引言
细胞分化是一个基本的发育过程，由内部或外部刺激触发，导致细胞对其各自的祖细胞具有更高的专门化程度。在分子水平上，细胞转化建立在信号网络上，信号网络通过蛋白质磷酸化和去磷酸化将刺激从细胞表面传递到调节剂，这是细胞网络中信号传输和整合中最重要的翻译后修饰。
单核吞噬细胞系统（MPS）是细胞分化如何产生功能和表型多样性的一个令人印象深刻的例子。MPS细胞的共同来源是位于骨髓中的造血干细胞，它们通过不同的髓系祖细胞中间产物转化为单核细胞，单核细胞进入循环，迁移到组织并最终分化，以补充常驻树突状细胞和巨噬细胞（Geissmann等人。，2010年a). 巨噬细胞在形态学上不同于它们的单核细胞前体，并且其特征在于溶酶体和线粒体含量的升高以及它们对病原体相关分子模式的反应性——在一类微生物中保守的小分子基序（Cohn，1968; 罗斯和奥格，2002). 此外，单核细胞和巨噬细胞都是炎症和先天免疫反应的关键效应器和调节器，例如通过产生生长因子和细胞因子（Geissmann等人。，2010年b). 功能专门化和适应能力的差异程度归因于由细胞信号成分显著共同决定的分子结构。我们假设单核细胞和巨噬细胞的kinomes之间存在主要差异，这对形成功能性细胞特征具有决定性影响。因此，对两种细胞类型的激酶体进行比较分析可以增加我们对信号转导能力的理解，并有助于识别与细胞类型特异性功能相关的激酶。
单核细胞功能和分化分析仍然是一项具有挑战性的任务。单核细胞永久感知环境，并在分离和处理过程中迅速改变表型和行为（Auffray等人。，2009). 此外，单核细胞种群在分化阶段的数量有限和异质性阻碍了他们的分析。为了克服这些缺点，已经建立了一些具有单核细胞特征的人类白血病模型细胞系，这些细胞系代表了相对同质的人群，并且可以很容易地扩大在体外这些细胞系在分化的不同阶段被阻断，但可以通过特定刺激（Auwerx，1991). 人类细胞系THP-1是最常用的单核细胞模型系统之一（Tsuchiya等人。，1980). THP-1细胞可以通过用佛波醇-12-氨基黄嘌呤-13-醋酸盐（PMA）激活蛋白激酶C（PKC）而分化为类似成熟巨噬细胞特性的巨噬细胞样细胞，最终导致细胞粘附增加和增殖活性丧失（Schwende等人。，1996).
最近的几项研究采用了蛋白质组学技术，揭示了与单核细胞向巨噬细胞分化相关的蛋白质组特征的变化。因此，在人类原代单核细胞分化过程中，NF-κB抑制相关蛋白的表达增加，包括超氧化物歧化酶2（SOD2）、钠泵亚单位α-1（ATP1A1）和丝氨酸肽酶抑制剂（SERPINB2），2011). 此外，PMA诱导的U937细胞分化与参与碳水化合物代谢、抗氧化防御和肌动蛋白丝重排的蛋白质的高表达有关（Sintiprungrat等人。，2010). 尽管这些研究揭示了蛋白质组水平上的功能重排，但作为细胞分化驱动力的细胞信号节点（包括激酶和磷酸酶）的代表性不足，因此其对单核细胞和巨噬细胞特性的影响尚不清楚。
在这里，我们应用定量化学蛋白质组学策略对PMA诱导THP-1单核细胞分化后的激肽组进行系统分析。我们揭示了单核细胞分化后的主要激酶重排，并证明巨噬细胞相关激酶MAP3K7/TAK1是涉及细菌杀伤、趋化因子产生和分化过程本身的信号转导的中心枢纽。
材料和方法
细胞培养、SILAC和分化
THP-1单核细胞购自德国微生物和细胞培养物收集中心（DSMZ）。在细胞培养中用氨基酸进行稳定同位素标记（SILAC、Ong等人。，2002,2003)通过在不含L-赖氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酰胺的RPMI 1640中培养细胞（PAA实验室），并以其轻（Lys-0和Arg-0）或重同位素标记形式补充220μM L-赖氨酸和144μM L-精氨酸来实现(13N个2-L-赖氨酸/Lys-8和13N个4-L-精氨酸/Arg-10）（Silantes）、2 mM L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich）、10%热灭活透析胎牛血清（FCS）（Sigma-Aldrich）和抗生素青霉素和链霉素（Biochrom）的浓度分别为100单位/ml和100μg/ml。细胞培养在37°C和5%CO下进行2在潮湿的空气中。细胞培养至少六倍，以确保标记氨基酸的完全结合。为了进行区分，将佛波醇-12-吡啶13-醋酸盐（PMA）（Sigma-Aldrich）添加到最终浓度100 nM。3天后，去除补充了PMA的培养基，用PBS清洗细胞，并在新鲜的无PMA培养基中再放置24小时，以获得巨噬细胞的表型特征（Daigneault等人。，2010).
