化和基因沉默(图6). 中央这是PRMT5，它建立组蛋白修饰并与之相互作用直接使用DNMT3A。

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PRMT5诱导的基因表达沉默模型。对称二甲基化PRMT5的H4R3诱导DNMT3A的直接结合，导致甲基化相邻CpG二核苷酸和基因沉默。

与其他效应分子一样，DNMT3A以翻译后为靶点通过ADD结构域修饰组蛋白，该结构域包含PHD锌指区域。PHD基序在许多因素中被显示与甲基赖氨酸标记结合，包括H3K4me2和H3K4me3（参考。34–38)，H3K9me3（参考。39)和H3K36me3（参考。40). 最近，RAG2的PHD域被显示与H3K4me3和H3R2me2协同结合41.识别甲基化精氨酸残基的读者组蛋白以前没有被鉴定过，因此a绑定到此标记的读者可用三含都铎结构域的蛋白质已被证明识别a中非组蛋白中富含精氨酸-甘氨酸的基序甲基精氨酸依赖方式42,虽然DNMT3A包含一个郁金香状基序，但该蛋白质区域似乎不参与H4R3me2s相互作用29,43。值得注意的是，它是参与DNMT3A和PRMT5之间的蛋白质相互作用。

先前对鸡β-珠蛋白基因座的研究表明I型精氨酸甲基转移酶PRMT1对H4R3的不对称甲基化是对建立和维持广泛的活性染色质至关重要修改22.拍摄结合我们的发现，这表明精氨酸甲基转移酶可能发挥作用协调和对比在发展调控中的作用β-珠蛋白基因座。除了H4R3me2s标记在γ-启动子，我们还观察到该标记在HS3、建议优先激活人类胚胎和胎儿珠蛋白基因44.这是可以想象的在启动子和HS3上同步建立的协同抑制标记可能干扰LCR-珠蛋白基因的相互作用45,46从而导致位点构象发生实质性变化除了染色质结构的局部修饰外。或者，该复合物可以在LCR启动并在位点上扩散导致基因抑制，很像最近表观遗传学的证明β-珠蛋白簇中作用于远处的修饰物β基因表达的激活47编码γ-珠蛋白的基因沉默出生预示着b-地中海贫血和镰状细胞病的发病寻找能够阻止或逆转这一过程的治疗方法。DNA甲基转移酶抑制剂已用于此目的影响48.候补人员我们正在寻求的方法可能涉及使用PRMT5的特定抑制剂阻断H4R3me2s修饰和后续修饰的甲基转移酶活性DNMT3A和DNA甲基化的招募。

我们的结果为以下两个方面之间已建立的联系提供了重要的扩展抑制组蛋白修饰和DNA甲基化。赖氨酸之间的相互作用甲基转移酶和DNA甲基转移酶16–18,49，甲基CpG–结合蛋白质12和甲基CpG富集区10都有报道。最近，异染色质蛋白1（HP1）已被证明能将甲基化信息从组蛋白转化为DNA水泥基因阻遏50.在此G9a酶在常染色位点诱导抑制性H3K9me2标记，其由HP1读取。绑定的HP1通过针对DNMT1起到适配器的作用这些位点的酶活性，从而增强胞嘧啶甲基化。进一步通过G9a组蛋白之间的直接相互作用实现稳定甲基转移酶和DNMT1（参考。49). 我们的研究结果显示出与该模型的一些相似之处，特别是双重角色PRMT5在建立抑制标记和与DNMT3A结合方面的作用，类似于G9a。然而，DNMT3A对H4R3me2s的招募是直接的，不需要适配器蛋白质的相互作用。因此，它类似于拟南芥其中DNA甲基转移酶CMT3直接招募到抑制组蛋白修饰的位点51值得注意的是，其他DNA甲基转移酶亚单位（例如DNMT3L）不能结合组蛋白肽港湾激活组蛋白标记，如H3K4me31因此，组蛋白修饰，无论是激活还是在自然界中抑制，可以影响阳性或消极的方式。

方法

质谱法

我们从表达NF-E4-在4–20%（w/v）梯度SDS-PAGE凝胶上标记，并用SimplyBlue安全染色剂（Invitrogen）。我们从制备一维凝胶并对其进行电喷雾离子陷阱（ESI-IT）串联质谱（MS/MS）（LCQ-Deca，Finnigan）。

细胞培养和免疫荧光

K562细胞如前所述生长20我们从人脐血中分离出CD34+细胞使用MiniMACS磁性细胞分选系统（Miltenyi Biotec）进行培养在Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）中添加15%（v/v）胎牛血清（FCS），SCF（100 ng/ml−1)，促红细胞生成素（5 U毫升−1)，胰岛素样生长因子-1（IGF-1，40 ng毫升−1)和地塞米松（1μM）诱导红细胞生成分化。我们培养了从新鲜成人骨髓中分离的CD34+细胞（如上所述）在IMDM中补充15%（v/v）FCS、SCF（100 ng毫升−1)，IL-3（10 ng ml−1)和Flt-3配体（500 ng/ml−1)持续7天，然后服用促红细胞生成素（5U毫升−1)单用5d诱导红系分化。CD71和糖蛋白A的细胞表面标记分析表明脐血和骨髓细胞大于90%的红系血统。对于免疫荧光、脐血和骨髓细胞被安装在多聚赖氨酸上并用0.1%（v/v）Triton X-100渗透。我们将幻灯片与小鼠单克隆抗PRMT5抗体在4°C下过夜，清洗并与德克萨斯红结合马抗鼠二级抗体孵育（Vector Laboratories）在室温（25°C）下放置1小时。然后我们洗了载玻片并用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚复染（DAPI）3分钟，然后使用蔡司Axioplan显微镜（蔡司）进行成像。