激酶抑制剂的固定化
如其他地方所述，通过修改制备亲和珠（Bantscheff等人。，2007; Wissing等人。，2007). 使用碳二亚胺化学将激酶抑制剂SU6668（Tocris）、Purvalanol B（Tocrus）和VI16832（Evotec）固定到ECH-Sepharose或EAH-Sepharo（GE）珠。将抑制剂溶解在偶联缓冲液（50/50磷酸钠，pH 7.0/二甲基甲酰胺）中，并根据制造商的建议制备珠。使用N-（3-二甲基氨基丙基）-N-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC，Sigma-Aldrich）作为交联剂，在4°C的偶联缓冲液中交联24 h。用耦合缓冲液广泛清洗珠子，并用乙醇胺封闭24小时。
小分子亲和色谱法（SMAC）制备细胞裂解物和富集蛋白激酶
未分化的THP-1细胞在4°C下离心5 min和130×g，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次。将分化和未分化的THP-1细胞在含有50 mM HEPES pH 7.5、2 M NaCl、1 mM EDTA、1 mM-EGTA、0.5%（v/v）TritonX-100、1 mMPMSF、50 ng/ml calyculin A、10μg/ml leupeptin、10μg/ml抑肽酶、10 mM NaF和2.5 mM Na的缓冲液中溶解三VO（旁白）4细胞裂解物通过冷冻-解冻和超声处理制备。通过在4°C下8700×g离心30 min，然后通过0.45μm醋酸纤维素过滤器（VWR）去除细胞碎片。通过Bradford Assay（BioRad）测定澄清的裂解物的蛋白质浓度。
混合总蛋白含量为50 mg的重SILAC裂解物和轻SILAC水解物，并将其应用于使用重力流柱（Pierce）从500μl含有Purvalanol B和SU6668的50%珠悬浮液制成的亲和柱中，并在旋转器上4°C下培养1 h。收集流经的液体，并将其应用于第二个亲和柱上，该亲和柱由500μl珠悬浮液和固定化VI16832铸成，并进一步培养1 h。用20个柱体积（CV）清洗柱细胞裂解缓冲液，然后用20 CV细胞裂解缓冲溶液清洗，用150 mM NaCl代替最初的1 M NaCl.，最后用20 CV50 mM HEPES清洗，pH值7.5。用20 CV预加热的0.5%（m/v）SDS和5 mM DTT在1 ml组分中洗脱结合蛋白。收集的部分被合并并冷冻干燥。实验在三个独立的生物复制中进行。
蛋白质消化和磷酸肽富集
将冻干材料溶解在水中，然后立即添加4体积的预冷丙酮，并在−20°C下培养过夜。沉淀的蛋白质通过离心（8700×g，30 min）造粒，溶解在变性缓冲液（8 M尿素，20 mM HEPES，pH 8.0）中，在室温下通过添加碘乙酰胺以5 mM的最终浓度进行烷基化20 min。使用预铸三甘氨酸4–15%梯度凝胶（Biorad），通过一维SDS-PAGE将样品分为10个凝胶片。通过凝胶内消化和肽提取获得色氨酸肽。在产生的肽溶液中，10%被真空干燥并储存在−80°C下，直到质谱分析。剩余的90%被真空干燥，肽被溶解在1 ml TiO中2-用于磷酸肽富集的结合缓冲液（73%（v/v）乙腈、10%（v/v）乳酸、2%（v/vTFA）。TiO中的50μl2-储备溶液（30 mg/ml Titansphere TiO2在100%乙腈中的散装材料（GL sciences）），并在室温下孵育20分钟。离心后（1000 x g，3分钟），TiO2-用80%（v/v）乙腈和2%（v/v）TFA洗涤珠子4次。磷酸肽用5%（v/v）NH依次洗脱4OH和30%（v/v）乙腈，真空干燥，溶解在0.1%（v/v）TFA中，并用C18 StageTips（Thermo Scientific）纯化。洗脱的磷脂再次进行真空干燥并储存在−80°C下。
质谱分析
LC-MS/MS分析由EASY-nLCII HPLC系统通过纳米电喷雾离子源直接耦合到LTQ Orbitrap Velos Pro混合质谱仪（Thermo Scientific）进行。将所有冻干（磷酸）肽样品溶解在5%（v/v）乙腈/0.1%（v/v）乙酸中，并应用于20 cm长的内部填充C18（Aeris peptide 3.6μm，孔径100Ω；Phenomenex）分析柱。在46分钟内，以300 nl/min的流速，用二元线性梯度从1%（v/v）乙腈/0.1%（v/v）乙酸到75%（v/v/）乙腈+0.1%（v/v）进行肽洗脱。MS在数据相关模式下运行，每个全MS扫描模式（300 m/z–1700 m/z；分辨率30000）。对于MS/MS扫描，电荷状态为一个或未分配电荷状态的离子被排除在外。在线性离子阱中使用碰撞诱导解离（CID）对AGC目标值为5×10的最强烈的20个离子进行碎片化三离子和35%的归一化碰撞能量，或在Orbitrap质量分析仪中使用目标值为5×10的高能碰撞离解（HCD）对最强烈的10个离子进行分析4离子和40%的归一化碰撞能量。选择用于MS/MS分析的前体离子被动态排除，以进行20秒的重复碎裂。
质谱数据处理
使用MaxQuant软件包（版本1.3.0.5）和集成的Andromeda搜索引擎（Cox等人。，2011). 对照UniProtKB/Swish Prot中保存的包含20252个蛋白质条目的已审查人类蛋白质组（UniProt发布2013_04）对文件进行集体搜索。对于肽和蛋白质的鉴定和定量，使用了以下设置：可变修饰设置为蛋氨酸氧化、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化以及氨基末端乙酰化。将氨基甲酰化设置为固定修饰。最多允许有两个漏劈。对于肽鉴定，线性离子阱和Orbitrap质量分析仪的质量容限分别为0.5 Da和20 ppm。错误发现率（FDR）被设置为0.01。蛋白质定量基于剃刀和独特的肽。蛋白质激酶具有两个独立的肽识别，包括至少一个独特的肽。组合日志2-转换后的SILAC比率取自MaxQuant输出文件，当它们基于至少两个独立重复的值时，被认为是可靠的。在极少数情况下，由于在其他复制品的非刺激或刺激细胞状态中没有信号，因此仅基于一个复制品计算组合SILAC比率，只有当至少一个额外复制品的重/轻强度指示相同的调节方向时，才考虑此比率。根据Manning等人的研究，激酶被分配到各组(2002).
IPA、KEGG途径和GO分析
对于上游调节器分析，在Ingenuity Pathway analysis（IPA）工具（Qiagen）中导入具有相应折叠变化的蛋白激酶，并进行核心通路分析。预测上游调节器第页<0.05和z评分≤-2（非活性）和≥2（活性）被考虑并用于网络生成。
利用DAVID生物信息学资源6.7（Huang da et al。，2009).
免疫印迹法
使用预制的4–15%TRX梯度凝胶（Bio-Rad）通过一维凝胶电泳分离蛋白质，然后转移到PVDF膜（Merck-Millipore）上。使用添加了0.05%（v/v）吐温-20的PBS中5%（m/v）牛奶进行1.5小时的膜封闭。在温和搅拌下，在4°C温度下用一级抗体隔夜探测膜。使用了以下主要抗体：抗c-Abl（abcam#ab16903）、抗LIMK1（CST#3842）、抗ERK1/2（CST#9102）、抗MEK1/2（CST#9122）、抗MEK3（Santa Cruz#sc-961）、抗-MEK4（Santa Cruz#sc-837）、抗CaMK1。使用荧光结合二级抗体（IRDye680RD或IRDye800CW（LI-COR））检测结合的一级抗体，并使用奥德赛红外成像系统（LI-COR）进行荧光读数。
相差显微镜
使用奥林巴斯CKX41荧光显微镜获得相位对比显微照片。
细胞粘附试验
9 × 105每孔未分化的THP-1细胞接种在添加10%FCS（Sigma）的RPMI 1640（Sigma-Aldrich）培养基中的6孔板（TPP）中。用0.25、1或5μM（5Z）-7-恶草烯醇（5Z，Tocris）或二甲基亚砜处理细胞1小时。添加最终浓度为100 nM的PMA，并分别计数细胞培养上清液中的细胞或粘附在细胞培养塑料上的细胞。通过离心收集上清液中的细胞，并将其重新悬浮在RPMI 1640培养基中。将等分样品与台盼蓝溶液（LifeTechnologies）混合，使用自动细胞计数器（Countess，LifeTechnols）测定细胞活力和细胞计数。用5倍浓缩的现成胰蛋白酶溶液（Biochrom）孵育5分钟，分离粘附的细胞。加入RPMI 1640培养基，然后按照上清液中细胞的描述进行细胞采集和计数，以阻止胰蛋白酶化。
种植和加工金黄色葡萄球菌用于感染相关实验
金黄色葡萄球菌HG001（Herbert等人。，2010)在LB中生长到光学密度（OD540)在37°C搅拌下为0.5。将30 ml培养物以8700×g离心5 min，将所得细胞颗粒洗涤两次，最后再悬浮在5×10的RPMI 1640培养基中7细胞/ml。
庆大霉素保护试验
1.8×105THP-1单核细胞接种在24孔板（TPP）中，并如上所述进行分化。金黄色葡萄球菌HG001在添加酚红和10%FCS的条件RPMI 1640培养基中以25倍感染率（MOI）作用于THP-1巨噬细胞样细胞。在不同的感染时间后，取出培养基，用PBS清洗细胞，并通过添加含有100μg/ml庆大霉素（Sigma-Aldrich）和20μg/ml溶血磷脂（Sigma Aldrich。用PBS洗涤细胞两次，然后在PBS中添加1%（v/v）Triton-X100（Roth）进行裂解。将细胞内葡萄球菌涂布在LB琼脂平板上，并在37°C培养24小时后测定菌落形成单位（CFU）。
流式细胞术
9×105分化后的THP-1细胞要么用1μM 5Z一次性处理，要么用载体处理1小时，然后感染表达GFP的等基因突变株金黄色葡萄球菌HG001 pCgfp，MOI为25，持续2 h。随后用PBS清洗细胞两次，并用溶葡萄球菌素和庆大霉素处理10 min，最终浓度分别为20μg/ml和100μg/ml。用PBS洗涤细胞并用胰蛋白酶分离。通过添加添加1%（v/v）FBS的RPMI 1640使消化停止。通过离心将细胞制粒，用PBS洗涤两次，再悬浮在含有1%（v/v）FBS和3.8 mM叠氮化钠的PBS缓冲液中，最后在Attune声聚焦细胞仪（LifeTechnologies）上分析绿色荧光。
热失活触发的分泌型趋化因子的定量金黄色葡萄球菌
9 × 105如上所述，将分化后的THP-1细胞接种在6孔板中。在实验之前，用不含酚红的RPMI 1640交换培养基，并补充1%FCS。在添加热灭活剂之前，用1μM 5Z预处理细胞1小时金黄色葡萄球菌HG001。金黄色葡萄球菌细胞按照上述方法生长和收获。金黄色葡萄球菌细胞在60°C下热失活1 h，并在不含酚红的RPMI 1640中重新悬浮，并补充1%FCS和1μM 5Z或适量DMSO作为对照细胞。金黄色葡萄球菌MOI为25时应用于THP-1细胞。在不同的培养时间后，收集细胞培养上清液，通过0.2μm硝化纤维素过滤器（VWR）并储存在−80°C下。加入热灭活后6小时和48小时后从细胞培养上清液中定量一组选定的趋化因子金黄色葡萄球菌根据制造商的建议，使用定制ELISA阵列试剂盒（Qiagen）进行检测。根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒（Qiagen）分析IL-8、GROa、MIP-1a和MIP-1b的分泌动力学。
结果和讨论
单核细胞到巨噬细胞的分化伴随着激肽组的重大重组、一般激肽组磷酸化状态的增加以及单个激酶基础活化的改变
蛋白激酶介导的细胞信号调节几乎所有细胞功能，显示了这种酶在细胞生理学中的重要作用。尽管它们具有显著的影响，但蛋白激酶通常是低丰度的蛋白质，并且在使用基于质谱的蛋白质组学策略时，需要降低样品复杂性，即激酶富集。图中描述了我们在PMA介导分化为巨噬细胞样状态前后对人类模型细胞系THP-1进行比较性和系统性基因体分析的方法我们使用ATP竞争性小分子蛋白激酶抑制剂Purvalanol B、SU6668和VI16832固定在sepharose珠上，结合细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）进行蛋白激酶家族特异性预富集。以前证明，抑制剂是有效的激酶纯化工具，可结合不同但重叠的蛋白激酶组，从而通过其联合使用广泛覆盖激肽组（Wissing等人。，2007; Daub等人。，2008; Oppermann等人。，2009; Zhang等人。，2013). 此外，最近研究表明，与混合抑制剂珠结合的激酶在很大程度上独立于激酶活性（Ruprecht等人。，2015). 在应用额外的磷酸肽富集后，通过液相色谱-质谱（LC-MS/MS）在蛋白质表达和位点特异性蛋白质磷酸化水平上分析富集的蛋白激酶。