蛋白质相互作用研究

免疫沉淀、免疫印迹和GST下拉分析如前所述执行52。我们在免疫沉淀：Flag（Sigma-Aldrich）、PRMT5（Abcam）和DNMT1、DNMT3A、，DNMT3B、微管蛋白和GATA-1（圣克鲁斯生物技术）。肽下拉分析如前所述执行31简单地说，我们耦合了2μg COOH端子带有Arg3残基的组蛋白H4的生物素标记20-mer N末端肽非甲基化、对称甲基化或不对称甲基化为链霉亲和素珠，与高浓度K562细胞提取物孵育盐提取（420 mM NaCl）27.我们严格洗脱了特异性结合蛋白洗过的珠子，用抗DNMT3A或抗GST的蛋白印迹法观察SDS-PAGE后的抗体。对于GST蛋白的肽下拉测定肽与GST蛋白的摩尔比为10:1。合成了肽组蛋白序列和生物素部分，N末端乙酰化。

ChIP分析

如前所述进行ChIP分析20。我们进行了免疫沉淀来自具有特异性抗体的K562细胞的染色质组分。无抗体和正常兔IgG作为对照。引物的序列珠蛋白基因座列在补充表1在线。我们使用以下抗体：H4R3me2s和PRMT5（Abcam）、Flag（Sigma-Aldrich）和DNMT3A和RNA聚合酶II（圣克鲁斯生物技术）。我们计算了使用上述方法进行相对富集53.我们计算了百分比相对于输入DNA的ChIP DNA。在所有分析中，其范围为0.35%至0.71%. 最丰富的浓缩物赋值为1，其他所有浓缩物条件被标准化为该值。对于NF-E4和PRMT5 ChIP，32使用循环，对于H4R3me2s ChIP，使用了35个循环。我们表演了每个实验至少独立进行两次。

体外甲基转移酶测定

转染K562细胞的免疫沉淀试验珠使用PRMT5-f或PRMT5Δ-f作为酶源在里面体外如上所述的甲基转移酶检测54，稍作修改。简单地说，我们用10μg纯化组蛋白H2A、H2B、，H3和H4（Roche），或纯化核小体55和的2 mCiS公司-腺苷-我-甲基-三H-蛋氨酸(三H-SAM，Amersham）作为甲基供体，在20μl HMTase缓冲液（25mM NaCl，25mM Tris，pH 8.8），在30摄氏度。蛋白质在14%（w/v）SDS-PAGE凝胶上溶解，用考马斯蓝，然后干燥并进行放射自显影。

亚硫酸氢盐序列分析

亚硫酸氢盐序列分析按所述进行以前56.底漆为了扩增亚硫酸氢盐处理的γ-启动子补充表2在线。我们用HiFi Taq进行PCR聚合酶（罗氏）如下：30个周期，94°C 20 s，55°C20秒，68°C 35秒。我们将PCR产物克隆到pCRII中（Invitrogen），然后使用Big-Dye Termination方法对核苷酸进行测序（应用生物系统）。细胞系之间的差异的意义是使用Fisher精确测试进行计算。

RNA干扰与逆转录病毒感染

PRMT5和DNMT3A的小干扰RNA靶序列为插入到pSUPER.retro中-neo+gfp逆转录病毒载体制造商建议（OligoEngine）。提供了寡核苷酸序列在里面补充表3在线。293T产生逆转录病毒细胞和K562细胞感染按所述进行20。转导的细胞是荧光激活细胞筛选绿色荧光蛋白表达排序（FACS）。

Q-RT-PCR

用Trizol试剂（Invitrogen）从细胞中分离出总RNA。使用反转录系统生成互补DNA（Promega）。Q-RT-PCR引物见补充表4在线。测序证实了扩增带的一致性。我们在Rotorgene 2000（Corbett Research）的最终卷中执行Q-RT-PCR20微升。反应混合物包含1×反应缓冲液，2.5 mM氯化镁2，0.05 mM脱氧核苷酸（罗氏），0.1μM基因特异性引物，1 U Taq聚合酶（Fisher Biotech），1:10000稀释SYBR Green I（分子探针）和2μl样品或标准溶液。循环条件为94°C 15 s，57°C 30 s和72°C 30 s。次黄嘌呤鸟嘌呤的标准曲线磷酸核糖基转移酶（HPRT）、γ-珠蛋白和β-珠蛋白由骨髓和脐血细胞生成。相对数量计算所有单个细胞系的转录物。每个反应都完成了一式两份。

补充材料

1

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致谢

我们感谢S.Pestka（新泽西医学和牙科大学）PRMT5D质粒，R.Gaynor（德克萨斯大学西南分校），用于PRMT5δ质粒和Jane和Cunningham实验室的成员进行了有益的讨论。这项工作得到了国家卫生和医学研究所的资助澳大利亚委员会、美国国立卫生研究院（PO1 HL53749-03和RO1HL69232-01）（S.M.J.），罗氏贫血研究基金会（RoFAR）（S.MJ.）库利贫血基金（Q.Z.），中国自然科学基金#30670422（Q.Z.），癌症中心支持CORE Grant P30 CA 21765，美国-黎巴嫩-叙利亚联合慈善机构（ALSAC）和孟菲斯阿西西基金会（J.M.C.）。

脚注

作者贡献

Q.Z.、G.R.、L.C.和Y.T.T.进行了实验；R.L.M.和R.J.S。进行质谱分析；Q.Z.、G.R.和S.M.J.设计并分析研究；D.J.C.、C.D.A.、H.L.、D.J.P.和J.M.C.提出了一些想法，试剂和讨论；Q.Z.、G.R.和S.M.J.撰写了手稿。

有关补充信息，请访问Nature Structural&分子生物学网站。

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