（A）未分化（单核细胞）和分化（巨噬细胞样）THP-1细胞的比较基因体轮廓的实验大纲。细胞被代谢标记（SILAC），并通过添加佛波醇-12-苦味酸13-醋酸盐（PMA）诱导分化，为期3天，然后在无PMA的培养基中休息1天。对细胞进行裂解，并将两个THP-1分化阶段的裂解产物均匀结合。利用宽谱激酶抑制剂SU6668、Purvalanol B和VI16832的小分子亲和色谱（SMAC）用于蛋白激酶纯化。将洗脱的激酶冻干、再水合并用丙酮沉淀。用胰蛋白酶消化凝胶分馏的蛋白质并提取产生的肽。肽被分离，而90%用于TiO2-基于质谱分析之前的磷酸肽富集。其余部分通过质谱直接分析，以量化蛋白激酶。（B）系统发育激酶关系（Manning等人。，2002). 在我们的研究中识别和定量的蛋白激酶分别显示为灰色和黑色圆圈。（C）日志的分配2-定量蛋白激酶与其相应激酶群的SILAC丰度比值。
我们的工作流程从至少两个独立的肽序列中鉴定了199个蛋白激酶（补充表1). 其中，163个激酶符合单核细胞和类巨噬细胞状态之间定量比较的标准（图). 在巨噬细胞样细胞的蛋白质水平上，有20种蛋白激酶增加，而在单核细胞状态下，有60种蛋白激酶的蛋白量显著增加（折变截止值为2.0）。在几乎所有人类蛋白激酶家族组的蛋白影响激酶水平上观察到的变化，包括丝裂原活化蛋白激酶，如MAPK13、MAP2K1、MAP2K3、MAP2 K4、MAP3K7和MAP3K2，钙/钙调蛋白激活蛋白激酶，例如CAMK1、CAMK01、CAMK2A和CAMK2B，以及Src家族激酶（FGR、HCK、Src、YES；图，补充表1). 通过使用独立蛋白质提取物的蛋白质印迹验证了具有不变或差异表达的选定蛋白激酶的SILAC比率（补充图1).
在确定的激酶组中，我们绘制并量化了118个蛋白激酶中的311个磷酸化位点（222个磷酸丝氨酸、55个磷酸苏氨酸和34个磷酸酪氨酸位点）（补充表1). 重要的是，到目前为止，大多数位点只有相对较少的记录，其中修饰是使用位点特异性方法或蛋白质组发现模式质谱法测定的，这表明富集策略提高了质谱法检测修饰激酶衍生肽的灵敏度（Hornbeck等人。，2012). 例如，在非受体酪氨酸激酶Src的Ser212处，我们绘制了一个新的磷酸化位点，位于其SH2域内，表明在与酪氨酸磷酸化Src相互作用物的相互作用中具有潜在的调节作用（图). 当我们采用与差异蛋白表达相同的两倍截止值时，223个磷酸化位点被认为在PMA介导的分化后发生了显著变化。磷酸化的变化表明巨噬细胞样细胞的磷酸化状态总体增加，分化后发现142个磷酸位点增加，而分化后发现81个磷酸位点减少（补充表1).
（A）来自酪氨酸激酶Src的肽的注释性MS/MS谱，跨越氨基酸209-220，在Ser212处磷酸化。（B）Src的蛋白质结构域组织表明pSer212在SH2结构域中的位置。巨噬细胞样细胞与单核细胞THP-1细胞之间Ser212磷酸化水平的差异显示为（相对变化），并归一化为Src蛋白量的变化（绝对变化）。（C）定量磷酸化位点与相应蛋白激酶丰度的相关性。实心对角线表明磷酸化量的变化与相应蛋白激酶量的变化之间存在完美的相关性，即磷酸化的差异仅归因于蛋白质量的变化。虚线表示磷酸化的双重变化（双向），即磷酸化的变化并不完全归因于蛋白质丰度的变化。橙色突出显示的点表示巨噬细胞磷酸化增加，而蓝色点表示单核细胞磷酸化增加。红边点突出与激酶活性诱导有关的激酶磷酸化位点。
为了评估观察到的激酶磷酸化变化是否与激酶表达水平的变化直接相关，我们将245个磷酸位点的基于SILAC的肽磷酸化比率标准化为其相应的蛋白质表达变化（图). 在标准化证明磷酸化程度高于或低于蛋白质表达水平的变化后，超过一半的磷酸化位点仍显示出至少两倍的变化。具体而言，52种激酶中的100个磷酸化位点在巨噬细胞样状态下表现为真正上调，28种激酶中38个磷酸化点在单核细胞THP-1细胞中表现为上调，进一步支持了分化后磷酸化状态升高的总体趋势（补充表1，图). 与PhosphoSitePlus数据库的比较（Hornbeck等人。，2012)揭示了21个受调控的磷酸化位点的潜在功能含义（补充表1). 例如，在巨噬细胞样细胞中，受体酪氨酸激酶RET中磷酸化的Tyr687（17.3倍）招募蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2，从而有助于激活PI3K/AKT途径（Perrinjaquet等人。，2010)FYN（Ser21；9.8倍）、Src（Ser17；2.5倍）、MAPK3（ERK1，pT202；4.6倍）和MAPK1（ERK2，pY187；2.4倍）中的监测位点是激酶活性的直接诱导物（Payne等人。，1991; 施密特和斯托克，2002; Yeo等人。，2011)这表明在细胞分化后，这些激酶、其上游调节剂以及相关下游通路的基础活性增加（图). 这种效应可能与PMA刺激无关，实际上与分化状态相关，因为在分析之前，PMA被去除，细胞在无PMA的培养基中休息1天。
总之，我们的结果表明，单核细胞向巨噬细胞的分化伴随着蛋白激酶表达水平和激酶磷酸化水平的激酶组的重大重排。
识别与单核细胞分化中激肽组变化相关的上游调节因子
为了预测在基因表达水平上切换单核细胞/巨噬细胞激肽组的潜在上游调控因子，我们使用Ingenuity Pathway analysis（IPA）软件对定量蛋白激酶进行了上游调控因子分析。可以强调12个转录上游调节器，它们具有部分相互调节和重叠的下游靶点，可能在分化过程中起关键作用(第页≤0.05，数字). 其中，8个被预测为激活（z评分≥2），4个被抑制（z评分≤-2）。自然，在顶级活性调节因子中发现PMA被用作THP-1细胞分化的触发因子，与许多蛋白激酶（包括MAP2K1、IRAK1、SRC和CDK1）数量的增加直接相关。在转录因子组中，MYC和TBX2被预测为受抑制，与指定的激酶耗竭重叠，如AURKA、AURKB、PLK1和CDK1。此外，转录调节因子TP53（p53）被认为是活性的，并被预测参与激酶的转录调节，包括DYRK1A的抑制（Zhang等人。，2011年b)，WEE1（Lezina等人。，2013)，PKC-α（Zhan等人。，2005)和SGK1的诱导（You等人。，2004). 然而，由于到目前为止尚未证明THP-1细胞表达功能性p53（Sugimoto等人。，1992; 杜兰·布斯比斯和雷斯曼，2002)这一发现可能预示着具有类似于p53的靶基因模式的转录调节器的激活。最后，发现在THP-1分化过程中三种调节性微RNA的潜在重要意义，即mir-124-3p、mir-15和let-7，后两种参与抑制一些细胞周期相关激酶的转录，包括CHECK1、CDK6、AURKA和AURKB。
（A）预测上游调节因子与激酶表达变化有关。条形图包括激活z-score和第页-从IPA导出的值。Z分数≤-2表示不活动（绿色区域），而Z分数≥2表示活动调节器（红色区域）。（B）IPA预测的上游调节网络。外圈由定量的蛋白激酶组成，这些蛋白激酶根据其相应的SILAC比率进行颜色编码。内圈由可能参与调节激酶表达的上游调控因子组成。上游调节器根据（A）进行着色。实线表示直接分子相互作用，而虚线表示间接分子相互作用。橙色、蓝色、灰色和紫色线条的着色表明上游调节器与下游蛋白激酶的预测关系分别为激活、失活、无预测以及与下游分子状态不一致。
大多数建议的转录调节因子在THP-1细胞分化的全球转录组研究中没有得到强调（Consortium等人。，2009)这表明激酶编码基因可能具有更显著的相关性，应在未来的研究中进一步研究。然而，例如，MYC和p53在癌症中经常被解除调控，THP-1细胞来源于急性单核细胞白血病患者（Tsuchiya等人。，1980). 因此，必须小心地将结果转换为原始人类单核细胞。此外，除转录外，蛋白质合成速率最近被确定为THP-1细胞分化过程中全球蛋白质表达变化的额外主要驱动因素（Kristensen等人。，2013).
THP-1巨噬细胞以与钙/钙调蛋白信号和肌动蛋白动力学相关的激酶为特征
巨噬细胞状态下蛋白激酶的增加表明这些激酶在调节巨噬细胞特异性分化和功能方面发挥着重要作用，并且是相关细胞内信号通路和下游效应的预测因子。我们在前15种蛋白激酶中确定了LIMK1、TNIK、MERTK、FGR、ACVR1和STK10，它们在巨噬细胞和单核细胞中的蛋白质比率最高（补充图1). 值得注意的是，大多数激酶在肌动蛋白动力学的信号通路中共同具有功能意义。LIMK1是肌动蛋白结合因子cofilin和destrin的调节激酶。肌动蛋白解聚因子（ADF）/cofilin蛋白家族对于细胞运动或包括吞噬作用在内的其他过程中肌动蛋白细胞骨架的动态变化至关重要（Arber等人。，1998; Amano等人。，2001; Bierne等人。，2001; 松井等人。，2002). TRAF2和NCK相互作用蛋白激酶TNIK调节c-Jun N末端激酶途径，该途径是Wnt靶基因的一种必要和特异的激活剂，并调节肌动蛋白重排和细胞扩散（Fu等人。，1999; Taira等人。，2004; Mahmoudi等人。，2009). 酪氨酸激酶Mer属于TAM-Tyro3、Axl、，和Mer受体，其与它们的配体Gas6和蛋白S一起对于凋亡细胞和碎片的有效吞噬是必需的。，2001; Rothlin等人。，2007). STK10/LOK最近被证明可以在淋巴细胞中共同定位和磷酸化ERM（ezrin-radixin-moesin）蛋白，使肌动蛋白丝与质膜交联，因此在调节细胞形状和迁移方面很重要（Belkina等人。，2009). 除了观察到的蛋白质表达增加外，上述激酶中的几个磷酸化位点显示出独立于蛋白质表达变化的调节（补充表1). 虽然在TNIK和Fgr中发现了一个上调位点，但发现STK10有四个上调位点和三个下调位点。然而，到目前为止，上游激酶或这些位点在激酶功能中的意义尚不清楚。
总的来说，所鉴定的激酶表明巨噬细胞中肌动蛋白细胞骨架的调节能力增强，这在控制免疫反应中很重要，包括运动性和趋化性、吞噬作用和抗原提呈（May和Machesky，2001; Van Haastert和Devreotes，2004; 斯特拉达尔等人。，2006). 严重免疫缺陷与影响巨噬细胞细胞骨架动力学的突变有关，许多感染巨噬细胞的病原体操纵肌动蛋白重塑以支持其细胞内生活方式（Linder等人。，2000; Krachler等人。，2011; 罗伊等人。，2014).
为了扩展我们的研究，我们通过执行生物信息富集分析（包括基因本体（GO）分类和京都基因和基因组百科全书（KEGG）路径分析）来评估巨噬细胞特异性激酶组（Dennis等人。，2003; 补充表2). 这种方法自然地揭示了激酶在单个GO分子功能、生物过程和KEGG途径中的过度表达。因此，我们意识到蛋白激酶的显著富集（Benjamini-Hochberg校正第页≤0.001），与钙调素依赖性蛋白激酶活性（GO:0004683）以及Toll样受体和相关MAPK信号传导（GO:0000165，hsa04620）相关。我们的数据集与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶活性的相关性是由于当巨噬细胞样状态与单核细胞前体相比时，CAMK1（3.3倍）、CAMKK1（2.8倍）和CAMK2A/2B（4.9倍/7.3倍）的表达增加。此外，在钙调素依赖性蛋白激酶的变化中检测到几个磷酸化位点（补充表2). 有趣的是，CAMKK2表达减少，在Ser495和Ser511处磷酸化上调（4.8倍和4.0倍），表明上游磷酸化活性增加，后者可能由死亡相关蛋白激酶（DAPK）引起（Schumacher等人。，2004). 钙/钙调素依赖性蛋白激酶级联的成分CAMK在多种细胞功能中起作用，包括调节转录激活物、细胞周期、激素生成、细胞分化、肌动蛋白丝组织和神经突起生长。在巨噬细胞中，CAMK1最近被证明是对败血症的炎症反应的组成部分（Zhang等人。，2011年a)CAMK2通过调节吞噬体成熟在抗菌活性中发挥作用（Malik等人。，2001)并参与NLRP3炎性体的激活，导致细胞因子的产生和免疫系统的激活（Okada等人。，2014). 在Toll样受体信号中观察到的激酶过度表达主要基于MAPK级联激酶[例如，MAPK13（12.5倍）、MAP3K7（3.3倍）、MAP2K4（2.6倍）和MAP3K2（2.3倍）]，反映了它们在将病原体相关信号转导给巨噬细胞充分免疫反应中的重要作用。然而，MAPK信号相关激酶被许多其他途径共享。有趣的是，虽然TLR-信号白细胞介素1受体相关激酶IRAK 1和4的必要上游激酶低于我们的两倍显著性临界值，但巨噬细胞样细胞中的负调控因子IRAK3减少了4.7倍。
THP-1单核细胞显示与细胞周期和DNA修复相关的激酶表达增加
然后，我们讨论了在单核细胞状态下，即在THP-1细胞的PMA治疗之前，哪些激酶的蛋白质水平较高。单核细胞相关激酶组的功能注释分析显示，激酶在生物过程和与细胞周期依赖性蛋白激酶活性、细胞周期、MAP激酶和镁离子结合相关的分子功能中过度表达（补充表2，图). 这意味着在单核细胞状态下控制相应的信号通路时对蛋白激酶有明显的需求。事实上，终末分化巨噬细胞增殖活性的丧失是THP-1分化的标志（Auwerx，1991). 在我们的研究中，单核细胞到巨噬细胞的分化伴随着参与不同细胞周期阶段的进入和进展的关键调节激酶的丰度显著降低，包括细胞周期依赖激酶CDK1、CDK2、CDK6、AURKA、AURKB、，和PLK1以及检查点激酶CHEK1和CHEK2（补充表1，数字). 除了细胞周期相关激酶外，在单核细胞状态下发现了几种参与DNA修复机制调节的激酶的量显著更高，其中包括细胞周期蛋白依赖性激酶CDK9以及DNA依赖性蛋白激酶催化亚基PRKDC（Yu et al。，2010; Jiang等人。，2015). 在细胞周期和DNA修复相关激酶[CDK2 Tyr15和Thr160（分别下降5.5倍和3.1倍）、CDK9 Ser464（2.5倍）、CHEK1 Ser286（2.2倍）和CDK1 Tyr15-（2.1倍）]中发现了几个具有已知功能意义的磷脂酶，这些磷脂酶主要在酶活性中受到调节。例如，CDK2中Thr160的磷酸化对于诱导激酶活性至关重要，该激酶活性在分别与细胞周期蛋白e和细胞周期蛋白A结合后促进G1/S过渡和S期进展（Girard等人。，1991; Gu等人。，1992; Ohtsubo等人。，1995).
（A）在THP-1巨噬细胞或单核细胞中富集的蛋白激酶的选择性显著富集GO项或KEGG途径。横线表示Benjamini-Hochberg修正第页-值≤0.001（虚线）。表示的数字表示分配给相应术语或通路的蛋白激酶的数量。蛋白激酶名称显示在右侧，并根据其与巨噬细胞（橙色）或单核细胞（蓝色）状态的关系进行着色。（B）细胞周期与细胞周期进展和有丝分裂所需的重要蛋白激酶的示意图。数字表示确定的日志2-具有调节功能的蛋白激酶和磷酸化位点的SILAC比率。
我们的数据表明，与单核细胞前体相比，PMA触发的THP-1单核细胞分化后的增殖停止涉及巨噬细胞样细胞中细胞周期控制激酶的耗竭。巨噬细胞中相对磷酸化水平的降低还表明上游信号下调，这可能会促进增殖停滞。由于THP-1细胞来源于急性单核细胞白血病患者（Tsuchiya等人。，1980)细胞周期和DNA修复相关蛋白激酶的表达增加很可能与其致癌特征有关。
与巨噬细胞样特征性激酶组类似，我们再次观察到单核细胞状态下MAP信号级联激酶的过度表达，这是基于包括TAOK3和MAP3K1在内的该组不同成员的较高蛋白水平。
THP-1分化导致MAPK信号网络重新布线
不同组MAP激酶和上游MAPK激酶的明显过度表达促使我们进行更详细的检查。值得注意的是，我们的方法鉴定出至少30种与MAP激酶信号级联直接相关的激酶，许多激酶在THP-1单核细胞和巨噬细胞中的表达量不同（图). 如此大量的MAP激酶及其相关物的蛋白质水平差异表明了该网络在单核细胞/巨噬细胞分化和功能中的关键地位。两种MAP激酶、两种MAP-激酶激活蛋白激酶（MAPKAPKs）以及11种上游MAP激酶（跨越MAP4Ks、MAP3Ks和MAP2Ks）的蛋白质量差异至少为两倍。后者通过IkappaB激酶磷酸化参与MAPK的激活，包括ERK、p38alpha和JNK或NF-kappaB-信号传导（Matsuda等人。，1992; Yang等人。，1997; Wang等人。，2002). MAPKs MAPK3/ERK1和MAPK1/ERK2、MAPK8/JNK1、MAPK9/JNK2以及MAPK14/p38alpha的蛋白量相等，事实上，在巨噬细胞样细胞中仅发现MAPK13/p38delta的蛋白量大约高出12倍，而在单核细胞THP-1细胞中ERK5增加了6.1倍（图，补充表1). 然而，相应的磷酸化特征表明ERK1/2的基础活性增加（见上文），但巨噬细胞中ERK活化核糖体s6激酶（RSKs）的活性也增加（图). 除了几个表达水平增加的上游MAPK激酶（GCK、MEKK1、TAOK1/2/3、PAK4、ERK5）外，在未刺激的单核细胞中发现有丝分裂原和应激激活蛋白激酶MSK1和2的水平明显较高，表明其在单核细胞状态中的作用更为显著。
MAP激酶网络，具有确定的蛋白激酶（椭圆）或磷酸化位点（附加点）.日志2-巨噬细胞样和单核细胞THP-1细胞的SILAC比率作为配色方案提供。具有已知功能含义的磷酸化位点用红色边框突出显示。行表示从文献和在线资源中获得的激酶-底物关系。
我们的结果表明，巨噬细胞与其单核祖细胞的分化伴随着MAPK信号级联的广泛重组。显然，MAP信号传导不是通过严格分离的激酶级联从一个细胞表面受体到特定反应元件的单向连接来组织的，而是通过重叠的枢纽形成高度互联的网络。例如，p38α相关信号与下游MSK1/2在THP-1单核细胞中似乎更为普遍，而ERK/RSK介导的信号可能与巨噬细胞样细胞状态更为相关。RSK是多功能ERK效应器，通过多种底物的协同调节，包括转录因子FOS（Hauge和Frodin，2006). 另一方面，MSK主要因其通过磷酸化转录因子如CREB（Hauge和Frodin，2006). 与我们的激酶数据一致，在THP-1分化后，FOS和CREB活性分别增加和减少（Consortium等人。，2009). 因此，我们的数据为如何在分化后实现适应表型和改变信号反应提供了新的思路，除了改变细胞表面受体或转录因子的表达外，还可以通过微调中间信号节点的表达和/或激活来实现。
MAP3K7（TAK1）是细菌杀伤、趋化因子产生和分化活性的中心信号枢纽
由于PMA诱导的从单核细胞向巨噬细胞状态的转变，与MAPK信号网络相关的几种激酶，包括MAP3K2和7、MAP2K1,3和4以及MAPK13增加了两倍以上。根据蛋白激酶MAP2K3/4和MAPK13的上游激活位置以及通过药物干预抑制TAK1活性的可能性，我们选择了蛋白激酶MAP3K7（转化生长因子β活化激酶，TAK1）进行功能分析。TAK1的激活由多种刺激物触发，包括细胞因子以及Toll样、B细胞和T细胞受体的配体，以及NF-κB和MAPK信号通路的一个关键信号成分，发挥细胞类型特异性功能（Ninomiya-Tsuji等人。，1999; Wang等人。，2001; Wan等人。，2006; Schuman等人。，2009).
根据我们的运动组数据，我们得出结论，TAK1在巨噬细胞样细胞中更为活跃，下游靶点MAPK1/3的磷酸化增加表明了这一点。此外，MAPK1/3（pT202/pY204）和额外下游靶点MAPK14（p38alpha；pT180pY182）和HDAC4在S264的磷酸化（Dequiedt等人。，2006)短期内，当TAK1活性被TAK1选择性抑制剂（5Z）-7-氧代烯醇（5Z。，2003; 图).
（A）TAK1的已知下游靶标的蛋白质印迹分析。用1μM 5Z或载体处理THP-1单核细胞1小时，然后用PMA刺激指定的时间段。（B）回收菌落形成单位（CFU）的百分比金黄色葡萄球菌经1μM 5Z预处理的感染THP-1细胞归一化为未经处理的THP-1。数据表示为平均值±S.D(n个= 3).（C）感染后，未感染对照的细胞培养上清液中存在的THP-1细胞计数金黄色葡萄球菌用1μM 5Z预处理或不预处理，以及用1μM5Z预治疗的未感染对照。数据表示为平均值±S.D(n个= 3).（D）感染表达GFP的PMA分化贴壁THP-1细胞的荧光分布金黄色葡萄球菌流式细胞术分析未感染对照细胞和用1μM 5Z预处理或不预处理的对照细胞。（E）与热失活的相互作用后基于ELISA的分泌型趋化因子IL-8、MIP-1a、MIP-1β和GROa的定量金黄色葡萄球菌用1μM 5Z预处理或不与对照THP-1细胞进行比较。（F）经或不经1μM 5Z预处理的PMA刺激后3天THP-1细胞的显微照片。（G）在不存在和存在不同浓度5Z的情况下，PMA治疗后72小时内监测细胞培养上清液部分（上图）或粘附部分（下图）中THP-1细胞的细胞计数。数据表示为平均值±S.D(n个= 3). 采用双向方差分析和Bonferroni事后检验进行方差统计分析。*第页< 0.05,**第页< 0.01,****第页< 0.0001.
为了探讨TAK1在巨噬细胞相关功能调节中的作用，我们用5Z一次性处理抑制分化的THP-1细胞中的TAK1，并筛选其对细菌杀灭效果和趋化因子产生的影响。首先，我们进行了庆大霉素保护试验，以比较在TAK1活性受到抑制和未受到抑制的情况下，从感染的THP-1巨噬细胞中回收的葡萄球菌数量。感染后已经15分钟，提取的肺活量显著减少金黄色葡萄球菌来自TAK1抑制的THP-1巨噬细胞的集落形成单位变得明显（图). 在感染过程中，存活细菌数量减少，在感染后105分钟达到40%的最大值，这一发现变得非常显著。考虑到金黄色葡萄球菌仅从附着的THP-1细胞中检测细胞，我们对感染实验上清液中存在的THP-2细胞进行计数，以排除观察到的细胞内的强烈下降金黄色葡萄球菌是由于TAK1抑制介导的巨噬细胞从细胞培养表面脱落的增加（图). 与未受TAK1抑制的巨噬细胞相比，TAK1的抑制并未导致悬浮液中细胞数量的显著差异。此外，GFP表达的流式细胞术分析金黄色葡萄球菌显示了与TAK1抑制无关的可比细菌负荷（图)表明THP-1巨噬细胞内化细菌的效率未被TAK1活性改变。总的来说，感染检测结果表明TAK1信号与吞噬细胞杀死细胞内微生物之间存在关键联系。
接下来，为了表征TAK1活性在巨噬细胞趋化因子生成中的重要性，我们预先筛选了12种趋化因子与热失活的相互作用后的分泌金黄色葡萄球菌使用ELISA（补充图2). 对于七种趋化因子，我们能够检测到有意义的信号。而TGF-β和MDC在对照细胞和金黄色葡萄球菌-有和没有5Z的细胞经处理后，RANTES对热失活的反应表现出明显的高分泌金黄色葡萄球菌但在伴随TAK1抑制的情况下没有减少。相反，我们观察到TAK1依赖的IL-8、MIP-1A、MIP-1B和GROa分泌，这导致我们研究其分泌动力学（图). 令人惊讶的是，TAK1活性的抑制抑制了所有四种趋化因子的分泌，以响应金黄色葡萄球菌因此，结果表明TAK1在巨噬细胞与金黄色葡萄球菌.
最近已经证明TAK1对于破骨细胞分化是必需的（Lamothe等人。，2013). 最后，我们问TAK1是否与THP-1背景中巨噬细胞的分化有关。为此，在用PMA刺激单核细胞THP-1细胞之前，用5Z一次性处理，并监测分化指标，包括粘附表面和形成特征形态特征的能力。5Z对THP-1单核细胞中TAK1活性的抑制阻止了典型的细胞伸长和伪足的形成（图)，显著降低了PMA刺激后细胞对细胞培养材料表面的粘附效率（图)并废除了PMA诱导的细胞增殖停滞（补充图三). 另一方面，TAK1抑制不会改变细胞活力（补充图三).
综上所述，所获得的结果强调了TAK1是参与巨噬细胞相关细菌杀伤和病原诱导趋化因子产生以及巨噬细胞样表型发展的中央信号枢纽。其作为中枢信号成分的特性很可能是通过其在ERK、JNK、p38和NF-kappaB信号通路下游激活中的众所周知的作用介导的（Tang等人。，2008; 拉莫特等人。，2012; Mihaly等人。，2014). 所观察到的防止PMA诱导TAK1下游直接和间接靶点磷酸化以及5Z存在时伴随的分化缺陷暗示了TAK1和PKC的功能合作，因为PMA是PKC活性的诱导剂，对PMA触发的THP-1分化至关重要（Bazzi和Nelsestuen，1989; Schwende等人。，1996). 在淋巴细胞中描述了TAK1的PKC依赖性激活途径。B细胞或T细胞受体刺激诱导蛋白激酶C亚型的激活，从而导致CARD11/CARMA1的磷酸化。CARD11/CARMA1、BCL10和MALT1的复合物随后与TRAF6泛素连接酶相互作用，后者反过来通过其结合伙伴TAB1、TAB2或TAB3组成的TAK1蛋白激酶复合物的多泛素化激活TAK1（Sato等人。，2005; Sommer等人。，2005; Schuman等人。，2009).
我们还证明了人类病原体对趋化因子的刺激金黄色葡萄球菌依赖TAK1活动。我们的结果表明，TAK1通过识别金黄色葡萄球菌-相关分子模式。与PMA不同，TLR通过MyD88和IRAK1和IRAK4的招募激活TAK1，进而激活TRAF6泛素连接酶导致TAK1激活（Shim等人。，2005). TLR2已被证明是识别金黄色葡萄球菌（岩崎等人。，2002)表明TAK1激活的直接作用。然而，这尚未得到实验证明。最终，TAK1抑制使细胞内的金黄色葡萄球菌。这表明亚细胞变化会增加杀菌活性，并可能影响活性氧（ROS），如过氧化氢。最近在包括小鼠角质形成细胞和肠上皮以及髓系细胞在内的不同模型中证实了ROS在非功能性TAK1背景中的积累（Omori等人。，2008,2012; Wang等人。，2015). 到目前为止，尚不能证明TAK1抑制的THP-1巨噬细胞吞噬体内ROS水平升高。从我们的实验设置中，不能排除TAK1在受刺激单核细胞中发挥类似作用。此外，由于TAK1处于多种信号通路的十字路口，吞噬体成熟或清除的其他过程可能会受到影响，需要在未来研究中考虑TAK1信号在吞噬微生物破坏中的具体作用。最后，尽管5Z是一种高效的TAK1抑制剂，并且对MAP3K途径中的一组其他激酶具有选择性，但不能完全排除非靶点（Kilty等人。，2013).
